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菲恩生物预吸附二抗实验原理
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
对于经常进行抗体检测工作的人来说，非特异性结合和背景着色常常是一大困扰，某些情况下二抗存在交叉反应是主要原因。 二抗，即第二抗体，是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗的制备一般是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。因此二抗实际上也是多抗，本身的特性决定了其大概率会存在交叉反应。 针对这一问题，我们可以在制备二抗时添加一步预吸附的纯化步骤，以提高抗体的特异性。基本原理是将二抗流经固定有潜在交叉反应的物种的血清蛋白的基质柱，有非特异性结合的二抗会留在柱中，而特异性高的二抗将通过基质柱。 经过预吸附处理的二抗能有效降低非特异性背景，尤其在多重染色实验和样本中内源性免疫球蛋白(Igs)含量高的IHC实验时效果更好。 多重染色实验时，由于同时使用多个一抗和对应的二抗，每种二抗有和其他一抗之间交叉反应的风险。例如同时使用兔抗和小鼠抗进行双染实验时，应使用针对小鼠血清预吸附的抗兔二抗，和针对兔血清预吸附的抗小鼠二抗。 而IHC实验中如果所用样本中内源性免疫球蛋白(Igs)含量高，二抗也有与样本本身免疫球蛋白交叉反应的风险。如对人组织样本进行染色时，应使用对人血清预吸附的HRP二抗。 菲恩生物提供的抗体种类广泛，涵盖了肿瘤、神经生物学、肝细胞、信号传道、表观遗传学、心血管生物学、免疫学、代谢、细胞生物学等研究领域，还包括单克隆抗体、多克隆抗体、标记的抗体和未标记的抗体。其中多克隆抗体是经过抗原亲和纯化的特异性IgG。菲恩生物提供10，000多种抗体产品,可用于大多数动物物种。
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细胞因子的原理与应用
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
原理 为了维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，防止肿瘤发生，机体的许多细胞，特别是免疫细胞合成和分泌许多种微量的多肽类因子。它们在细胞之间传递信息，调节细胞的生理过程，提高机体的免疫力，在异常情况下也有可能引起发烧、炎症、休克等病理过程。这样一大类因子已发现的有上百种，统称为细胞因子，包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核细胞产生的单核因子、各种生长因子等。许多细胞因子是根据它们的功能命名的，如白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、红细胞生成素(EPO)等。 作用 细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。细胞因子与其受体集合后启动复杂的细胞内分子间的相互作用，最终引起细胞基因转录的变化。 参与免疫应答与免疫调节，调节固有免疫和适应性免疫应答;刺激造血功能;刺激细胞活化、增殖和分化;诱导或抑制细胞毒作用，诱导其凋亡。细胞因子的作用方式:1.自分泌作用。2.旁分泌作用。3.内分泌作用。 细胞因子的作用特点:多效性、重叠性、协同性、拮抗性和双重性。 细胞因子研究具有非常重要的理论和实用意义，它有助于阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和**，特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于**肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好疗效，具有非常广阔的应用前景。 细胞因子正逐渐作为佐剂用于疫苗的研制，如白介素-2、IL-12等。
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八仙过海，各显神通-G-Bioscience Focus系列抽提试剂盒
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
蛋白样本制备的目标简言之“三高”，保留活性高，回收产量高，工作效率高。“三高”是苦中作乐的说法，说的轻松，这头一条“保留活性高”便是蛋白样品制备的痛中之痛----样品制备过程导致的蛋白变性和随后的复性工作是很令人头痛的问题。这些年来以G Biosciences为代表的以蛋白质研究为核心研发的公司开发了一系列蛋白抽提试剂，大大简化了样品制备工作的烦恼，更重要的是保证实验结果的可重复性。 八仙过海，各显神通-Focus系列抽提试剂盒，让你的抽提不再是事儿！ 针对各种常见样本的抽提，G Biosciences旗下的Focus系列抽提试剂盒可谓是八仙过海，为你带来了是蛋白质样本抽提综合解决方案。如果你的目的是研究蛋白质特性，把时间都耗在纯化过程中那太费时间，看准目标，蛋白纯化也可以连同初步纯化一步到位。这类试剂盒通常在裂解细胞的同时利用某些共性初步分离蛋白质，令产品分段收集，使得在后继的电泳分析中减少背景蛋白的复杂程度，提高蛋白电泳分辨率。下面让我们对这些“神通”一一进行解析。 各显神通之第一式-哺乳动物蛋白质组抽提 FOCUS™ 哺乳动物蛋白质组抽提试剂盒-从哺乳动物样本中抽提和溶解几乎所有的蛋白，包括膜蛋白和可溶性蛋白，通过一个强烈的离液剂抽提缓冲液来溶解甚至最难溶解的蛋白。适用于哺乳动物组织和贴壁&悬浮细胞等生物样本。它可以一步提取实验步骤，同时提供有一个强烈的离液剂抽提缓冲液，用于50X100mg动物组织或50微升湿细胞团样本制备应用，从哺乳动物组织和细胞中提取总蛋白，适用于样本制备用于2D凝胶电泳和其他应用。 各显神通之第二式-蛋白质组分级分离 FOCUS™蛋白质组分级分离试剂盒-用来将复杂的生物样本分级分离为胞质蛋白和膜蛋白。最终得到的膜蛋白随后分级分离成周边蛋白和膜内嵌蛋白或脂筏相关的蛋白和去污剂溶解的膜蛋白。该试剂盒可以进行大于50次的实验，它的“法力”包括：用于分级分离内嵌蛋白，周边蛋白以及脂筏相关蛋白的组分，分级分离复杂的蛋
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蛋白样品制备详解—概念篇
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
蛋白样品制备是许多实验重要的第一步，蛋白样品由于其结构特性各异，又必须使其完全溶解和尽可能少的化学修饰，所以不可能有一个通用的技术，只能通过大量的实验来积累经验。正如开篇所引用的两句话中包含的深意：在研究蛋白的过程中，既需要严谨的技术流程，规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性，也需要将其看成是独特而奇妙的个体，结合以往经验但又不拘泥于经验，才能真正揭开她神秘的面纱。2012年让我们一起来回顾一下这一重要技术及值得关注的产品。 1.为什么要进行样品制备 “为什么要进行样品制备？电泳的目的不就是分离吗？”刚接触双向电泳的小菜鸟有可能就会这么问。这个问题很好回答，这是由于目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上，因此样品的预分离制备是必须的。另外比如像对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记的蛋白质组学研究目的，由于临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型，因此需要进行有效的样品制备。 但是为什么要进行不同步骤的样品制备呢？这不仅仅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法来配合，而且在制备样品的时候，首先需要明确的是什么是实验的最终目的：是分离尽可能多的蛋白还是分离样品中某些感兴趣的蛋白，这些直接决定了你的制备方法，也决定了实验的成功与否。由于想要分离的蛋白必须是完全溶解的，溶解的效果取决于裂解、破碎、沉淀、溶解的过程以及去污剂的选择和各种溶液的组成，因此如果是只对样品中的一部分蛋白感兴趣，可采取预分离的方法，如欲分析的蛋白来自细胞器（细胞核、线粒体和原生质膜），则应先采取超速离心或其他方法将细胞器分离出来再溶解蛋白；如
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蛋白样品制备详解—蛋白质保护篇
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
蛋白质是成分高度复杂的，复杂的生物大分子包括1个或多个长链氨基酸. 蛋白或肽折叠形成二级和三级结构， 和其他蛋白亚基相互作用来形成四级结构。蛋白是在结构上彼此不同的同时出于稳定性和活性的目的要求不同的周边环境. 蛋白当脱离他们天然的环境后是非常容易降解，变性和沉淀的。 在蛋白抽提过程中，细胞和细胞器膜是被破坏掉从而释放蛋白到溶液中使蛋白高度不稳定. 蛋白是暴露在溶液中不同的PH值，离子强度，温度和蛋白酶中. 尽管所有的蛋白是不同的他们要求不同的参数比如稳定性，溶解性和活性, 然而一些因素如果处理好的话可以保证活性蛋白的抽提，能够在蛋白抽提过程中保护蛋白的组分或者因素如下: 缓冲液组分: 在蛋白抽提过程中为蛋白提供适宜的缓冲液环境是非常重要的，这样蛋白可以应付突然变化的PH值。如果蛋白抽提裂解缓冲液不是蛋白适宜的缓冲液蛋白会很容易发生不可逆的变性。 一个好的蛋白抽提缓冲液必须在要求的PH值下有很强的缓冲能力，水溶性，化学稳定性，和加到蛋白抽提溶液中的其他添加物的兼容性，以及蛋白下游应用的兼容性。 大部分常规使用的生物缓冲液有 pKa 大约 7因此可以用于生理PH值下。 常用的生物缓冲液的是磷酸盐，Tris, MOPS 和HEPES. 这些缓冲液通常使用在 20 mM浓度以上来保证足够的缓冲能力. 抽提时的温度: 来自于哺乳动物细胞的蛋白适合于他们活性的温度大约 37 °C以及许多来自于生长在37°C细菌的细菌蛋白也有蛋白稳定性的最适温度在37°C。鉴于此，我们可以预计成功的蛋白抽提在室温进行。然而溶液中的蛋白在室温中会发生降解因为溶液中蛋白的环境和细胞中的环境是不同的。溶液中蛋白没有受到如同细胞中伴侣的保护。除此之外蛋白由于存在于溶液中的内源蛋白酶从而容易发生降解。细胞中的内源蛋白酶在细胞中存在特定的小室中因此不能降解所有的细胞蛋白。蛋白酶的活性在 4°C 时会减弱通常来说蛋白的抽提应该在冰上进行从而得到活性蛋白。 细胞裂解和蛋白抽提缓冲液的
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单链建库技术之革新产品,Swift RNA建库试剂盒
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
Swift 拥有的Adaptase技术，可以同时进行单链DNA的加尾和接头连接反应。高效率的Adaptase反应，允许起始量低至单个细胞。不依赖模板的化学反应，提供碱基偏好性的全面覆盖文库。该技术已经应用到多种Swift文库构建试剂盒中，包括Swift标准RNA建库试剂盒和快速RNA建库试剂盒。 两款建库试剂盒均能接受较为宽泛的样本起始量，产出优秀的测序数据，深化、加速您的RNA-seq研究。试剂盒借助Adpatase技术，利用第一链cDNA模版，可以构建链特异性RNA文库，无需常规的第二链cDNA合成。 Swift RNA-Seq Workflow Swift Rapid RNA-Seq Workflow 标准建库试剂盒支持低至100pg mRNA或10ng总RNA。对于低起始量和困难样本，试剂盒均可以保持高质量、高稳定性表现。快速建库试剂盒只需要3.5个小时，便能完成建库，相比较同类产品，为市面上最快。非常简单的工作流程，以最少数量的试剂组分和纯化步骤，节省您的时间和精力。 两款建库试剂盒均可搭配使用 Normalase，简化上机测序前文库均一化处理流程。通过两步酶促反应，已扩增的文库不到一个小时即可得到等摩尔 pooling 文库。更多关于 Normalase 的介绍，请参考 ： 【Swift Normalase试剂盒】 NGS文库均一化革命性技术 Tips Swift虽然不提供自动化平台和耗材，但我们与诸多自动化解决方案提供商和终端客户保持有密切合作关系，共同开发适用于自动化平台的优化脚本，并且在24、96和384反应试剂盒中均提供了超过10%的额外试剂，以适应自动化需求。 如果您有这方面的需求，欢迎与我们联系。
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淋巴细胞分离液分离原理和使用
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂。常用的淋巴细胞分离液有Ficoll淋巴细胞分离液、Percoll淋巴细胞分离液。Ficoll与Percoll分离单个核细胞的方法均为密度梯度离心法。 分离原理：外周血中单个核细胞和单核细胞,其体积、形态和密度与其他细胞不同，淋巴细胞分离液是一种密度介于1.075~1.090之间而近似于等渗的溶液,用它做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 淋巴细胞分离液的使用方法： 1、准备无菌的15ml离心管或锥形管； 2、加入淋巴细胞分离液3ml；（注意：淋巴细胞分离液使用前需恢复室温，18-25℃）3、Hank~s液或PBS缓冲液1:1比列（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。4、小心沿着壁管，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴细胞分离液上面；（切记不要搅浑淋巴细胞分离液）5、小心放进离心机（水平转子），4℃离心20-30分钟，速度为400g-1000g；（注意：离心机刹车应取消，需等待自然停止）6、小心取出离管，切记不要震动；7、可见上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的只密白色环，白色环卫单核细胞淋巴细胞。
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ELISA实验中常遇到的问题、产生的原因与解决办法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
酶联免疫吸附实验，简称为 ELISA。ELISA 实验是一种非常经典的免疫学实验。虽然历史非常悠久了，但是还是不断地在临床和基础研究中得到应用。其主要用于：免疫酶染色各种细胞内成份的定位；研究抗酶抗体的合成；显现微量的免疫沉淀反应；定量检测体液中抗原或者抗体成份。小编总结了一些经验教训。遇到的问题，可能的原因，解决方法。供大家参考。 问题 1：阳性与阴性不能达到 2.1 的比值，阴性颜色太深。 可能的原因：阴性对照（也就是阳性对照的除目标抗原外的其它成分）中有某种成分与一抗作用。 解决的方法：纯化抗原除去干扰成分。 问题 2：阳性与阴性不能达到 2.1 的比值，阳性颜色太浅。 可能的原因有 3 个： 1）一抗效价不好。 2）抗原太稀。 3）封闭时间过长。 解决的方法： 1）换用一抗或增加一抗用量。 2）增加抗原浓度。 3）缩短封闭时间，封闭时间一般 37 摄氏度 3 个小时，或者 4 摄氏度过夜。不能比这个更长了。 问题 3：增加抗原浓度，一抗浓度不变，显色反应没有表现出应有的梯度。 可能的问题： 一抗与抗原的比例已经饱和。 解决的方法： 增加一抗用量; 或在一抗用量不变的情况下减少抗原浓度做梯度。 问题 4：增加一抗浓度，显色反应没有表现出应有的梯度。 可能的原因：一抗与抗原的比例已经饱和。 解决的方法：增加抗原用量；或在抗原用量不变的情况下减少一抗浓度做梯度。 问题 5：加完 TMB 显色后颜色梯度很明显，但加了硫酸终止反应后颜色梯度没有那么明显了。 可能的原因：硫酸可能把其它成分都炭化了。 解决的办法：加少一点硫酸，参考值：50 μlTMB+35 μl 硫酸；或者采用 1M 的 HCL 作为终止液，50ulTMB+50ul1M HCL。 这些步骤里面，一抗和封闭是两个关键。如果 ELISA 做不出满意的结果，首先应该从这两个方面改进。Elisa 实验看似简单，其实不然。别小瞧了ELISA。光是一个加样就有很多讲究。 ELISA 中加样须注意如下问题： 吸取样品时，加样枪吸头不
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如何提高蛋白转印效率
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
质量差的蛋白转印在免疫印迹的过程中会导致要么比较弱的信号要么没有信号. 尽管质量差的蛋白转印时有发生，科学家们通常不把它作为一个免疫印迹实验失败的原因。因此，当需要排除质量差的信号的原因时转膜的质量好坏需要首先被考虑. 导致转膜差的原因 质量差的蛋白转印可能发生在抗原水平低的情况下。这种情况的发生通常是因为要么转膜步骤差或胶没有足够的装载. 在实验室中，这在免疫印迹中会作为错误发生从而导致信号的缺失。为了使转印成功膜需要有更高水平的抗原.也会有转印膜自己的问题或者操作时间长短，因为蛋白转印或许需要更长时间取决于实验人员使用的产品. 如果一个蛋白转印被中断或者没有给与足够的时间, 那么转印或许不能产生足够强度的信号。 另外一个导致质量差转膜的原因是抗体浓度。如果浓度太高或太低, 那么会有很少或者没有信号的转移。 你可以分辨出浓度是否太高因为棕色/ 微黄色的条带会在膜上出现被捕获的气泡会提供一个天然屏障对于蛋白转印，这会导致膜和转印的区域是空白的。在真正印迹的过程中很难识别这些捕获的气泡, 这会导致印迹的失败而没有任何物理的暗示为什么会失败。 阻止和检测质量差的蛋白转印 因为蛋白转印经常被忽视, 实验室人员或许想要整合蛋白确认的过程. 蛋白转印可以通过使用反向染色来进行确认，这会发现任何特定性的问题比如大气泡这些气泡会阻止某些区域不能得到转印。 有很少的方法可以解决气泡问题. 反而，较好的方法是检测印迹来看是否有气泡。不进行染色的话， 大大部分气泡不会被注意到从而导致最终信号的缺失。 除了染色的方法之外，也有其他的产品，比如 Swift Transfer Pads, 它可以用于降低必要的蛋白的转膜时间阻止潜在的问题发生，比如过热. 他会降低蛋白转膜不完全的比率。Swift Transfer Pads可以用于任何类型的蛋白，但是对于特别高分子量的蛋白转膜很有帮助。有高分子量的蛋白或许需要更长的转膜时间同时有很大的可能得到质量差的转膜
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如何提高透析的效率
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在生物化学中，透析是在大分子样本溶液中通过选择性和被动扩散的原理分离小分子和不想要的化合物的过程。 通常来说，样品和缓冲液溶液（透析液）放到膜的相反面上。因为透析通过扩散发生作用，分子会自然的从高浓度到低浓度区域进行移动直到达到平衡点。从而协助样品和透析液分子的分离。 因为大分子不能通过膜孔径，他们会在容器的样品面得到保留。然而，我们不想要的分子 (包括盐类缓冲液 (Tris 和PBS), 还原剂 (DTT, BME), 防腐剂比如硫汞撒以及非反应的交联剂或标记试剂比如 sulfo-SMCC 和 生物素), 这些分子在尺寸上非常小，可以非常容易的扩散出半透膜到透析液中。 这降低了样品中目标分子的浓度直到整个溶液达到了平衡。 通常来讲，透析的速率很慢因为它接近平衡后你需要改变透析液，几小时后重新建立可以驱动透析的浓度差. 通过使透析进行到平衡在改变透析液缓冲液之前，你能够纯化在透析膜上浓缩得到的物质通过样品体积和缓冲液体积之间的因子比例. 透析步骤 由于涉及到每一个样品的变量很多，所以透析的完成点是多少有些主管的判断，没有通用的透析步骤可以适用所有的应用。记住，这里提供一个典型的透析步骤可以用于蛋白样品。 1.预润湿或制备透析膜根据厂家的指导. 2.将样品上到透析管或透析装置中. 3.在室温透析1-2小时. 4.改变透析缓冲液透析另外1-2个小时. 5.改变透析缓冲液4°C透析过夜. 样品和透析液组成的不同创造了一个跨膜的浓度差，这驱动了整个过程的发生。因为如此，你应该使用一个高缓冲液对样品的体积比来维持这个浓度梯度。为了得到结果，确保你的透析液是样品体积的 200 到 500 倍. 透析液缓冲液改变的次数以及透析的时间都会影响你的结果。 提高透析的效果 通常来讲，你可以提高实验的速率和效率通过控制影响扩散的因子。 ·加热. 加热影响分子的热动力学这样你可以加速扩散和透析通过增加温度。然而，请记住你的目标蛋白分子的热稳定性是非常重要的和你的实验
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在免疫印迹中防止高背景的小诀窍
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在免疫印迹实验中遇到的质控问题之一最常见的就是高背景。当一个高的背景发生时，很难从不相关的数据中区分出相关的数据。一个常见的高背景可以由于很多原因导致同时需要一些工作来解决 -- 因为不解决这些问题，这个印迹无法读取. 保证缓冲液没有被污染 一个被污染的缓冲液在免疫印迹中很容易导致高的背景。大多数情况下，由于细菌的存在会导致被污染的缓冲液 -- 但是也有其他的污染物. 当污染物进入到缓冲液中后，他们会影响整个印迹的整体, 包括背景. 解决这种干扰的办法是将旧的缓冲液全部扔掉，重新配置新缓冲液。 确保操作步骤是完全恰当的 另外一个能够导致高背景的原因是没有进行恰当的操作步骤。差的膜操作，膜过度曝光， 以及不足的漂洗都会导致高背景。这些问题可以通过恰当操作来解决。当膜变干的时候膜的糟糕操作通常会发生。如果没有使用正确的化学试剂恰当的润湿膜会变干; 通常来说是甲醇. 膜的过度曝光也是一个问题 -- 但是它很容易解决. 你所要做的是将膜曝光的时间缩短. 同样的，不充分的漂洗只是需要将冲洗更加充分彻底. 漂洗用来去掉过量的抗体. 当很多抗体存在印迹上时，很难将印迹和背景区分开来。改进的漂洗也可以通过使用更好的漂洗溶液来进行。 去除不充分的封闭 没有正确的封闭, 免疫印迹的结果无法容易读取. 不充分的封闭通常发生因为在孵育过程中的问题. 如果孵育的时间不足够长，正确的区域不能得到封闭. 如果孵育的温度不正确的话,封闭也不能完成. 也有化学试剂可以加入到这个过程中来进一步提高封闭. 保证封闭剂的兼容性 封闭剂, 如同在印迹实验中使用的其他产品一样，需要根据特定的应用进行调整. 使用错误的封闭剂很容易导致干扰和很差的难区分的印迹. 一些封闭剂基于血清蛋白的，而其他的是基于蛋白的。不同的抗体可以和封闭剂有潜在反应，所以有必要找到最合适的封闭剂. 无蛋白的封闭剂是良好封闭剂之一也是最容易的溶液. 降低抗体的浓度
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对照样品在免疫印迹中的作用
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
对照样品在免疫印迹结果的判定上起着非常重要的作用。对照样品是使用抗体来检测样品中的蛋白。当使用免疫印迹来决定某个样品中蛋白表达的水平时，上对照样是用来保证结果不是由于上样问题或者蛋白转印的错误。当使用上样对照时，正确类型的对照首先需要选择出来。 上对照样品的好处 上对照样品，有很多好处，通常来说关于质量。没有一个上样对照，免疫印迹的结果不能发布因为不能足够的证实。因为这样，上对照样对于那些想要发表的研究来说非常重要。当有一个上样对照的时候，常见的错误比如转印失败会变得非常突出。这减少了花在那些不能使人信服的或不正确的结果上的时间。 进一步讲，类似于边缘效应的问题 -- 当蛋白从外部的泳道向中心漂移 -- 可以排除通过使用上样对照，优化调整整个印迹过程，上样对照可以用来进一步减低不规则蛋白表达水平的影响。在任何情况下蛋白会被要么上样或者转印错误所影响，上对照样就显得尤为重要. 常用的上样对照 有几种主流类型的上样对照. 取决于免疫印迹本身，任何这些蛋白或者是理想的选择. 如下是常用的上样对照。 · Actin. Actin是对于全细胞和细胞质抽提的应用来说是理想的选择。有各种形式可供选择, Actin是极其多用途的上样对照。Actin不能用于骨骼肌肉样品，因为它是肌肉活动的主要组分。 · GAPDH. 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是另外一个全细胞和细胞质抽提上样对照. 通过打断葡萄糖和碳分子，GAPDH作为糖酵解催化剂. · Porin. Porin对于线粒体蛋白来说是一个理想的上样对照. Porin是一个电压依赖性的阴离子选择通道蛋白, 在很多组织中都得到了发现。 · Lamin B1. 主要适用于核蛋白膜，Lamin B1 理论上人为主要负责细胞内细胞核一些元素的稳定. Lamin B1不应该作为上样对照当没有核膜的时候。 · TBP. TATA 结合蛋白 (TBP)是另外一个核蛋白的上样对照. 它是一个转录结合蛋白, TBP 直接和RNA聚合酶II一起发挥作用在DNA定序中被发现。 除了有不同类型的上
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点滴透析综述
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
点滴透析的定义： DNA溶液制备以后，在操作过程使用的酶或许被使用的化学品的残留多影响。这或许包括过量的盐，SDS, 或者其他抑制物质。为了恰当的使用DNA制备液的结果, 有时需要进行点滴透析。理想情况下，点滴透析能够漂洗酶，去除残留，提供更好和更加准确地结果。 点滴透析的过程： 在点滴透析的过程中，缓冲液加到烧杯，培养板，或其他容器中。常用的缓冲液是双蒸水。 一个VS型膜放到缓冲液上面并且光面朝上，这个滤膜会被完全饱和，这个过程大概持续5分钟。同时，很重要看下滤膜是否有气泡，这些气泡会在滤膜和缓冲液之间。DNA通过移液器缓慢滴落到滤膜的中心处。如果DNA保持在滤膜的中间，整个的测试样品可以放在上面。如果DNA发生了移动，那么这个DNA不适合透析。DNA不会保持在滤膜的中心或许需要一个额外的酒精沉淀步骤。 这个容器然后盖上约1-4个小时。等待合适的时间之后，DNA使用另外一个移液器进行重新收集，然后放入一个微量离心管中，用缓冲液将膜进行漂洗。分光光度计或琼脂糖凝胶电泳用来估计DNA的浓度。这时，有可能影响DNA分析结果的化学物质应该被去除。 尽管点滴透析可以通过其他缓冲液来进行操作，通常来说推荐双蒸水。点滴透析的过程也可以使用一个样本进行重复如果你发现仍然有没有必要的残留或污染物的话. 当重复点滴透析的过程时，使用新鲜的缓冲液和新的滤膜很重要 -- 然而样品可以需要操作所需要的额外时间. 点滴透析的难点： 点滴透析需要具备一定手工操作水平的熟练性, 因为它不像化学反应这么简单 -- 它需要操作人员能够将滤膜正确的放置，并且能够准确地将DNA滴到膜上. 如果DNA没有准确地滴到滤膜中心或者滤膜丢失, 这个过程或许需要重新开始. 进一步来说，滤膜或许会翻转。 因为滤膜会在缓冲液上不可预测的移动, 强烈推荐操作人员先模拟整个操作过程在用真实的样品操作之前。一旦这个过程被掌握后，就比较简单了，只要你理解了各个组分如何整体产生效果。新手进行
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G-Biosciences Spin-OUT离心式脱盐柱 使用说明
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
今天为大家介绍G-Biosciences Spin-OUT离心式脱盐柱的使用方法： 以G-Biosciences离心式脱盐柱Spin-OUT GT-1200 Medi为例： G-Biosciences Spin-OUT GT-1200，与Pharmacia的Sephadex G-50的功能类似，都是用来代替比较耗时的传统透析处理，以达到快速纯化蛋白/替换蛋白质缓冲液的目的，不过前者是离心式的，后者是重力式的。GT-1200适宜于纯化分子量大于12，000的蛋白质，有两种上样量规格的：Micro和Medi。没有现成的使用说明材料，听朋友介绍这是非常不错的品牌，在国外很火。感兴趣之余啃下其英文说明书了，先了解下其使用步骤： 一、使用前准备： 1.上下颠倒数次，将管中的凝胶悬浮起来，然后100×g离心1min，让胶体回到管底。这里有两点需要注意的：1）新的柱子看过去几乎是透明的，不要认为什么填料都没有，其实是颗粒太细了；2）离心力是×g，在离心机上显示的是RCF这个单位，而不是RPM。这两个单位有本质区别，需要特别留意。其中： RPM(revolution per minute)为离心机每分钟的转数(单位:周/分钟)；RCF(relative centrifugal force)为相对离心力，以地心引力即重力加速度的倍数来表示，一般用×g表示。 两者转换关系如下： RCF=0.0011×r×RPM^2 RPM=(909×RCF÷r)^0.5 r为离心机转子半径(单位:米)。 2.拔掉两头的塞子，将柱子放在10ml离心管中，1,000×g离心2min以移除储存buffer。离心完成后，即可看见白色的填充料。 二、开始使用（交换buffer） 1. 用缓冲液平衡柱子：加入1-2ml缓冲液，将柱子放到10ml离心管中，静置数分钟让缓冲液全部进入柱体后，再重复加入3-5次。最后以1,000×g离心2min，弃掉收集到的溶液，以保证buffer被全部替换了。 2. 将柱子放到新的离心管中，缓慢加入蛋白质样品。注意，上样量为Medi的柱子最多加入0.5ml样品，上样量为Micro的柱子最多加入0.1ml样品。样品加在柱子中间的凝胶上，而不要碰到树脂部件。加样结束后静置1-2min，让凝胶充分将样品吸收。 3.
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ELISA技术与自动化
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在一般的概念里，ELISA技术的可操作性强，不需复杂设备，甚至完全手工加样、洗板和肉眼判读结果，便可完成该技术的操作。随着人们对质量控制意识的加强，尽可能做到zui低限度的减少系统误差，以及减少劳动强度等观念的不断改进，解决ELISA技术中加样、温育、洗板及判读结果过程的系统误差问题及高效率运作问题导致了自动化概念的形成。ELISA技术的加样、温育、洗板及判读结果过程的科学地、有机地、系统地结合，尽可能地减少各环节的人为因素的影响，便成为自动化ELISA技术的理论基础。 在自动化ELISA技术中，可以将整个体系分成加样系统、温育系统、洗板系统及判读系统、机械臂系统、液路动力系统及软件控制系统等几种结构，这些系统既独立又紧密联系。加样系统包括加样针、条码阅读器、样品盘、试剂架及加样台等构件。加样针有两手中，一为有TEFLON涂层的金属针，另一为可更换的一次性加样头(Tip) 。有些仪器的加样针只配金属针，无一次性加样头，有些是两种针都配备。加样针的功能主要是加样品及试剂，它是靠液路动力系统提供动力，通过注射器样的分配器进行精确加样的。加样针的数量在各型号仪器上是不同的，有一根的、两根的或多根的。条码阅读器是帮助识别标本的重要工作，目前的仪器均配有此装置。样品盘除了放置标本外，还能放置稀释标本用的稀释管，供不同检测目的使用。试剂架是供放置酶标记试剂、显色液、终止液等试剂用的，有些型号的仪器这一部分是独立的，有些是并在样品盘上。加样台是酶标板放置的平台，有些仪器在台上设置温育装置，让温育在台上进行。整个加样系统由控制软件进行协调操作。 温育系统主要由加温器及易导热的金属材料板架构成。有些是盒式的，有些是台式的。一般控制的温度可在室温- 50°C之间。温育时间及温度设置是由控制软件需确调控的。 洗板系统是整个体系的重要组成部分，主要由支持板架、洗液注入针及液体迸出言路等组成。;洗液注入针一般是8头的。每项洗板的洗板残留
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