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ACHROM进行层析柱柱效测定的方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
柱效测定 样品和缓冲液 ①1%的丙酮为样品，纯水或实验缓冲液为流动相，监测紫外吸收峰图； ②0.8M NaCl为样品，0.4M NaCl为流动相，监测电导峰图； 上样条件 ①上样体积：为柱体积的1%； ②上样流速：30cm/h的线性流速； 积分 根据峰图积分，看积出的峰的理论塔板数（HETP）、对称性（AS）和柱效评价因子（塔板高度/填料粒径），每种填料都有其推荐的数值，需要查阅说明书。 具体积分流程如下 （以泰渡公司的ACHROM纯化仪过样品丙酮，通过对样品的紫外吸收峰图积分为例） 一、首先打开已保存的图，如果觉得线条太多，可以都取消只保留UV280 二、点击菜单栏峰积分 可看到如下界面 填写柱子高度以及填料粒径，并点击Peak window，可看到如下界面 选定要分析的峰，再点击Reject peaks，填写数字1，最后点击确定，出现下图； 三、右击选择性能 可看到如下界面：选择PeakTable，勾选理论塔板数和对称性 点击确定，就可以在图谱下查找柱效结果了
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外周循环系统CD8+T淋巴细胞流向肿瘤与高内皮静脉的重要关联详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
前言 2022年3月18日百时美施贵宝的LAG-3抗体Relatlimab获批，联合PD-1抗体Nivolumab**不可切除或转移性黑色素瘤。免疫**显然已经成为肿瘤临床**的主角，人们的视线也越加集中于免疫检查点表达的免疫细胞。 我们之前的文章，分析了不同免疫细胞评价免疫**效果的作用 延伸阅读： 8大类免疫细胞构成与肿瘤预后 B细胞有效区分“应答患者”和“无应答患者” 今天，我们分享另外一篇文章，肿瘤相关高内皮静脉对免疫**评估的价值。 肿瘤相关高内皮静脉 外周循环系统中CD8+T淋巴细胞流向肿瘤对于同流免疫**（ICB、疫苗或过继T细胞**）至关重要。在这一环节中，依赖于高内皮静脉(High endothelial venules，HEVs)。 HEVs表达高水平硫酸化的唾液酸粘蛋白，可以被淋巴细胞归巢受体（CD62L）和HEV特异性抗体MECA-79识别（用作免疫组化HEVs染色）。 Cancer Cell 2022 MECA-79+肿瘤相关高内皮静脉（Tumor-associated high endothelial venules，TA-HEVs)的密度与CD3+和CD8+T细胞和CD20+B细胞的密度相关，与原发性乳腺癌和黑色素瘤良好的临床预后相关。TA-HEV存在于三级淋巴样结构中，尤其是含有高密度T细胞和成熟树突状细胞的区域，非B细胞富含区域。 肿瘤相关高内皮静脉与肿瘤免疫** Cancer Cell 2022 MECA-79+TA-HEV是癌症免疫和免疫**过程中，免疫细胞滚动、黏附（依赖CD62L）、外渗到肿瘤局部的主要位点。 在发生免疫逃逸的肿瘤，TA-HEVs的密度低，而免疫检查点阻断**（immune checkpoint blockade，ICB）可以增加肿瘤微环境中TA-HEVs的密度，进而增加肿瘤浸润性CD4+和CD8+T细胞的丰度。免疫检查点阻断剂联合**比单药可以更加明显的增加TA-HEV密度，以及CD4+和CD8+T细胞的丰度。 临床疗效上（NCT02857569），PD-1单抗单药**时，TA-HEVshigh病人 OS和PFS有轻微改善(OS, p = 0.44; PFS, p = 0.65)；但是在和CTLA-4单抗联用时，TA-HEVshigh病人OS和PFS有非常显著的改善(OS, p = 0.0012; PFS, p = 0.0014)。 Canc
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人巨细胞性肺癌细胞801-D培养常见问题
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
问题1：培养液pH值变化太快 细胞结构： 可能原因及解决办法 （1）CO2张力不对 按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。 （2）培养瓶盖拧得太紧 松开瓶盖1/4圈。 （3）NaHCO3缓冲系统缓冲力不足 改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。 （4）培养液中盐浓度不正确 5637(人膀胱癌细胞)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。 （5）细菌、酵母或真菌污染 丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变 可能原因及解决方法 （1）洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来 用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。 （2）冰冻保存培养液 将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。 问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化 可能原因 细菌或真菌污染 建议解决方法 丢弃培养物，或用抗生素除菌。 1、首先，观察细胞培养瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象。若有，请拍照，并及时与技术支持联系（所拍照片将作为后续服务依据）。 2、用75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落；先不要打开培养瓶盖，将细胞置于细胞培养箱内静置培养2-4小时，以便稳定细胞状态。 3、仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如贴壁特性（贴壁/悬浮）、细胞形态、所用基础培养基、血清比例、所需细胞因子、传代比例、换液频率等。 4、静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照，记录细胞状态（所拍照片将作为后续服务依据）；建议细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。 5、贴壁细胞：若细胞生长密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，移除细胞培养瓶内培养基，预留5ml左右继续培养，直至细胞密度达80%左右再进行传代操作，瓶盖可稍微拧松。 6、悬浮细胞：将细胞培
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胚胎干细胞（ESC）的鉴定方法与常见问题
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
干细胞可分为胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）和成体干细胞(adultstemcell,ASC)，其中ESC是来源于囊胚内细胞团的全能干细胞，初次发现于1981年，研究人员从小鼠囊胚中成功分离并实现了体外培养。因ASC是在成年动物体内的组织中分离提取，如骨髓、脂肪和脐带等，其在体外分化增殖能力有限，仅能分化为特定某几种类型组织的细胞。 而ESC具有无限的增殖传代能力及分化全能性，可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型。这种无可比拟的特性让ESC成为很多领域的基础和应用研究的强有力工具，包括发育和调控研究、再生医学、潜在**方法。 那么ESC具有什么形态学特征？它有哪些表面标志物？又该如何鉴定其分化潜能呢？请看以下分解。 01形态学 相对其他细胞，ESC单个细胞个体小，细胞核大，体外培养时呈集落样或克隆样生长，克隆内细胞排列紧密，细胞集落有明显的边界。此特有的形态学特征常用来做初步鉴定ESC的方法。 例如，MouseESC细胞核大，胞核内有多个核仁，核浆比高。在贴壁生长的情况下，HumanESC集落与MouseESC不同，呈相对松散、扁平状集落，集落内细胞界限隐约可见。 02特异性转录因子/抗原表达 ESC鉴定也有独有的表面标志物，目前常用的检测标志物是特异性转录因子OCT-4、Nanog及阶段特异性胚胎表面抗原SSEA。 OCT-4是一个和胚胎发育全能性相关的转录因子，几乎所有的ESC都表达OCT-4，当ESC被诱导向成体细胞分化时，OCT-4的表达逐渐下降。 Nanog是一种有同源结构域的转录因子，可以维持ESC的自我更新，以及调节ESC的细胞周期。与OCT-4相似，当ESC分裂旺盛时，Nanog高表达，随着ESC分化程度的提高而Nanog表达量逐渐下调。 SSEA是一种糖酯蛋白，用来鉴定ESC的SSEA通常有三种，分别是：SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，它的表达具有种属间特异性。如通过免疫荧光检测，可发现HumanESC和MouseESC具有不同的SSEA表达。 HumanE
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真空离心浓缩仪的的基本原理与影响蒸发浓缩速度的因素
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
溶剂去除是制药、化学和生物技术行业广泛应用中必不可少的过程。尽管使用了多种样品形式和溶剂，但没有一种单一的溶剂去除技术可以提供通用的解决方案。随着冷冻干燥和离心浓缩技术的不断成熟，结合 真空泵、冷阱和加热蒸发设备，所开发的新一代高功率冷阱、真空离心浓缩仪等仪器，既提高了蒸发性能又改善了样品完整度，这类仪器还进一步地提升了溶剂回收率，从而减少了蒸发- 浓缩过程对环境的影响。 只有充分了解离心浓缩仪的基本原理与应用才能更好地在实验中发挥它的作用。 溶剂去除的原理 在溶剂去除过程中，以热量的形式施加能量，使液体蒸发成气体，气体被去除，留下浓缩或无溶剂（干燥）的产品。许多系统统称为“蒸发器”。然而，真正的蒸发是在液体表面蒸发成气体；对于许多 “蒸发器”来说，发生的是沸腾而不是蒸发。冷冻干燥过程既不涉及蒸发也不涉及沸腾，而是涉及升华，即从固相转变为气相而没有液相。 物质的相由两个主要因素决定——热量和压力——而发生沸腾或汽化的温度由压力决定。因此，真空浓缩器在系统中施加真空以降低溶剂的沸点，以便在较低温度下发生液体蒸发，例如，水在 10 mbar 压力下的沸点为 –7.5 °C。类似地，在冷冻干燥机中，在低压下提供给冷冻样品的热能会传递足够的能量来解冻，但压力不足以形成液体，因此溶剂会升华成气体。产生的蒸气通过冷阱或冷凝器除去，在此回收溶剂。 热量和温度 溶剂去除系统使用热能输入来诱导溶剂蒸发，并采用各种加热机制，例如电加热块、灯或低温蒸汽。热量和温度虽然联系在一起，但它们是不同的，区分它们很重要。热量是指以焦耳为单位测量的热能，而温度测量热能的水平，即物体的热度或冷度。被称为热敏的样品通常对温度敏感，如果温度保持在规定的范围内，大多数样品可以在不降解的情况下加热。在系统中施加真空会降低溶剂的沸点，以便在对样品安全的较低温度下发生液体汽化。 热量和温度通过方程Q = m cΔ T相关，其中Q是添加的热能， m是物体的质量，c 是
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多光谱和X射线成像技术相结合用于表征麻疯树种子质量的研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
Multispectral and X-ray images for characterization of Jatropha curcas L. seed quality 期刊：PLANT METHODS 影响因子：4.993 用于表征麻疯树种子质量的多光谱和 X 射线图像 背景：在农业工业和作物育种中，使用较少人为干扰的非破坏性方法引起了人们的极大兴趣。现代成像技术能够自动显示用于表征生物样品的多参数，从而降低主观性并优化分析过程。此外，两种或多种成像技术的结合有助于发现新的物理化学工具和实时解释数据集。 结果：我们提出了一种基于多光谱和 X 射线成像技术相结合的种子质量自动表征的新方法。我们提出了一种使用 X 射线图像研究内部组织的方法，因为种子表面轮廓可能会受到负面影响，但不会到达种子的重要内部区域。油籽植物（麻疯树）被用作模型物种，它也是一种在世界范围内具有经济重要性的多用途作物。我们的研究包括应用归一化典型判别分析 (nCDA) 算法作为监督变换构建方法，以获得不同种子块上的空间和光谱模式。我们使用基于线性判别分析 (LDA) 的反射率数据和 X 射线类别开发了分类模型。单独或组合的分类模型使用 940 nm 的反射率和 X 射线数据来预测正常幼苗、异常幼苗和死种子等质量性状，显示出较高的准确度 (> 0.96)。 结论：多光谱和X射线成像与种子生理性能密切相关。 940 nm 的反射率和 X 射线数据可以有效地预测种子质量属性。这些技术可以成为未来快速、高效、可持续和无损表征种子质量的替代方法，克服传统种子质量分析的内在主观性。 种子方向与基于多光谱反射率区分种子地块无关（图 2）。 紫外（365 nm）和可见光（405-690 nm）区域的波长显示出低反射强度（< 20%），很难区分批次。 然而，在较长波长处获得的数据，特别是在近红外 (NIR) 区域（从 780 到 970 nm）中获得的数据清楚地能够区分种子区，并且具有高活力的种子显示出最低的反射强度（批次 2）。 图2. 三个不同活力水平的麻疯树种子表面在 19 个波长下每个感兴趣区域内的平均光谱图
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基于多光谱和共振成像技术的麻疯树种子健康分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
Multispectral and X-ray images for characterization of Jatropha curcas L. seed quality 期刊：PLANT METHODS 影响因子：4.993 用于表征麻疯树种子质量的多光谱和 X 射线图像 摘要：基于现代种子工业的强大光谱空间传感器，在最先进的技术中开发了创新方法。在这项研究中，我们提出了一种基于多光谱成像结合机器学习算法对麻疯树种子健康进行分类的新方法。此外，我们首次提出了一种基于磁共振成像 (MRI) 的方法来识别感染不同病原真菌的麻疯树种子的解剖学变化。首先，将种子人工接种Lasiodiplodia theobromae、Colletotrichum siamense和Colletotrichum truncatum，培养24、48、72、96、120、144和168 h后获取多光谱图像。使用培养的种子应用 MRI 方法 168 小时。我们的结果表明，多光谱成像技术与统计模型相结合，具有在孵化 48 小时后区分麻疯树种子中不同真菌种类的潜力，且准确度高（>80%）。所提出的 MRI 方法可以识别受可可豆、暹罗念珠菌和截形念珠菌感染的胚乳组织中的不同损伤模式。因此，多光谱成像和 MRI 可以成为快速准确检测麻疯树种子中不同真菌种类的有用工具。 图 1 显示了健康种子和用 L. theobromae、C. siamense 和 C. truncatum 培育的种子类别中 19 个波长的平均光谱。 在可见光区域（405-690 nm），健康种子显示出类似于与可可豆温育的种子组相似的光谱特征。 但是，在整个光谱中，C. siamense 和 C. truncatum 的类别之间存在明显的区别，特别是在孵育 96、120、144 小时后（图 1e、f、g）。在 NIR 区域，健康种子显示出不同的特征模式，与真菌感染的种子相比，在 940 和 970 nm 处具有更高的反射率趋势，以及更高的标准偏差值（图 1i）。 同时，UV 波段（365 nm）内的反射率平均值显示出与每组内平均值的较小标准偏差。 图1. 每个感兴趣区域内的平均光谱图 - ROI（n = 231 颗麻疯树种子）在 19 个波长下，用于健康种子和感染 Lasiodiplodia theobromae、Colletotrichum siamense 和
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体外培养内皮细胞时施加剪切力的作用与结果详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
流体环境下的细胞 影响关键因素是什么 剪切力（dyn/cm2） 体内的内皮细胞通常存在于它们不断暴露于血流摩擦力（称为剪切应力）的环境中。剪切应力是生理条件下内皮细胞功能的关键调节因子，流动障碍和剪切应力改变与动脉粥样硬化或血栓形成等病理有关。内皮细胞通过各种受体感知剪切应力，并将机械剪切应力刺激传递到细胞内信号传导中，导致细胞功能和表型发生变化。 血液流动 细胞如何感知剪切力 剪切力由细胞表面的流量传感器感应，内皮细胞表达各种机械传感信号。 细胞骨架在整个细胞的剪切力传递中起着关键作用，信号通过细胞骨架元件传递到各种细胞内位点 流体环境下细胞—模拟血管 在模拟流体生理条件下体外培养内皮细胞： •细胞形态的变化 •肌动蛋白应力纤维的形成 •稳定性粘附连接和紧密连接（屏障形成） HUVEC的免疫荧光染色，分别在静态条件下和流动下培养5天。 流体活细胞-活细胞成像 流体下的活细胞成像可以实时可视化剪切应力效应（例如，肌动蛋白应激纤维的形成） HUVEC在20 dyn/cm2下培养的LifeAct-TagGFP2。（图像分别以相差和荧光拍摄） 模拟淋巴血管中的流动 系统设置: ibidi Pump System µ-Slide I 0.8 Luer Oscillating flow (4 dyn/cm2; 0.25 Hz; 48h) Courtesy of A. Sabine, Universityof Lausanne, Switzerland (refer to A. Sabine et al., TheJournal of Clinical Investigation, 2015) FOXC2 和振荡剪切应力维持淋巴管内皮细胞-细胞连接和血管完整性。 流体环境下—滚动和粘附试验 研究流动下的细胞-细胞附着可以深入了解免疫细胞-内皮细胞的相互作用（e.g., during inflammation） 单层的 LPS 刺激脑血管内皮细胞（ CVEC ）以1 dyn / cm2灌注 的颗粒细胞。
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可视细胞共培养实验的操作方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
在本方案中，我们将用于两种不同细胞类型的共培养。供体细胞和受体细胞可以单独生长，但共享相同的培养基以通过可溶性因子/蛋白质进行通讯。 共培养实验流程 1.打开μ-Slide2孔共培养载玻片的包装，并将其放在μ-Slide架子或其他合适的表面上。准备您的受体细胞，并使用40-60μl细胞悬液将其接种到中央小孔中。根据您的细胞，我们建议5-10x104cell/ml。 2.准备您的供体细胞，并将其接种到外部小孔中，每孔使用40-60μl细胞悬液。当使用ibiTreat（经过亲水性组织培养处理）表面时，外部8个孔之间可能会发生一些混合。不要用培养基润湿内孔的走道，并小心处理玻片，以免在细胞附着之前混合培养基。 3.细胞附着后，清空各个孔溶液以防止细胞混合。用40-60μl培养基洗涤9个小孔，以去除非贴壁细胞。之后，将400-600μl培养基填充到每个大孔中。这将连接9个小孔，从而允许两种细胞通过培养基进行通讯。 μ-Slide2孔共培养载玻片还允许在凝胶基质内培养细胞球体，并与接种在外孔中的供体细胞结合。在下面的图片中，有一个多细胞球状体，例如内皮细胞嵌入胶原蛋白凝胶中。在中心小孔中生长的球状体可以在癌细胞附近培养，这些癌细胞可以释放出可溶性因子。像胶原I型凝胶这样的水性3D凝胶基质不会阻碍分子扩散。 与ibidiCulture-Insert2孔一起进行2D共培养，ibidiCulture-Insert2孔可用于将不同类型的细胞铺到一个培养容器中，彼此相邻。它仅用作在指定区域播种细胞的模具。去除培养插件后，不同的细胞类型会彼此紧邻而无障碍地生长。 μ-Slide共培养，可以创建单个细胞模式。根据所使用的板或培养皿，可以单独选择细胞数量和培养基体积。 在3D矩阵中共同培养细胞 ibidimicro-Insert4孔提供了小孔，可以填充混合到3D凝胶基质中的细胞。这样，可以在共享一个液体的同时分别培养不同类型的悬浮或贴壁细胞。可以根据需要收集或交换，而无需将细胞冲洗出凝胶。
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质粒的提取和纯化
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
质粒（Plasmid）是独立于染色体外的环状DNA分子，大小通常在1-200Kb不等，可依赖宿主细胞中的酶和蛋白质进行独立地复制和转录。 质粒是独立于染色体基因组的DNA。按照质粒的拷贝数量，通常把质粒分严紧型质粒和松弛型质粒。严紧型质粒：染色体复制一次，质粒也复制一次，每个细菌内只含1-2个质粒；松弛型质粒：当细菌染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细菌内一般含20个左右质粒拷贝。 为了适应更多复杂的分子克隆实验，在天然质粒的基础上，人们构建出具有不同特性的质粒载体。质粒载体通常具有以下几个特点：具有较小的分子量、可插入较大分子量的目标序列、具有多种常用的限制性内切酶酶切位点，同时具有检测表型（耐药性等）。 典型的质粒载体通常具有复制起始点Ori（下方蓝色方形）、筛选标记（红色区域）以及多克隆酶切位点MCS（右侧蓝色区域） 预备知识Ⅱ：分离纯化的原理 质粒纯化的过程实际上是将质粒与染色体基因组、蛋白质等其他成分分离的过程。在细菌体内，质粒是以共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)的形式存在。碱裂解法是实验室提取质粒最常用的方法之一，该方法的原理是利用线性的染色体DNA与闭合环状质粒DNA在拓扑学上的差异来实现分离。 共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)结构示意图，在细菌中，cccDNA通常以超螺旋的形式存在 实验操作中，我们通常应用溶菌酶和阴离子表面按活性剂SDS（十二烷基磺酸钠）来处理收集到的菌体。在溶菌酶的作用下，细菌的细胞壁破裂并释放出质粒。在pH12-12.5这个狭窄的范围内，线性染色体DNA的双螺旋会解开，质粒DNA的氢键也会断裂。然而，质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条链依然互补缠绕，紧密结合。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，SDS可包被在这些大型复合物表面上。当加入乙酸甲使溶液恢复中性时，两种DNA均可迅速复性，
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质粒的分类和提取的主要步骤及作用
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
分类： 1.根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。 2.根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。 严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。 3.根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。常用于流行病学的调查。 功能： 质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。 经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently
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Videometer利用可见光和近红外多光谱结合对不同番茄种子品种进行分类
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
利用可见光、近红外多光谱和化学计量学对不同番茄种子品种的分类 摘要：利用可见光和短波近红外光谱结合化学计量学方法，研究了五种不同番茄种子品种快速无损分类的可行性。从番茄种子的多光谱图像中提取了19种不同波长（375 nm至970 nm）的可见-近红外光谱。主成分分析（PCA）用于数据挖掘，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和支持向量机判别分析（SVM-DA）用于对5个不同番茄品种进行分类。结果表明，无论化学计量学方法如何，对于所有番茄品种，两个独立测试集的分类准确率都非常高，范围从94%到100%。PLS-DA和SVM-DA校准模型的总体分类错误率分别为3.2%和0.4%。结果表明，可见-近红外光谱有可能用于番茄种子品种的无损鉴别，并有机会将其纳入植物遗传资源管理、植物品种保护或登记方案。 图1.捕获的五个番茄种子品种的多光谱图像。（a）蓝色背景分割后的图像；种子上的白边显示ROI的选择（b）;525nm下的种子图像（c） 来自五个番茄品种种子的Vis-NIR光谱数据显示出变化，但在每个波长上表现出相似的反射趋势（图 2）。光谱的变化表明番茄品种在番茄种子的物理和化学特性方面存在差异。可见光范围的变化可归因于种子样品的颜色，而NIR区域的变化是由于品种种子的化学差异所致。这些光谱变化表明 Vis-NIR 可用于定性使用化学计量学方法进行分类。PCA 最初是在 Vis-NIR 光谱上进行的，没有任何数据预处理，以探索番茄品种的可能聚类并识别可能的异常值。然而，没有观察到番茄品种之间的明显区别（数据未显示）。这并不奇怪，因为种子的光谱特性可能会影响光散射、粒度分布和与入射光束对齐等物理现象，这些现象会给数据增加噪声。因此，数学数据预处理算法 SNV 和 detrend 用于消除或最小化物理效应以进行进一步数据分析。对预处理的 Vis-NIR 光谱执行的 PCA 显示校准集中很少有异常值（数据未显示）。然而，去除异常值并没有改进模型，它们随后被保留用于分类模型的进一步开发。图 3 显示了使用前三个得分向量 P
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质粒扩增的操作步骤和抽提过程中的注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
一、扩增流程 收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。 1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养） ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒； ②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min； （从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作） ③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min； ④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上； （可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子） ⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h； （如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化） ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。 2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期30天，请务必划线挑单克隆培养） 四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。 3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天） 穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。 4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天） 直接挑取单菌落至液体培养基中。 5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期30天） 单独提取的液体质粒收到后可直接使用。 如需要大题好的质粒，可以下单备注。 降低RNA残留的方法 RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。幸运的是，RNA 的残
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蛋白质印迹技术（Western Blot）的基本流程和步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
本文摘要 蛋白质印迹技术（免疫印迹实验）又称为Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。Western Blot主要用于检测或分析蛋白，应用领域集中在基因表达研究、抗体活性检测和疾病诊断等。 01 蛋白质印迹基本流程图 02 western blot步骤 样品准备： Tanon 连续梯度预制胶（4-20% 10 孔/15 孔/17 孔）； （4-12% 10 孔/15 孔/17 孔） Tanon Mops/MES 电泳缓冲液（粉剂） Tanon 预染蛋白 Marker Tanon 4×LDS Loading Buffer Tanon 快速蛋白染液 预制胶规格的选择 在不使用预制胶的情况下，需要自行配置适合蛋白电泳SDS胶，采取自制胶的方法从加入缓冲液到制胶完成这一过程大概需要花费将近1个小时。并且由于配比过程中的认为误差容易产生浓度不均一，稳定性差，已出现外八型、笑脸型等条带。采用天能系列预制胶具有较高的稳定性和均一性，使蛋白电泳条带更清晰锐利，使得条带更加均匀。还有重要的一点就是可以免去制胶的时间，大大提升了实验效率。 蛋白转印使用天能VE-586转移电泳槽主要优势在于:它可以在不埋冰的情况完成的蛋白电泳，如果配合快速转膜液，整个电泳过程只需不到30分钟，可同时转印4块胶，操作方法也比较简便。在缩短转印时间的同时，实现了蛋白样品的高效转印。 03 蛋白电泳 目前常用的是SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳），蛋白质会根据分子量大小分开，分子量的蛋白会留在胶的下部，分子量大的会在胶的顶部。 04 转膜 转膜主要是将蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的是NC膜和PVDF（聚偏氟乙烯），由于膜与蛋白质高度亲和的能力，所以更容易与蛋白结合。为了便于观察电泳效果和转膜效果，可以使用蛋白预染Marker，以方便判断蛋白分子量大小。 蛋白预染的传统方法是膜将置于脱色摇床上，用1×丽春红染液振荡预染5min。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 蛋白转印使用天能VE-586转移电泳槽主要优势在于:它可以在
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用细胞冻存液保护细胞的原理
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
科幻电影中将冻存若干年的生命体重新解冻复活的情节在生命科学研究过程中每一天都在上演。为了将每一种有生命的细胞较好的保存其原有的细胞特性或者长久的保存种质资源，实验人员往往将细胞用特殊配置的细胞冻存液保存于-196℃的液氮，使得细胞暂时脱离生长状态，等到实验需要的时候再从液氮中取出复苏应用。在这一看似神奇的生命存储过程中，我们不禁要问细胞冻存液是如何保护每一个细胞生命的？ 细胞这一微小的生命体和地球的其它生命相似，机体的主要成份是由液态的H2O组成，但是其结构微小复杂，内部任何的物理损伤对于它都是致命的。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水份都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡，这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。 如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。 因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷
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