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如何构建点突变细胞模型
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
全球有超过50000种人类相关的遗传疾病，其中大部分是由基因组的点突变引起的。而对于罕见病而言，80%是由基因缺陷引起的，同时这些基因缺陷中点突变又占了60%。比如，我们熟悉的镰刀型红细胞贫血症就是由于β-globin基因编码区上的一个碱基位点发生突变引起的；又比如多发性神经纤维瘤（Neurofibromatosis）则是由 Neurofibromin 1/2基因发生碱基突变引起的。由此可以看出，对基因组点突变的研究不仅能揭示一些重要的生物学原理，更有利于人类疾病**手段的研发。 什么是点突变 点突变是基因突变的一种，广义的点突变包括所有单个碱基的改变，即缺失、插入和替换。而狭义的点突变主要指单个碱基的替换。嘌呤之间和嘧啶之间的替换叫做转换，而嘧啶与嘌呤之间的替换则叫颠换。以上说的都是DNA分子层面的改变，如果把视角扩展到染色体的层面，则存在染色体数量改变和染色体结构变异两种。 图1. 点突变的方式。 点突变对氨基酸及其构成的蛋白质结构和功能的影响分为三种，即同义突变、无义突变和错义突变。一般情况下，在相同的位点，无义突变对蛋白质影响最大，错义突变的非保守型突变次之，接下来是错义突变中的保守型突变，同义突变本身对蛋白质功能无影响。 图2. 点突变对氨基酸的影响。 点突变疾病模型的构建 研究点突变相关遗传疾病，免不了要构建细胞模型和动物模型，而我们在构建细胞点突变模型时的理论基础便是基因的同源重组修复。当细胞基因组DNA双链由于外部因素而断裂时，细胞中存在着一种DNA修复机制就会被激发，对断裂位点的DNA双链进行修复，根据修复方式的不同可分为同源重组修复和非同源重组修复。顾名思义，同源重组是指DNA在修复的过程中以同源的DNA序列作为模板完美修复，而非同源重组修复是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，同时可能会随机引入新的碱基。 图3. DNA双链断裂修复途径。A)同源重组修复，B)非同源重组修复。 根据这个理论基础，点突变细胞系的
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在免疫组化冰切中减少冰晶形成的方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
在免疫组织化学染色中，冰冻切片是被研究人员使用最多的一种切片方法。原因是这种切片方式能够较完好地保存各种抗原的免疫活性及酶类，特别是对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存；而且对组织存储的形态没有限制，新鲜组织和已固定的组织都可使用冰冻切片。 然而在使用冰冻切片时，组织中的水分易形成冰晶，特别是在含水量较多的组织中更容易发生。严重的冰晶状况（如小而多），会刺破细胞，破坏组织形态，影响抗原定位。 （▲肾脏组织，无冰晶） （▲肾脏组织，大量细胞外冰晶） 冰晶是如何形成的呢？ 冰冻切片中按照冰晶形成在细胞内外的位置不同，表现形式有细胞外冰晶、细胞质内冰晶、细胞核内冰晶。在冰冻切片中，细胞外冰晶是冰冻切片中最多见的，各种组织均可以出现。 冰晶形成的原因是组织冷冻速度太慢。冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33℃，从-30℃降至-43℃之间，成核率急剧增加，然后再减慢。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。要减少冰晶形成，组织冷冻的方式和操作流程至关重要。 如何解决冰晶问题，提高切片质量？ 可采取速冻措施减少冰晶的形成，使组织温度骤降，缩短温度下降（-33℃~ -43℃）所需时间，从而减少冰晶的形成。目前已知的方法有： 使用液氮；这种可快速冷冻组织，有效减少冰晶形成。但因技术成本和管理成本高，使用过程安全性不高，存在生物安全问题等因素，没有被广泛运用。 采用半导体制冷技术；瑞沃德Minux®智能恒温冷冻切片机使用该技术，一键启动快冷模式，设备自动开启固定吸热块，可在1-3分钟内把温度降至-55℃~-60℃。 快速冷冻组织操作流程 *注意： OCT包埋剂影响组织冷冻速度，使用须适量。 冷冻过组织的固定式吸热块，必须放在速冻台上再次降温后使用。 可将组织置于20%、30%蔗糖溶液
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徕卡多维度细胞生物学显微成像解决方案讲座解析
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
4月20日，由徕卡应用专家赵梦路和大家分享了多维度细胞生物学显微成像的徕卡解决方案。众所周知，细胞生物学研究是一个非常系统的工程，涉及方向众多，直播从最经典、最热门的四个角度入手，为大家详细介绍了对于众多的细胞研究痛点，徕卡是如何帮大家解决的，下面我们一起回顾一下。 扫描二维码注册，即可观看直播回顾 细胞内微结构成像 细胞是一个非常精细的结构，近些年研究热点主要集中在分子互作、代谢、细胞通路、修饰等方面。作为生命体的基本结构与功能单位，纷繁复杂的胞内结构在细胞的生命活动与形态结构变化中起到重要作用。因此想要研究细胞的生命活动，对细胞结构与功能的研究至关重要。 这些生物结构的尺寸非常小，由于衍射极限的限制，常规分辨率无法实现精细观察。 活细胞成像 活细胞成像从宏观的角度捕捉生命的本质，包括细胞器和一些细胞结构变化，这些变化通常在生命活动、相互作用与定量研究中起到重要作用。从卵细胞受精的一刻，便形成了新的生命；随着细胞的有丝分裂，生命得以延续；蛋白质等分子的表达与细胞中粒子的变化奠定了生命的基础与活力；胞吞胞吐与信号转导沟通了细胞间进行信息交流；随着细胞的衰老与凋亡，实现一个生命的终结。 在体细胞生物学检测 研究人员在细胞研究后，往往会选择进一步在生物个体上进行分析，以观察其真实生理状态。 细胞操作 研究过程中我们不光要观察细胞，还要进行细胞操作，控制或刺激细胞用于观察细胞变化。此外，由于光镜的分辨率往往无法达到纳米级别以下，因此有些研究中会借助电镜来观察细胞更精密的结构。 总结 了解更多：徕卡显微
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Cell Metabolism 综述 | 铁死亡的代谢基础
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
铁死亡小知识 ■ 异常代谢和生化过程导致的急性和慢性细胞应激可能触发普遍的非凋亡形式的细胞死亡，即铁死亡，最早于2012年被Scott J Dixon提出，一种铁依赖的，区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬的新的细胞程序性死亡模式，但有关如今描述的具有铁死亡特征的细胞死亡的报道可以追溯到上世纪50年代。 ■ 谷胱甘肽的耗竭，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）活性下降，细胞抗氧化能力降低，致使脂质过氧化与代谢功能障碍，脂质活性氧（ROS）增多，从而引发铁死亡。铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，包括氨基酸、铁和多不饱和脂肪酸代谢，以及谷胱甘肽、磷脂、NADPH和辅酶Q10的生物合成，并与哺乳动物退行性疾病、肿瘤、中风、脑出血、外伤性脑损伤、局部缺血-再灌注损伤和肾衰竭相关的病理性细胞死亡有关。 作为一种新的细胞死亡机制，近年来，铁死亡引起了学术界的广泛关注。2020年12月一篇发表在《Cell Metabolism》的综述，详细介绍了细胞内几种可直接影响脂质过氧化和铁死亡敏感性的代谢途径，如(硒)硫醇代谢、脂肪酸代谢、铁处理、甲戊酸途径和线粒体呼吸等，并总结了目前发现的三个主要铁死亡抑制系统，最后探讨了铁死亡在人类疾病发展预防**方面的应用。 一、影响细胞对铁死亡易感性的代谢过程 巯基依赖的氧化还原系统 含硫醇的三肽谷胱甘肽（GSH）是哺乳动物细胞中主要的抗氧化剂，也是GPX4的**底物。导致谷胱甘肽耗尽的条件直接影响GPX4的活性和稳定性，从而使细胞更易发生铁死亡。GSH的消耗也可以通过限制细胞内半胱氨酸（GSH生物合成的限速底物）来实现。内源性半胱氨酸主要是通过GSH-或硫氧还蛋白还原酶1 (TXNRD1)介导的胱氨酸还原而产生的，胱氨酸主要通过Xc-系统从细胞外空间输入。 细胞内半胱氨酸至少可以通过转硫途径提供。在肝细胞中同时缺乏Txnrd1和谷胱甘肽二硫还原酶(GSR)的小鼠，尽管在减少胱氨酸方面效率低下，却因为通过转硫化的膳食蛋氨酸提供了半胱氨酸。用erastin处理多日的卵巢癌
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CSF1R基因敲除小鼠助力HDLS疾病研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周二会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是脑白质病的重要元凶——CSF1R。 基因基本信息 CSF1R中文名称为集落刺激因子1受体，也可以称为CD115，控制巨噬细胞的产生、分化以及功能。该基因的突变与乳腺癌、慢性粒细胞白血病等多种类型的癌症发生相关。在这些肿瘤的发生过程中，经常可以观察到CSF1R表达量或者功能的增加。如果从家族性的CSF1R突变角度来看，该基因的与一种遗传性神经罕见病——伴球状体遗传性弥漫性白质脑病（HDLS）具有密切相关。该基因位于人类的5号染色体上，共有24个外显子，氨基酸数量为972个。 表1. CSF1R的基本信息 备注：标有√的意为赛业红鼠资源库有该种保存状态的小鼠 CSF1R与伴球状体遗传性弥漫性白质脑病 HDLS是常染色体显性疾病，主要表现为成年后开始的认知障碍、行为和情绪改变，轻度瘫痪、帕金森和癫痫样病变等。一种说法认为该基因导致了10%的脑白质病。HDLS于1984年在瑞典的一个家系中被发现，但与CSF1R之间的关系直到2011年才首次被确定。在二代测序技术大规模应用之前，该疾病由于表型的多样性常常会与其他的疾病混淆，造成误诊。该疾病发病率较低，且目前的研究大多来源于在日本（23个家系）、欧洲（36个家系）和美国（26个家系），中国在截止2020年中也提供了10个家系的研究数据。通常来说，HDLS的发病时间大约在40-50岁之间，诊断后的患者的生存期为7年。且女性往往早于男性，原因尚不清楚，不过在患病率上不同性别没有差异。在脑成像上，除了白质异常，胼胝体变薄，白质弥漫性病变和脑钙化是标志。该蛋白在大脑小胶质细胞中表达丰度较高。其配体(CSF1和白细胞介素-34)与CSF1R结合，在细胞
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样品溶剂浓缩提纯的四种不同常用方法简介
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
我们都知道做农残分析、药物筛选、液相、气相等实验与质谱分析前处理，需要对样品溶剂进行浓缩，那么蒸发、干燥、浓缩和纯化的方法，常用的有哪些你们知道吗？ 一、气流吹蒸法 气流吹蒸法是将空气或氮气吹入盛有净化液的容器中，不断降低液体表面蒸气压，使溶剂不断蒸发而达到浓缩的目的。此法操作简单，但效率低，主要用于体枳较小、溶剂沸点较低溶液的浓缩，但蒸气压较高的组分易损失。对残留分析，由于多数待测组分不是太稳定，所以一般是用氮气作为吹扫气体。如需在热水浴中加热促使溶剂挥发，应控制水浴温度，防止被测物氧化分解或挥发，对于蒸气压高的农药，必须在50℃以下操作，最后残留的溶液只能在室温下暖和氮气流中除去，以免造成农药的损失。 二、减压浓缩法 有些待测组分对热不稳定，在较高温度下容易分解，采用减压浓缩，降低了溶剂的沸点，既可迅速浓缩至所需体积，又可避免被测物分解。常用的减压浓缩装置为全玻减压浓缩器，又称kD浓缩器，这种仪器是一种常用的减压蒸溜装置，这种仪器浓缩净化液时具有浓缩温度低、速度快、损失少以及容易控制所需要体枳的特点，适合对热不稳定被测物提取液的浓缩，特别适用于农药残留分析中样品溶液的浓缩。此外，还可用作溶剂的净化蒸馏之用。 三、旋转蒸发器浓缩法 旋转蒸发器通过电子控制，使烧瓶在适宜的速度下旋转以增大蒸发面枳。浓缩时可通过真空泵使蒸发烧瓶处于负压状态。盛装在蒸发烧瓶内的提取液，在水浴或油浴中加热的条件下，因在减压下边旋转、边加热，使蒸发瓶内的溶液黏附于内壁形成一层薄的液膜，进行扩散，增大了蒸发面枳，并且，由于负压作用，溶剂的沸点降低，进一步提高了蒸发效率，同时，被蒸发的溶剂在冷凝器中被冷凝、回流至接收瓶中，因此，该法较一般蒸发装置蒸发效率成倍提高，并且可防止暴沸、被测组分氧化分解，蒸发的溶剂在冷凝器中被冷凝，回流至溶剂接收瓶中，使溶剂回收十分方便。旋转蒸发浓缩器由机械部件、电控箱和玻璃
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MRTX849是KRAS G12C抑制剂
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
MRTX849 是一种有效，口服可用，突变选择性的 KRAS G12C 共价抑制剂，具有潜在抗肿瘤活性的。MRTX849 在半胱氨酸 12 残基处与 KRAS G12C 共价结合，将蛋白锁定在非活性的 GDP 结合构象中，并抑制 KRAS 依赖性信号转导。 MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务 我们将采用定制合成服务的方式为您快速提供所需产品和技术服务 生物动态 MRTX849的体外研究 MRTX849 （0.1-1000 nM; 3天/2D条件，12天/3天条件） 对DRAS G12C细胞系的生长有明显的抑制作用，其IC50 在 2D 条件下为 10~973 nM，3D 条件为 0.2~1042 nM MRTX849（0.24-1000nM; 24小时）抑制KRAS依赖的信号转导靶点，包括ERK1 / 2磷酸化（Thr202 / Tyr204上ERK1;的pERK），S6磷酸化 MCE 尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。 细胞活力测定 细胞系：MIA PaCa-2、H1373、H358、H2122、SW1573、H2030、KYSE-410 细胞（G12C）；H1299 （WT）； A549 （G12S）、HCT116 （G13D） 细胞 专注：0.1, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM 孵化时间：24小时 结果：使用 IC 抑制绝大多数 KRAS G12C 突变细胞系的细胞生长50 2D 格式的值介于 10 和 973 nM 之间，3D 格式的值介于 0.2 和 1042 nM 之间。 底层研究 MRTX849 （1-100 mg/kg；口腔灌胃。；每日一次至第 16 天） /天之间 MCE 尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。 动物模型：MIA PaCa-2 模型（6-8 周龄、雌性、无胸腺裸 Foxn1 nu 小鼠） 剂量：1、3、10、30 和 100 毫克/公斤 给药方式和频次：口服灌胃；每天直到第 16 天 结果：在最早的**后肿瘤测量中观察到快速肿瘤消退，30 和 100 mg/kg 组中的动物在研究第 15 天表现出完全反应的证据。在研究第 16 天停止给药，100 mg/kg 组中的所有 4 只小鼠在研
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Sotorasib是KRAS G12C抑制剂
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
Sotorasib （G-10） 一种临床的，活生物可利用的，AMKRASKRAS G12C共价。Sotorasib将KRAS G12C锁定在非动态GDP约束。状态Sotorasib是开发的第一个KRAS G12C 使 KRAS G12C 消退。 MCE 的所有产品仅是医学科学研究或药证，我们不为任何个人用途提供产品和服务 我们将采用定制合成服务的方式为您快速提供所需的产品和技术服务 生物动态 Sotorasib的体外研究 在细胞检测中，Sotorasib （AMG-510） 共价修饰 KRAS G12C 并抑制 KRAS G12C 信号传导，如所有KRAS p.G12C突变细胞系中 ERK1/2 （p-ERK） 的磷酸化所测量的 Sotorasib （AMG-510; 1-10 μM; 72 小时） 也有效地削弱了 NCI-H358 和 MIA PaCa-2 的细胞活力和 IC50≈0.006 μM 和 0.009 μM，分别。非 KRASG12C 系对 Sotorasib （IC50>7.5 μM） MCE 尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。 细胞活力测定 细胞系：NCI-H358 和 MIA PaCa-2 细胞 专注：1-10 微米 孵化时间：72小时 结果：NCI-H358 和 MIA PaCa-2（IC50≈0.006 μM 和 0.009 μM）。 底层研究 在临床前肿瘤模型中，Sotorasib （AMG-510） 快速且不可逆地与 KRAS G12C 结合，持久抑制丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信号通路。Sotorasib（口服；每天一次）能够在 KRAS G12C 癌症小鼠模型中诱导肿瘤消退 MCE 尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。 本文来源于：https://www.medchemexpress.cn/AMG-510.html
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基因敲除细胞的相关问题及解答
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
在我们研究基因功能的时候，基因敲除（Knock out，KO）是实现基因loss of function的重要调控方式。相比于传统的基因干扰（RNAi）技术，基因敲除可完全消除目的基因的表达，最终使其蛋白完全不表达或功能彻底丧失，也让我们可以更好地观察细胞表型的变化。 但对于基因敲除细胞模型你可能存在许多疑惑，赛业生物细胞生物学产品经理整理了部分关于基因敲除细胞模型大家常问的问题并做出了解答。看看你的问题是否已在下面得到解答。如果你还有其他问题需要解答，欢迎联系我们。 Q1 实现基因loss of function，我是要做敲低（RNAi）还是敲除？ A: 1）当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或在细胞转染后的cell pool阶段检测效率呈显著下降趋势，即可判定可能出现敲除致死的情况，建议用RNAi； 2）由于存在部分强功能蛋白，即使表达下调了，仍然有较强的功能，如果RNAi始终做不出表型，但从有关信息推测这个基因很大可能性会出表型，建议做KO；另外，研究目的基因处于非转录区域，或者目的基因有很强的转录效率，也是无法用RNAi进行有效干扰的，则只能做KO，且KO细胞更适合进行回补实验； 3）最后，敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用RNAi做了基因敲低，观察到细胞表型的变化后，仍然可以进一步做敲除，让实验结论更加有说服性。 Q2 KO单克隆与KO cell pool的区别？ A: KO单克隆是指所有细胞均由一个测序验证的纯合子细胞增殖而来的，所有细胞的基因型都是一样的。KO cell pool是指没经过单克隆化和筛选的细胞池，因此可以理解为这群细胞中包含KO纯合子，杂合子和野生型，我们在拿到KO cell pool后须根据后续的实验需求挑取单克隆。 当需要去除细胞群体干扰因素的时候，推荐使用单克隆稳定细胞株，其基因组背景相对单一，对实验结果干扰因素小。当进行系统生物学研究时，需考虑细胞群体因素，同时由于不同细胞个体差异大，而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞行为可能不一致，所以许多实验使用
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美国计量院研讨会关于细胞**产品活率测量技术开发探讨重点汇总
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
引言 继2017年美国国家标准与技术研究院（NIST, 简称美国国家计量院) 和食品与药物管理局（FDA）举办了一场专注于细胞计数的研讨会后，2020年12月15日，NIST和Nexcelom Bioscience联合举办了一场关于细胞活率的研讨会。超过40位细胞**行业的相关人员参加了此次研讨会，共同探讨了当前细胞**产品活率测量领域面临的挑战。会议讨论结果发表在了Cell & Gene Therapy Insights. 以下正文是文献的全篇翻译。 与会者一致认同细胞活率测量方法的开发必须遵循fit-for-purpose （量体裁衣）的原则，选择符合既定目的与既定用途（比如细胞计数传代，细胞杀伤实验和确定CTP的剂量和纯度）的方法。 一个fit-for-purpose的活率测量方法必需综合考虑生物学指标的选择（细胞膜通透性、代谢水平、分子标志物等），细胞样本的属性（红细胞残留、聚集程度等），和方法的性能标准（准确度、精密度、耐用性等）。 测量方法的选择会影响细胞活率的结果，比如1）由于样本中存在红细胞残留，明场成像和台盼蓝染色将对原代细胞样本的活率测量产生显著影响；2）台盼蓝染料和染色时间会影响死亡和濒死的免疫细胞群；3）基于液流系统的机械应力会在测量过程中改变细胞活率。 通过实施控制策略可以提高活率测量的置信度。NIST演示了针对三种基于图像原理的测量方法的控制策略，用以监控和应对由测量过程中特定节点引起的潜在变化。 对照材料，如商品化的参考微珠和实验室制备的固定死细胞样本，可用于建立细胞活率测量中的控制策略。不过目前还尚未有任何一类参考物质被认证可充分代表各种类型的细胞样本。对照材料的属性范围应该与待测细胞样本的属性范围一致。 细胞活率的结果报告应包含测量使用的方法和所测生物指标的信息。例如，当报告一个细胞样本的活率为70%时，需附加更具体的信息（比如用基于成像分析原理的AO/PI染色法测得）。 细胞活率测量的通用标准尚在开发中。一套支持选择、开发和验证fit-for-purpose的细胞活率测量方法的
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Western Blot实验中各转膜方法优缺点分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
WB，蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。 转膜（Transmembran）是将电泳后分离的蛋白质转移到固相载体（PVDF膜或NC膜）上的过程。通常有两种方法，毛细管印迹法和电泳印迹法，常用的电泳印迹法有湿转和半干转两种。两者基本原理相同，只是在用于固定胶/膜叠层和施加电场的装置不同。近些年，有些公司也推出了快速转膜的仪器，有的也得到了一部分用户的认可。这些转膜方法各有什么优缺点，我们将从多方面分析一下。 湿转 湿转是将胶/膜叠层装置浸入缓冲液中，在胶/膜叠层的两侧加电场，电流会从胶/膜叠层中穿过，使带电的蛋白在电流的作用下转移到膜上。电流除了从胶/膜叠层穿过，还可以从缓冲液的其他区域流过，加上胶/膜叠层的电阻也比其他区域的电阻大，大部分电流优先从没有胶/膜叠层区域的缓冲液中流过，也就是说作用到胶/膜叠层的有效电流是很少的。再者，随着转膜时间的增加，缓冲液中的有效离子的浓度也会不断地降低，表现为恒流转膜时，电压会不断上升，恒压转膜时，电流会不断降低。这就导致了湿转的时间很长，一般在1-2个小时，但是慢也导致了结果的均匀和稳定。 半干转 半干转是用浸满转膜缓冲液的滤纸夹住胶/膜叠层装置，组成三明治结构，在这个三明治结构的两侧加上电极，形成电场。这时电场只作用在三明治结构上，因为三明治结构周围没有缓冲液，所以电流不会侧漏。几乎所有的电流都经过了胶/膜叠层，所以半干转的效率很高，速度很快，一般在半小时以内。但是，由于半干转用到的缓冲液很少，只有两侧滤纸浸入的一些缓冲液，这就导致了半干转缓冲液中有效离子的浓度衰
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基于无人驾驶航空器系统(UAS)的植物表型分析方法技术水平综述
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
无人驾驶航空器系统(UAS)是一种特别强大的植物表型分析工具，由于具有采购和部署价格公道、操控简便灵活、可以无缝融入各种规模的表型网络(Figure 1)、能够通过改变载荷轻松实现传感器多样化(Table 2)等优势，其在植物研究和育种中的应用愈发广泛。大多数用于植物表型的飞行器都可以归于由国际民用航空组织(ICAO)所定义的“遥控飞行器系统(RPAS)”概念之中，根据使用的国家和地区的不同，这些设备的名称略有不同。因此为了避免歧义，该文将“无人机”、“无人驾驶飞行器(UAV)”等统称为了“无人驾驶航空器系统(UAS)”。 近日,Plant Phenomics刊发了题为UAS-Based Plant Phenotyping for Research and Breeding Applications 的研究论文，该综述全面地介绍了当前基于无人机的表型分析方法的技术水平，降低了植物研究和育种领域研究者初次使用无人机进行表型分析的难度。 Figure 1: UAS across phenotyping scales, sensing levels, and ground sampling distance (GSD). Image is for illustration purposes and not to scale. Table 2: Main sensor types mounted as UAS payloads. 在使用无人驾驶航空器系统时，使用者必须从植物科学的角度出发做出多项技术决策，来确保在后续分析中可用的信息最大化。这些关键的技术决策包括但不限于：应该选择何种无人机及传感器套件？部署及数据处理的关键步骤有哪些？在这个方向里面有哪些工作已被完成？目前无人驾驶航空器系统在植物表型分析中最先进的应用是什么？有哪些问题、趋势和挑战？ 为了解答以上问题，该文章回顾了基于无人机的表型平台在设备部署、数据采集、数据管理、数据存储及分析方面(Figure 2)的最新技术，讨论了当下亟需解决的技术问题，确定了植物研究界需要了解的无人驾驶航空器表型方向的未来趋势，并指出了哪些关键的植物科学和农艺问题将会在下一代基于无人驾驶航空器的成像及数据分析方法中得到解决。 Figure 2: UAS workflow pipeline: dat
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图解线粒体基因的遗传多样性分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
遗传多样性又称基因多样性，是生物多样性的核心组成部分，也是物种多样性和生态多样性的基础。线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) 为母系遗传(即细胞质遗传)，具有基因组结构简单，且不发生重组现象，突变固定后形成的多态性位点既能反映出群体遗传特征，用于分析种群分化和种属关系等。 01 服务流程 02 分析内容 序列多态性分析 群体遗传多样性 群体单倍型分析 遗传分化和基因流 Tajima's D和Fu's FS中性检测 03 分析方法 （方法较多，此处仅供参考） BioEdit和clustalx软件对Sanger测序结果进行分析整理； MEGA 4.0软件统计序列的碱基组成与含量、碱基信息位点数量，计算遗传距离，并构建基于K2-P的邻接(NJ)系统发育树； DNAsp 5.10软件制作核苷酸岐点分布图，统计变异位点位置，单倍型分布等； Arlequin 3.1软件精确计算Fst值，Tajima's D 和Fu's FS中性检验，以及进行AMOVA分析等； PopART 1.7 软件进行单倍型中介连接网络( median-joining) 分析。 04 分析案例 （以COI基因检测3个群体为例） 序列碱基组成：分析不同群体中基因序列的碱基组成差异。 分析结论：A+T含量(70.5%)明显高于C+G含量(29.5% )，碱基组成具有明显的偏向性。 表1.COI基因片段的序列组成 群体遗传多样性：通过对不同群体的基因序列突变类型进行分析，计算出群体间单倍型多样性及核苷酸多样性。 分析结论：共定义了33个单倍型，单倍型多样性平均为0.990，核苷酸多样性平均为0.10851。群体间遗传多样性大小差异不大。 表2.COI基因的遗传多样性指数 群体单倍型分析：在单倍型分析的基础上进行分析，主要体现单倍型在各个群体的分布情况，各个单倍型间的进化关系，各个群体间的关系。 分析结论：3个群体的COI基因序列明显聚为2个聚类簇，这3个群体间存在着一定的基因交流，并且POP1与POP2、POP3之间存在明显的遗传分化，POP2和POP3之间的遗传分化较小。 图1.基于COI基因序列的构建单倍
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检测抗体间接法操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度. 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： 1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。 3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 4）加底物显色 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也
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检测抗原最常用的双抗体夹心法操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体**分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，H
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