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Cas9-CKI小鼠繁育原则与路线讲解
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
随着基因工程技术的发展，针对特定基因研究的小鼠模型构建也越来越成熟。但是，构建成功的模型小鼠要用于实验，还需要漫长的繁育之路要走。行百里者半九十，你以为模型构建成功了就结束了吗？NO NO NO！繁育是提供合格实验材料过程中的临门一脚。 特别是对于CKO、CKI这些组织特异性的模型小鼠，需要与cre工具鼠配繁，才能得到在特定组织敲除或敲入的目的小鼠。而基于cas9[1]技术制作的CKI小鼠，对于不同的构建策略，繁育之路也是不同的。这一点需要涉及Cas9-CKI繁育工作的研究人员注意。否则，三周怀胎，一朝分娩，含辛茹苦到断乳，最终还是宝宝心里苦。 Cas9-CKI小鼠的构建过程分体外和体内两个阶段： 1.F0 代繁育原则： 1) 利用CRISPR/Cas9系统打靶获得到的小鼠，由于Cas9系统在受精卵阶段对基因进行编辑，在F0代可能出现多种基因型并存的状态。Cas9技术制作的小鼠不带有Neo标记基因，但是会产生多条line，F0要分line繁育。 2) 阳性F0代小鼠和野生型背景鼠回交后，所得到的后代基因型将会单一。 3) F0代小鼠之间不能相互交配。 2. F1代及F1代之后繁育原则： 1) 由F0代小鼠和野生型背景鼠交配得到的后代小鼠称为F1代。 2) 阳性F1代小鼠可用于保种建系。 Cas9-CKI小鼠的模型构建主要有2个策略，虽然繁育原理不同，但是其繁育路线大致相同；下面跟大家介绍一下两个不同构建策略制作的Cas9-CKI小鼠的繁育路线。 构建策略I 使用loxp-stop-loxp系统[2]进行条件性表达靶基因时（如下图），在未删除loxp片段之前，小鼠表达野生型基因，在删除loxp片段后，小鼠表达点突变后基因。 配繁原则是配cre工具鼠，删除stop元件，构建KI小鼠或者组织特异性KI小鼠。 构建策略II 使用loxpmut-cre系统[3]进行条件性表达靶基因时（如下图）， 配繁原则是CKI小鼠配cre工具鼠，野生型的loxp之间的基因首先发生倒置，使得lox2272位点变为同向，同时发生片段删除，表达预期的靶位点，所以通过配繁不同
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定量Western Blot内参质控的掌握技巧
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
定量western blot 一定要有内参质控（上） Western Blot是生物修炼的一大实验，现在不做定量Western Blot，都不敢自诩学霸的了，暗暗擦汗的有没有？ 在讨论如何从Western Blot中获得定量数据之前，先定义一下我们所说的“定量”是什么意思是非常有用的，何为定量，必须符合下列准则： ♦ 使用一个定义的过程进行检测，即Western Blot。 ♦ 这个过程产生一个可重复的结果，即是精确度。 ♦ 测量反映了一个“真实”的结果，即是准确度。 定量Western Blot除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，是一定要检测内参的，也就是内部参照（Internal Control），目的是校正蛋白质转印和上样过程中导致的实验误差，保证实验结果的准确性。对于哺乳动物细胞表达来说，内参通常指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用其作为参照物。 在发表文章时，Western Blot实验结果需内参进行校正，但仍有一些科研人员在实验中忽略内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范是比较各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，例如BCA方法对还原性试剂兼容性差，Bradford方法对去垢剂兼容性差，A280方法影响因素比较多，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对转印和上样步骤产生的误差进行校正。 谁能看出这是“GAPDH” 那么如何实现Western Blot实验中内参的检测呢？简单讲就是在WB过程中，除加入靶标蛋白的抗体外，也加入内参蛋白的抗体，同时实现靶标蛋白和内参蛋白的检测。通过归一化，可以校正上样误差和转印误差，从而获得比较准确的Western Blot结果。 使用荧光方法进行定量Western Blot检测，可进行多重检测，荧光信号稳定，持久，影响因素少，不用剥离膜和剪膜，实验条件一致，更容易获得定量Western Blo
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胎盘加速序列1（PAS1）-揭示羊膜动物社会阶层的形成机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
社会等级存在于许多动物中，包括昆虫、鸡、哺乳动物和灵长类动物。井井有条的社会体系使动物能够适应各种生态系统。在理解社会等级制度的遗传学方面，尤其是在昆虫方面，最近取得了许多成就。然而，哪种遗传改变导致胎盘哺乳动物的社会等级的产生，以及是否存在调节羊膜动物社会等级的一般遗传机制尚不清楚。 近期，中科院上海营养与健康研究所计算生物学重点实验室李海鹏课题组在Cell Research 杂志上发表了题为”Accelerated evolution of an Lhx2enhancer shapes mammalian social hierarchies“的研究论文，开发了一种新的检测正选择方法，并揭示了PAS1-Lhx在羊膜动物中建立社会阶层的至关重要的作用。 胎盘哺乳动物祖先谱系中具有加速进化的序列（正选择的标志）可能参与社会等级和胎盘哺乳动物特定性状的调节。因为现有方法只能检测保守和假定功能区域上的加速进化，而且这些方法通常只识别出一种人类加速进化序列，因此研究人员开发了一种新的检测正选择方法和相应的软件Kung-Fu Panda (KFP)，可以可靠、准确、快速地筛选整个多基因组比对（包括非保守和保守序列）并查明加速进化区域。 全基因组扫描结果显示，正选择作用最显著的区间位于Lhx2 基因上游的非编码区，并被命名为胎盘加速序列1（PAS1）。多项证据表明，PAS1是参与大脑发育的转录因子基因Lhx2的增强子。分离自各种羊膜动物的PAS1在体外表现出不同的顺式调节活性，并在小鼠胚胎的神经系统中不同程度地影响Lhx2的表达。 PAS1基因敲除小鼠（赛业生物构建）缺乏社会等级，因此，PAS1的调节活性对于羊膜动物建立组织良好的社会体系至关重要。PAS1敲入小鼠模型（wPAS1基因敲入小鼠由赛业生物提供）表明，PAS1决定了成年小鼠的社会优势和从属地位，并且突变的PAS1甚至可以改变社会地位。所有纯合突变小鼠的睡眠行为，运动协调能力和强度均正常。因此，PAS1-Lhx2对于羊膜动物建立组织良好的社会体系至关重要，并且对PAS1进行正选择在哺乳动
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组织驻留记忆T细胞与肿瘤免疫**
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
组织驻留记忆T细胞（tissue- resident memory T Cell，TRM)） 组织驻留记忆T细胞（tissue- resident memory T (TRM) ）是一个特殊的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）亚群，能够无限期地驻留在组织中，并能够对其同源抗原作出快速的免疫反应的TIL。 CD103(整合素αe)是TRM细胞的识别标志，在大多数研究中发现与CD69和/或PD-1的共同表达。肿瘤中TRM细胞的存在与乳腺癌、黑色素瘤患，肺癌，卵巢癌，头颈部鳞状细胞癌，宫颈癌，子宫内膜腺癌，结肠癌，膀胱癌，或胰腺癌无病生存（Disease-Free Survival，DFS）和/或总生存率（Overall Survival，OS）的改善有关。 CD8TRM细胞不存在于循环系统中，而是稳定广泛地存在于人类和小鼠组织中。最初在皮肤和肠道中被鉴定，主要表面marker：CD103和CD69。CD69是T细胞活化的标志，在T细胞受体(TCR)连接1小时内可检测到，下调S1PR1表达，降低S1PR的作用，降低淋巴细胞从组织流出。 CD103和整合素β7形成E-钙粘蛋白的异二聚体受体，在上皮肿瘤细胞和非恶性上皮细胞上表达。因此，CD103TRM细胞粘附在上皮组织上，这有助于它们在外周组织中的保留。但是CD103也表达其他CD4+T细胞，循环T细胞可以在细胞因子或TCR刺激后表达CD69。因此，仅仅依靠CD103和/或CD69的表达来鉴定CD8T RM细胞可能不准确。 免疫检查点如PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3，在多种实体肿瘤中分离出来的TRM细胞高度表达。因此TRM细胞是免疫检查点抗体药物的靶细胞群体，并可能有助于恢复抗肿瘤细胞的免疫反应。（点击参考阅读：免疫**核心概念：CD8T细胞耗竭（T Cell Exhaustion）。 与耗竭T细胞（Tex）细胞相似，TRM效应表型的细胞虽然表达高水平的免疫检查点蛋白；然而，不同之处在于，当重新暴露于适当的抗原时，TRM会恢复很强的免疫功能。与非TRM细胞相比，Tim-3+PD-1+TRM细胞具有克隆扩展，富集，细胞增殖和细胞毒性相关的基因转录本。 因而单凭某些免疫检查点表达而将一种状态描述为“衰竭”可能过于简单，不能准确的反应细
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如何读懂空间转录组测序数据结果
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
空间转录组学研究是很多老师非常感兴趣的一种最新组学研究技术。做完空间转录组测序后，能拿到哪些结果，是不是存在买家秀和卖家秀的差距？本期，生物芯片生物信息团队利用已发表数据的实操分析，为大家展示空间转录组测序数据结果。 我们分析了来自10x Genomics 的Visium技术生成的某肿瘤生物学数据集，SC_S1 、SC_S2两个样本，数据分析结果及展示如下： 1. 单样本降维聚类及可视化 空间转录组测序结果是拿到包含空间位置的每个spot的转录信息。因此，根据结果，我们可以对spot为单位的数据进行降维聚类及组织区域分布匹配： 图1 UMAP图（左）和组织学图像（右） 左边是降维聚类展示图，总共分成11个亚群，右边是将11个亚群分布回归到组织块上。 2. 特定区域定位展示 根据空间分布特点，选择感兴趣的类群，进行单独着色定位： 图2 不同亚型空间定位图 3. 多样本叠加可视化 对来自不同样本的数据，可以将这些结果进行合并展示，本结果为两个组织区域接近样本，合并后的UMAP图如下： 图3：多样本共同可视化UMAP图 左图为不同颜色代表不同样本，右侧为13类不同亚群分类图 4. 不同类型cluster细胞类型标记 该部分与常规单细胞转录组测序数据类似，可以根据特征marker基因，对潜在的亚型类型细胞进行标记，如下： 图4 细胞类型分类图 5. 多样本并行分布UMAP可视化 对于多个样本，可以进行单独的分布展示，以从全局角度对两个样本进行对比分析，如下图两个不同样本的UMAP图： 图5 多样本并行UMAP图可视化展示 6. 同基因不同样本特征分布可视化 有了上述的分布图性，可以对某一个特征marker基因，在不同样本中的表达进行可视化展示： 图6：同个基因在不同样本的表达特征图 7. 多样本基因表达提琴图展示 当然，为展示基因在不同样本和不同类型亚群分布情况，可以以提琴图进行展示： 图7：样本marker基因的提琴图 不同颜色代表不同的样本，横坐标为不同亚群，纵坐标为基因表达丰度。 8. 多
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多酶恒温核酸快速扩增技术MIRPA的引物与探针设计指导
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
国产MIRPA替代新一代等温扩增检测技术RPA 近期,顶级学术期刊连发两篇顶级论文，上半年引爆生物圈的华人科学家张锋教授团队又有新动作!这次,他在一月内,分别在《Nature》、《Science》连发两篇论文!他将CRISPR-Cas13a改造成了灵敏度达到了阿摩尔级(aM,10的负18次方摩尔每升),可以检测单分子的SHERLOCK技术。而这其中,RPA起到了不小的作用。 RPA,即重组酶聚合酶扩增技术,是在由多种酶和蛋白的参与下,在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术,被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。是英国TwistDx公司开发的，该公司通过突破等温DNA扩增，开发的重组酶聚合酶扩增专利技术（RPA），被誉为DNA诊断领域的革命性创新。 安普未来生物科技有限公司经过十年技术沉淀，以代表未来技术趋势的多酶恒温快速扩增技术，MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）。 MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术， 基本原理是：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体 Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白 SSB 的帮助下，侵入双链 DNA 模板；在侵入位点形成 D-loop 区域，并开始对 DNA 双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体 Rec/ssDNA 解体的同时，聚合酶也结合到引物的 3’末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。 荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。 图 1：MIRA 技术原理图示 ★引物设计 建议使用长度在 30-35bp 的引物，引物过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度（特殊情况下设计较长 引物比较困难的序列，引物长度可缩短至 25 bp，但**不少于 25 bp）；引物序列要求： 1.碱基排布随机性高，GC 含量在 30%-70%之间； 2.扩增片段避免形成二级结构而影响扩增； 3.扩增片段长度建议在 150-300 bp，通常
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PCR的替代技术-RPA全攻略疑难解答
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
PCR替代技术，RPA全攻略之疑难解答 重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。 RPA反应需要在怎样的温度下进行? 标准TwistAmp®试剂盒的运行温度在37°C - 42°C之间。温度超过42°C会使酶的活性受到影响。RPA反应在低于37°C的条件下也能进行，不过TwistAmp®试剂盒已经针对反应速度进行了优化，不一定支持超出范围的温度条件。为了获得更好的效果，TwistDx公司推荐用户在40°C下使用于逆转录试剂盒。 RPA反应能实现多重化么? 可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量(nmol)**不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。 RPA反应需要在特殊仪器上进行么? 不需要。对TwistAmp®基础试剂盒和nfo试剂盒而言，只要温度能控制在37-42°C之间就行。进行实时监控的体系(如TwistAmp® exo试剂盒)，需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。 RPA反应能对模板进行定量么? 可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。 此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。 扩增产物能
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云序Mol Cancer成果教您如何写出外泌体的10分文章
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
文章导读 2020年3月20日，云序客户上海交通大学附属第一人民医院田聆教授课题组在高分期刊Moleular Cancer杂志（影响因子10.679）发表了关于外泌体在胰腺癌肿瘤再生长中的研究。肿瘤再生长是放射**失败的主要原因。以往的研究表明，死亡的肿瘤细胞通过促进残留的肿瘤再生细胞(TrCs)的增殖，在肿瘤再增殖过程中起着至关重要的作用。然而，TRCs在放疗后也会遭受DNA损伤，并可能在垂死细胞释放的增殖因子的刺激下发生有丝分裂错误。因此，本研究打算找出这些自相矛盾的生物学过程是如何发生的，以降低放疗后肿瘤的再增殖可能。接下来，小编就带大家一起解读这篇高分文章。 发表期刊：Mol. Cancer 影响因子：10.679 发表日期：20200320 实验方法：全转录组测序、外泌体miRNA测序（云序提供测序服务） 文献链接：Dying tumor cell-derived exosomal miR-194-5p potentiates survival and repopulation of tumor repopulating cells upon radiotherapy in pancreatic cancer 文章内容 （1）受辐射的垂死肿瘤细胞释放的外泌体可动态增强肿瘤的繁殖 首先作者通过相关研究证明受辐射的垂死肿瘤细胞分泌的外泌体在辐射后期会促进增殖。为了弄清原理，作者对辐射前后的胰腺癌细胞进行了全转录组测序（本实验云序提供）。并进行了GO分析，发现差异基因多富集在与细胞外囊泡和外泌体调控有关的条目中（图1a）。接着作者进一步研究发现，与未辐照的胰腺癌细胞相比，辐照过的胰腺癌细胞的外泌体释放量增加（图1b）。为了验证外泌体在存活的肿瘤细胞中的直接作用，作者在体外进行了菌落形成试验。放射后，用垂死的肿瘤细胞来源的外泌体处理的癌细胞的集落形成能力显着增强（图1g）。结果表明，来自垂死的肿瘤细胞的外泌体可以促进放射后的细胞存活。 作者进一步探讨了外泌体对胰腺癌的作用，作者在胰腺癌异种移植（PDX）小鼠模型中进行了体内实验。发现辐照的PDX肿瘤能加速种群重现（图1h）。当PDX小鼠同时用GW4869（外泌体
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晚期结直肠癌中NKG2D-CAR基因修饰的NK细胞过继输注的研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率和死亡率分别位居第二位和第三位。结直肠癌发病隐匿，早期症状不明显，约20%的结直肠癌患者在诊断时就已发生远处转移。对于转移病灶不可切患者的**主要以姑息性化疗和靶向**为主，其**效果差强人意。 2018 年诺贝尔医学及生理学奖获奖者美国德克萨斯大学的免疫学家詹姆斯·艾利森（James Allison）和日本日本京都大学的免疫学家本庶佑，他们的研究提供了一种通过刺激免疫系统来对抗肿瘤细胞的癌症**方法，并且基于这些研究也开发出了相应的药物，人类在**肿瘤上已经取得了非常重要的突破。然而，由于肿瘤致病机理复杂、患者个体的差异性也很大，再加上环境因素的影响，最终的**效果仍然达不到人们的满意。广州医科大学附属第三医院徐学虎教授团队设想通过探索过继免疫细胞输注**的方向，以期能改善目前对晚期结直肠癌的**现状。 过继免疫细胞输注**是一种不同于免疫检查点抑制剂的新型的抗肿瘤免疫**模式。其中嵌合抗原受体T细胞免疫**（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T）被认为是当前最具前景的抗肿瘤**方式之一。而嵌合抗原受体NK细胞免疫**（CAR-NK）异曲同工之妙，将修饰的免疫细胞由T细胞变为NK细胞，而且有越来越多的临床前研究表明CAR-NK细胞同样具有显著的抗瘤能力。 徐学虎教授团队近日在医学1区杂志《Molecular Therapy》（IF：7.008）上报道了“NKG2D-CAR基因修饰的NK**结直肠癌患者的临床研究”的试验结果。这是一项单臂、开放，剂量递增的单中心的初期临床研究，共入组了3例经标准**失败的转移性结直肠癌患者。 在临床前研究阶段，鉴于包括结直肠癌在内的多种肿瘤细胞均高表达NKG2D配体的特征，而在正常组织中其表达含量很低或无，所以团队成员选择肿瘤相关抗原--NKG2D配体作为**靶点，并通过电穿孔的手段将NKG2D-mRNA转导NK细胞，成功构建了靶向NKG2D配体的CAR-NK细胞。 首先，徐学虎教授团队利用了NE
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浅谈新型冠状病毒（SARS-CoV-2)的来龙去脉
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
4月8日凌晨，有一群比跨年还要积极的人在期盼武汉重启的到来，这是抗击SARS-CoV-2战役中最辉煌的一刻，标志着我国疫情得到有效控制并且经济开始有序复苏。整整76天，我们迎来了胜利的曙光，但国外的疫情却愈演愈烈，呈加速扩散蔓延态势。为了防止输入性病例再次传染，我国各通商口岸以及人流通道均已采取了强有力的措施，可见新冠病毒在对生命构成严重威胁的同时也对各国经济造成了不可挽回的损失。 一、SARS-CoV-2的来源 通过传染病及流行病学调查，以及测序分析和比对，我国科学家发现了SARS-CoV-2最初来源于蝙蝠，但由于蝙蝠与人类的生活环境相隔甚远，要让病毒直接从蝙蝠传到人身上似乎也没有那么容易，于是中间宿主就成了科研界需要证实的课题，穿山甲？蛇？龟壳类？雪貂？猫？众说纷纭。关于猫携带病毒并在猫之间进行新冠传播已经得到实验证实，但是对于猫是否能够将新冠病毒直接传染给人，还需要更进一步的确证。 二、 SARS-CoV-2是什么 SARS-CoV-2是冠状病毒的一个分支，是由四种主要蛋白以及若干辅助蛋白包裹着遗传物质的正链RNA病毒，主要通过S蛋白与宿主细胞受体结合来介导病毒的入侵，决定病毒的组织和宿主嗜性。人类冠状病毒具有很高的基因组核苷酸取代率和重组能力，被认为是目前发展最快的病毒之一，而人类冠状病毒与多种严重程度不同的呼吸系统疾病相关，例如感冒、肺炎和支气管炎。包括此次疫情的罪魁祸首新冠病毒在内，已鉴定出有7种会引起人类呼吸系统疾病的冠状病毒：hCoV-229E、hCoV-NL63、hCoV-OC43、hCoV-HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2。除了呼吸系统外，肠道和神经系统也会受到这些病毒的影响。 SARS-CoV-2内部有一个螺旋对称的核衣壳，包裹着一个大约30kb左右的单链正向RNA基因组，在病毒复制周期中具有三种功能： ● 作为感染周期的起始RNA； ● 作为复制和转录的模板； ● 作为包装成子代病毒的底物。 三、SARS-CoV-2的的附着和侵入 SARS-CoV-2与SARS-CoV以及hC
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技术强则药物强-单个B细胞抗体制备技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
如今,单克隆抗体药物以其独特的作用机制及高效性,在肿瘤和自身免疫疾病的**中发挥了不可估量的作用,成为全球的研发热点，目前已有2400个单克隆抗体药物处于研发及商业化阶段。 1975年杂交瘤技术问世[1]。1986年鼠源单克隆抗体药物Muromonab的上市拉开了单克隆抗体发展的序幕。随后的50年，单克隆抗体药物经历了嵌合抗体-人源化抗体--全人源抗体四个阶段，产生了抗体偶联药物、抗体融合蛋白、单域抗体等多种新型抗体药物，标志着免疫疗法黄金时代的开启[2]。单克隆抗体药物的推陈出新归根于单克隆抗体技术的不断发展与创新。目前应用的抗体技术有：杂交瘤技术、噬菌体展示技术、天然全人源库技术和单个B细胞技术。 单个B细胞抗体制备技术原理 单个B细胞技术[3]是近年来新发展的一类快速制备单克隆抗体的技术，是根据每一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，以及每一个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性B细胞，通过单细胞PCR技术从单个抗体分泌B细胞中扩增IgG重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。这种方法保留了重链和轻链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全天然源性的特点，也成为了目前快速开发针对抗病毒感染性疾病抗体的重要策略。 单个B细胞抗体制备过程 图1 单个B淋巴细胞抗体制备过程[4] 1. 鉴定和分离单个B细胞 1）溶血斑块技术分选B细胞 溶血斑块技术原理[5]是抗原与抗体反应后，在补体作用下能使红细胞裂解形成溶血斑块，进而通过显微技术筛选和分离抗原特异性B细胞。该方法有点：方便、快捷、特异性好；缺点：红细胞容易受到温度、渗透压、酶等多方面影响，且溶血斑块技术分离的B细胞往往不能进行高通量分析和活细胞增殖。 图2 克隆单细胞免疫球蛋白VH和VLcDNAs产生特异性抗体的策略[5] 2）MACS法（磁珠分选法)分选B细胞 原理是基于抗原抗
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赛业抗体筛药第一期答疑合集
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
4月23日晚上八点，赛业生物开始了第一期课程，需要课件的老师可以关注赛业生物微信公众号，后台留言“第一期课件”。针对课程中，各位老师提出的问题，我们进行了收集整理，下文为课程中的问题与解答。 Q1： 想咨询下：如果用小鼠筛选药物的话，是不是还要用真病毒感染? A：一般用动物模型筛药，是要用到真病毒感染的或者临床分离株的。 Q2：可以讲一下目前关于不同冠状病毒感染宿主受体靶点的研究进展吗？ A：在昨天的课程已经有提到，不同冠状病毒的宿主靶点，HCoV-NL63、SARS-CoV、SARS-CoV-2冠状病毒受体都是ACE2，HCoV-229E、PEDV、PRCV冠状病毒的人类受体均是APN，MERS-CoV、HKU4特异性受体是DPP4，MHV结合CEACAM1等等，有些病毒与宿主细胞表面的糖受体结合以进行病毒附着，这个我会在第三期课程详细讲到。那么这里肯定有人会问道，关于不同病毒相同受体结合的方式是一样的吗？回答是不一样，这里简单提一下，S蛋白分为S1头部和与宿主细胞膜进行融合的融合茎S2两个功能部分，蛋白从融合前到融合后的构象改变受到多种因素的影响，比如说PH值、细胞进入细胞过程中的溶酶体蛋白酶，转化切割酶、弹性蛋白酶以及细胞表面蛋白酶等等。 PS:昨天有一位同学对上述回答提出了疑问， 今天就附上回答的出处吧~ 参考文献：Adriaan H.de Wilde,Eric J.Snijder et al, Host Factors in Coronavirus Replication, Current Topics in Microbiology and Immunology, 2018. Q3：你好，请问，我们机体都存在机体免疫，为什么病毒还很轻松的感染人机体，是怎么逃避人的机体免疫的呢？ A：免疫逃逸大家都知道，就是病原体逃避了机体免疫系统的识别，抗原发生突变，逃逸已建立的抗感染抗体的中和和阻断作用；也有的是病原体通过其结构和非结构产物，拮抗、阻断和抑制机体的免疫应答；第三种是干扰免疫效应。那么对于新冠病毒来说，是哪一种免疫逃避机制呢？具有正链RNA基因组的病毒只能在胞质中复制，精心
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新冠病毒基因组编码四种结构蛋白在疫苗抗体开发的广泛应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
俗话说“知自知彼，百战不殆”。新冠肺炎疫情在全世界的蔓延引起广大关注，研究及破解COVID-19的结构和功能对控制新冠病毒至关重要。全世界的研究学者也都在竭尽全力解析新冠病毒，助力疫苗研发。目前，各国科学家即时共享关于病毒的最新研究进展，让大家及时掌握最新发现，集全球之力共克时艰。对于新冠病毒（COVID-19）的基本结构，相信大家已经不再陌生。 COVID-19基因组编码四种结构蛋白，包括Spike protein (S蛋白)，Envelope protein (E蛋白)，Membrane glycoprotein (M蛋白) 及 Nucleocapsid protein (N蛋白)。S蛋白是一类很大的三聚体跨膜糖蛋白，其在病毒表面形成特殊的花冠结构。根据蛋白结构功能S蛋白可以被分成两个功能单位：S1 和 S2蛋白亚基，S1包含受体结合区域（receptor binding domain, RBD），负责识别和结合细胞受体，早前，中国科学院微生物研究所在国家微生物科学数据中心与社会广大科技工作者共享了2019新型冠状病毒蛋白（S蛋白）受体结合区域（RBD）和人受体ACE2复合物的晶体结构,首次揭示S蛋白与受体血管紧张素转换酶2（Angiotensin converting enzyme 2，ACE2）在原子层面相互作用；S2含有膜融合过程所需的基本元件，负责将S蛋白锚定在病毒膜上并介导病毒膜与宿主细胞膜的融合。所以S蛋白是介导病毒进入宿主细胞的主要蛋白，也是感染后引起宿主免疫系统产生中和性抗体的主要靶标。 M蛋白和E蛋白主要参与病毒的组装和装配，M蛋白是病毒体中含量最多的蛋白，保持病毒的完整形态，并与N蛋白相连接。病毒体中E 蛋白含量不多，具有与病毒聚合及释放相关的功能，而N蛋白起着保护基因组的作用，N蛋白的N端与C端均可与病毒RNA结合，N蛋白主要负责RNA的复制功能，常作为冠状病毒诊断检测工具，是免疫学快速诊断试剂的核心原料。 为应对新型冠状病毒的防治，Prospec开发了重组新型冠状病毒核衣壳蛋白S蛋白、RBD区蛋白、N蛋白、ACE2受体蛋白等系列重要蛋白，为新冠疫苗开发、中和抗体
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双调制叶绿素荧光仪--光合作用与藻类研究利器
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
由FL100，到FL200、FL300，再到FL3000、FL3500、FL6000，FL6000是由久负盛名的双调制叶绿素荧光成像技术的全新升级产品。 l 高解析度——测量解析每秒可达百万次（快速版，时间解析度1µs），标准版时间分辨率达4µs（25万次），全面采集叶绿素荧光瞬变动态（下图显示的protocols中，Thermoluminescence需选配光合热释光测量系统） ü瞬时荧光测量 üKautsky诱导效应 üQA再氧化动态分析 ü叶绿素荧光淬灭分析 üOJIP快速荧光动力学分析 üS状态转换（S-States）测量分析 üFFI（Flash Fluorescence Induction），单脉冲（STF单周转）、双脉冲（TTF）、多脉冲（MTF）激发及FRR（Fast Repetition Rate）叶绿素荧光动态测量分析 l高灵敏度——检测极限达100 ng Chl-a/l l多激发光：双色测量光，最高达3500µmol/s.m2可调制光化学光、170000µmol/s.m2脉冲光闪 l测量样品（藻类或叶绿体、类囊体等）可温度调控 l可同步测量光合作用（可选购标配Clark极谱氧电极或荧光光纤氧气传感器） l广泛应用于： ü藻类、浮游植物等光合作用研究 ü藻类等光养生物生理生态研究 üPSII光化学效率测量研究 ü水体藻类初级生产力评估 ü光合作用突变体筛选 ü生物胁迫、非生物胁迫光合生理研究，抗性筛选 ü生态毒理学、污染生态学、水体生态修复研究 l快速版FL6000克测量分析天线有效大小、连通性、异质性等
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细胞器荧光探针选购指南
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
前情回顾： 【1】您不曾了解系列：微管蛋白tubulin染色（活细胞），点击了解 【2】您不曾了解系列2：活细胞微丝F-actin染色（兼容固定细胞），点击了解 【3】您不曾了解系列3：活细胞DNA染色，点击了解 【4】您不曾了解系列4：活细胞脂质染色，点击了解 【5】您不曾了解系列5：SPY探针，全新一代的活细胞成像工具，点击了解 细胞质膜 细胞质膜 质膜是一种薄的半透膜，它将所有细胞的内部与其细胞外环境隔开，它由一个磷脂双层构成，该双层中嵌入了负责执行特定膜功能的蛋白质，例如离子通道，载体蛋白质和受体蛋白质。质膜为所有细胞提供结构支持和保护，并有助于多种细胞功能。它负责维持离子稳态，促进细胞可渗透离子和有机分子在细胞内外的移动，并且是细胞粘附，细胞间通讯离子传导性和细胞信号通路中不可或缺的组成部分。 Cellpaint™细胞质膜染料 Cell Navigator™细胞血浆膜染色试剂盒利用我们的Cellpaint™染料对质膜进行快速，均匀的染色，而没有荧光凝集素表现出的细胞类型差异。它们可用作高含量筛选（HCS）的分割工具，或用于细胞质膜染色以进行标准荧光显微镜检查。用甲醛固定后，还可以保持细胞膜上的荧光染色，从而可以与其他荧光染料或蛋白质多重染色。 Cell Navigator™细胞质膜染色试剂盒的优势： 高信噪比的明亮荧光 高光稳定性可稳定产生信号 适用于对悬浮或附着的活细胞中的质膜染色 广泛的哺乳动物细胞类型的质膜均匀染色 固定后在质膜上染色良好 提供绿色，橙色和红色荧光，以促进多色染色 产品选择指南 Cell Navigator™细胞质膜染色试剂盒 探针 Cellpaint™绿色 Cellpaint™橙色 Cellpaint™红色 应用 活细胞质膜的荧光成像 靶标 质膜 Ex / Em（纳米） 497/505 555/573 648/671 过滤器组 FITC TRITC Cy5
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