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酵母菌落PCR方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验介绍 问：我很沮丧。我最近在做巴斯德毕赤酵母，但转化后没有合适的筛选方法。如果我使用基因组，这将花费时间和金钱，并且由于我转移电的机会非常低，我只有1％-10％，因此我想使用菌落PCR进行筛选，但很难打破酵母壁。如果**不好，基因组将不会被释放，也不会有阳性结果。 我检查了一些数据，说使用反复的冻融方法，直接挑出单个菌落就足够了吗？也有人说蜗牛酶被用来帮助消化。我对此不太清楚，所以请帮助大虾。现在我真的为此受了伤！ 答：蜗牛酶提取DNA后，PCR效果非常稳定 二、酵母DNA的提取 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 PH标准缓冲溶液(PH=7.00±0.02) HC1482 2 磷酸盐-SDS电泳缓冲液 HC1305 3 乙酸钾 127-08-2 JT0883 4 无水乙醇 64-17-5 JT26000 5 异丙醇 67-63-0 JT25997 6 酚氯仿 865-49-6 JW0132 7 0.9mol/l 山梨醇 50-70-4 SS0003 8 50mmol/l Tris 77-86-1 SS1426 9 50ml插口离心管 F-EP500-C 10 YEPD培养基 HC0991 1.向新鲜细菌中加入150ul（200ul）i25（30）ul蜗牛酶（30mg / ml），于37度，10分钟（30分钟水浴，间隔5分钟，摇晃一次），以避免细胞沉到底部管。 2. 10000rmp离心10min，除去上清液，在沉淀物中加入缓冲液I250ul 3.添加25ul 10％SDS。 65度，30分钟水浴。 4.加入25ul 5mol / lKAC，冰浴60分钟（可放置4度冰箱） 5. 12000rmp，15分钟，取上清液，在上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，混合并在-20度下放置一小时（可以过夜，取出后不要摇晃，直接离心） 6. 12000rmp，15min，弃去上清液。 7. 150ul，BufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min 8.将上清液转移到干净的离心管中，加入6ul（10ug / ul
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植物体内脱落酸、赤霉素的分离和测定实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、脱落酸、赤霉素的分离和测定实验介绍 在植物生命活动的研究中，经常需要准确地了解某种激素的含量和每种激素的比例。因此，植物内源激素的提取，分离和测定是植物生理实验技术中极为重要的内容。本实验以ABA和GA为例，介绍激素提取，分离和测定的基本原理和方法。 二、脱落酸、赤霉素的分离和测定实验原则 脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）可以溶解在有机溶剂（例如丙酮，甲醇）中进行萃取，并将粗提物进行一系列分离技术（例如萃取，薄层色谱法或纸色谱法）等）将ABA和GA与其他成分分开。然后从生物学或物理化学上鉴定纯化的ABA和GA。 （1）生物学鉴定1. ABA能抑制植物器官的生长。在某些浓度条件下，抑制程度与浓度成线性关系。使用该线性关系，可以确定组织中ABA的含量。 2. GA可以刺激幼小植物的节间伸长，特别是矮化植物的茎。在一定的浓度范围内，茎伸长与GA浓度呈线性关系。因此，可以根据茎的伸长来确定GA的含量。 （2）理化鉴定：可采用气相色谱法。 三、脱落酸、赤霉素的分离和测定材料，仪器和试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 脱落酸 14375-45-2 JH0488 2 赤霉素 77-06-5 HXH501769 3 甲醇 67-56-1 JT25999 4 石油醚 8032-32-4 SS6155 5 乙酸乙酯 141-78-6 JT11988 6 HCl 2644-70-4 7 硅酸 1343-98-2 LSH78385 8 氯仿 865-49-6 JW0132 9 脱落酸 14375-45-2 JH0488 10 金属镓 7440-55-3 JT2264 11 乙醇 64-17-5 JT26000 12 正丁醇 71-36-3 JT25998 13 异丙醇 67-63-0 JT25997 14 氨水 1336-21-6 JT8652 （1）材料：植物叶片
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RT-PCR实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、RT-PCR实验简介： RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和CDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。 二、RT-PCR实验所需材料及试剂： EP管、离心机、氯仿、异丙醇、乙醇、DEPC水、溴化乙锭 三、RT-PCR实验步骤 （一）、总RNA提取 1.取200mg组织，将其放入1.5ml EP管中，加入1ml Trizol切碎。 2.震动30秒。 3.加入0.2ml氯仿，在室温下剧烈摇动30s 3分钟。 4. 12000×g，4℃离心15分钟。 5.吸出上层无色水相，并转移到另一个EP管（约0.5ml）中。 6.加入等体积的异丙醇，-20℃，30min。 7.在12000×g，4°C下离心10分钟，在试管底部可以看到微量的RNA沉淀 8.丢弃上清液，加入1ml的75％乙醇并摇匀。 9. 7500×g，在4℃下离心10分钟。 10.丢弃上清液，用滤纸小心吸收残留的液体，并在室温下干燥5-10分钟。 11.将沉淀物溶于20μlDEPC水中，取1μl，然后加入79μlDEPC水以测量OD260 / OD280 12.计算浓度和纯度，并保存在-70℃。 （二）、逆转录合成cDNA 快速混合并离心一次，冻存在-20℃冰箱冰柜中。 （三）、PCR反应 1.快速混合并离心一次，PCR产物在-20℃下保存。 2.取8μlPCR产物并加入5×上样缓冲液2μl2％琼脂糖凝胶电泳120V 3.100mA 30min溴化乙锭染色，凝胶成像仪成像和存储 四、实验所需试剂清单： 1 1.5ml尖底连盖高速离心管（灭菌） F-EP015-H 2 异丙醇 JT25997 3 甲醇中三氯甲烷 BDM000285 4 溴化乙锭(EB) SS1957 5 DEPC处理水 HC1335 6 乙醇 JT26000
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巴斯德人体观察实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、巴斯德人体观察实验简介： ※ 实验目的 1.掌握人体x体（巴氏体）载玻片的制备方法 2.观察并确定巴氏体的形态特征和位置，识别个人的性别。 ※ 实验原理 Pap体也称为X体：正常雌性，位于相间细胞核中，靠近核膜的内缘，大小约为1?1.5 um，呈三角形或椭圆形，数量为x染色体数减一， Pap体是由于女性X染色体之一的失活而形成的。 里昂的剂量理论说，女人有两个X染色体，但是表达的大多数遗传物质与只有一个X染色体的男人一样多。这是因为只有女性X染色体中的一条保持活跃，而另一条则复制较晚且没有活性。灭活的染色体在形态上是异染色体的，即DNA螺旋被紧紧地压紧，并且染色深而密，称为巴氏体。 二、巴斯德人体观察实验所需材料及试剂： 口腔粘膜细胞，发根鞘细胞显微镜，载玻片，盖玻片，牙签，移液器（甲醇：冰醋酸= 3：1），生理盐水，苯酚洋红染色 三、巴斯德人体观察实验步骤 1）材质 口腔粘膜细胞：对象用清水漱口几次，用干净的牙签刮除女性口腔内的粘膜，原位刮擦2至3次，第一次丢弃，然后第二次和第三次清洁幻灯片。 毛根细胞：提取具有毛囊（约2厘米）的女性头发，并将其插入载玻片上。 2）固定 在离心管中离心物料（口腔粘膜细胞），首先以2000 rpm离心20分钟，弃去上清液，加入新固定的固定液（甲醇：冰醋酸= 3：1），在37°C下静置30分钟，然后以1000 rpm离心。15分钟后弃去上清液，加入1ml固定液（甲醇：冰醋酸= 3：1）制成细胞悬液，将其放在载玻片上，将溶液（95％乙醇：乙醚= 1：1）固定1小时，然后风干。 3）染整 将一滴细胞悬液固定在载玻片上，固定20分钟，用蒸馏水清洗2至3分钟，在37℃水浴中用1N盐酸洗涤20分钟，风干，加入1至2滴染料溶液20至30分钟（请勿干燥），用水洗涤以除去染料溶液即可干燥。 直接涂抹：滴加染色液，室温20?30min（请勿干燥），盖上盖玻片并按。 毛细胞：拉出毛干，直接向毛囊细胞中加入5N盐酸，处理5分钟，吸去盐酸，加入染色液，染色20分钟，加盖玻片，然后按。 五，镜检
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蛋白质与DNA相互作用实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、蛋白质与DNA相互作用实验的简单介绍 许多细胞生命活动中，例如DNA复制，mRNA转录和修饰以及病毒感染等，都涉及DNA与蛋白质之间的相互作用。随着重组DNA技术的发展，已经分离出许多重要的基因。现在的关键问题是揭示环境因素和发育信号如何控制基因转录活性。 二，蛋白质与DNA相互作用实验目的： 1.鉴定和分析参与基因表达调控的DNA元素。 2.分离并鉴定这些顺式元素特异性结合的蛋白质因子。 这些问题的研究涉及DNA和蛋白质之间的相互作用。 研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法包括： 1.凝胶阻滞实验。 2. DNase1占用空间实验。 3.甲基化干扰实验。 4.体内足迹测试。 5.下拉实验。 三，凝胶阻滞实验 1.概念：凝胶阻滞测定法（Gelretardationassay），被称为DNA迁移率变动测定法（DNAmobilityshiftassay）或谱带阻滞测定法（Bandretardationassay），是一种特殊的特殊实验，于1980年代初出现，用于研究DNA和蛋白质在体外的相互作用。凝胶电泳技术。 2.原则： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子移动到正电极的距离与它们的分子量的对数成反比。如果某个DNA分子与特殊蛋白质结合，由于分子量的增加，其在凝胶中的迁移将被阻止，因此到正电极的距离会相应缩短，因此在凝胶中会出现滞后带，从而是凝胶阻滞实验的基本原理。 3.流程： 首先准备细胞蛋白提取物（理论上含有特殊的转录因子），用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子结合位点），将该标记的探针DNA与细胞蛋白提取物一起孵育，从而生成DNA-蛋白复合物，在保持DNA-蛋白质结合的条件下进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后，进行放射自显影以分析电泳结果 4.实验结果分析： （1）如果放射性标记的条带集中在凝胶底部，则表明细胞提取物中没有可与探针DNA结合的转录因子蛋白。 （2）如果凝胶顶部出现放射性标记的条带，则表明细胞提取物中存在可以与探针DNA结合的转录因子蛋白。 5. DNA竞争实验： DNA竞争实验（DNA竞争测定）的具体方法如下
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大豆分离蛋白的提取方法（借鉴）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、大豆分离蛋白的提取方法简介 大豆的蛋白含量较高而且营养丰富，一般含蛋白30%——50%。大豆蛋白含有8种人体必需氨基酸，且比例比较合理，只是赖氨酸相对稍高，而蛋氨酸和半胱氨酸含量较低。目前大豆蛋白已成为一种重要的蛋白资源，特别是大豆分离蛋白含蛋白质90%以上，是一种优良的食品原料。 大豆分离蛋白主要由11S球蛋白（Glycinin）和7S球蛋白（β-con-glycinin）组成，大约占整个大豆籽粒贮存蛋白的70%。这两种球蛋白的组成、结构和构象不同，大豆分离蛋白的功能特性也不同。大豆分离蛋白在提取、加工和贮运过程中会发生物理和化学变化，这些适当的改变可以提高大豆蛋白在食品中应用的功能特性。 二，大豆分离蛋白的提取方法 2.1 大豆分离蛋白的提取碱提酸沉法 大豆分离蛋白的传统提取方法是碱提酸沉法。将脱脂豆粕与蒸馏水以1:10的比例混合，用NaOH调整混合物的pH为7——9，充分搅拌浸提碱溶大豆蛋白，离心分离，用稀HCI调整上清液的pH值为4.5— —4.8，沉淀出蛋白质，离心分离，沉淀重新溶于pH7.0——8.0的NaOH溶液中，喷雾或冷冻干燥即得大豆分离蛋白，其蛋白含量可达90%以上，得率24%—— 38%。 2.2 大豆分离蛋白的提取膜分离方法 聂幼华等研究了用膜分离技术制取大豆分离蛋白。先用Ca(OH)2的稀溶液浸提脱脂大豆粕，蛋白浸出率可达80%左右。将浸提液进行循环超滤分离，截留液的浓度可达13%左右。把截留液喷雾或冷冻干燥，即得大豆分离蛋白产品，其蛋白含量可达95%以上。与传统的碱提酸沉法比较，产物得率高，质量好，能耗少，废水排放污染也一定程度上得到解决。 2.3 大豆分离蛋白的提取双极膜电解法（Bipolar Membrane Electroacidification） 这种方法是在电渗析的基础上发展而来的。双极膜由3层组成：阴离子交换膜和阳离子交换膜以及阴阳离子交换膜中间的亲水层。在电流作用下，水分子在双极膜上电离为H+和OH-，由于膜选择透过阴离子或阳离子，导致溶液的pH值降低，达到大豆蛋白质的等电点而使蛋白质沉淀。这种方
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TUNEL法检测细胞凋亡（实验简介,实验步骤,所需试剂）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、TUNEL法检测细胞凋亡实验简介 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。 二、TUNEL法检测细胞凋亡实验所需材料 二甲苯、乙醇、PBS、蛋白酶K、苏木素、甲基绿、甘油 三、TUNEL法检测细胞凋亡实验步骤 1.用二甲苯浸洗2次，每次5min； 2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min； 3.PBS漂洗2次； 4.用蛋白酶K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min； 5.PBS漂洗2次； 6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。 7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。 8.PBS漂洗3次； 9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm） 10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。 11.PBS漂洗3次； 12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min； 13.PBS漂洗3次； 14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数并拍照。 四、TUNEL法检测细胞凋亡
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SP法做免疫组化实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、SP法做免疫组化实验简介 SP法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。 按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。 二、实验所需材料 二甲苯、乙醇、PBS、0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）、苏木素 三、实验步骤 1、烤片，68℃，20分钟 2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯20min⇒二甲苯20min⇒100%酒精10min⇒100%酒精10min⇒95%酒精5min⇒80%酒精5min⇒70%酒精5min 3、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min； 4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。 5、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。 6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）； 滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min； 7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min； 8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。 四、实验所需试剂清单 序号 产品名 货号 CAS 备注 1 PBS缓冲液 HC2031 2 乙醇 JT26000 64-17-5 3 二甲苯 JT24017 1330-20-7 4 苏木精 SX0217 517-28-2 5 枸橼酸盐缓冲液 HC1486
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凝胶迁移（实验简介,实验原理,实验操作步骤，所需试剂）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
凝胶迁移实验简介 凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMS electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。 一、凝胶迁移实验原理 EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。 二、凝胶迁移实验操作步骤 1、实验前准备 （1）合理的实验方案：根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等 （2）样本制备 可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。 （3）探针制备 根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。 三、实验所需的试剂列表 序列 产品名 货号 CAS号 备注 1 TEMED HC1303 2 Binding Buffer JT2113 7786-30-3 3 Agarose SF0014 9012-36-6 4 TBE FMK19848 936475-62-6 5 1000ul蓝吸头 FT-1000 6 200ul黄吸头 FT-200 7 2ml圆底连盖离心 F-EP020 8 96孔无裙边PCR板，透明（灭菌） F-PCR-96W-H
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Western(实验简介,实验所需材料及试剂,实验步骤,注意事项)
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、Western实验简介： Western是用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下，通过电泳分离的蛋白质从凝胶转移到固体支持物上，然后使用抗原-抗体特异性反应从蛋白质混合物中检测出来，靶蛋白，用于在正常或实验条件下定量或定性确定靶蛋白在细胞或组织中的表达，Western印迹法还可用于蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA和蛋白质-RNA相互作用的后续分析，作为廉价，方便，可靠的研究工具，它将与蛋白质组学和质谱技术等技术一起在蛋白质组学时代起重要作用。 影响免疫印迹成功的主要因素是抗体识别的抗原分子中表位的性质，由于抗原样品的变性，只有那些识别耐受性表位的抗体才能与抗原结合，大多数多克隆抗体或多或少都包含此类抗体，因此多克隆抗体通常用于免疫印迹，第二个影响因素是蛋白质储液中抗原的浓度，在免疫印迹之前，需要通过免疫沉淀和亚细胞分离来富集一些低表达水平的蛋白质。 二、Western实验所需材料及试剂： 丙烯酰胺、SDS凝胶上样缓冲液、培养皿、双丙烯酰胺、SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 三、Western实验步骤 （一）、样品制备 对于Western Blotting实验，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白质样品必须是均质的，可溶的并解离为单个多肽亚基，并且必须使彼此之间的聚集最小化，从而使其最终取决于自身的分子量，当靶蛋白的含量非常低时，有必要选择靶蛋白含量高的组织或细胞器（例如核提取物），或通过免疫沉淀富集，通常样品包括重组蛋白，细胞和组织。 1.样品采集 1）培养细胞 收集粘附细胞和悬浮细胞的方法不同，细胞裂解物的类型也不同。建议裂解含SDS的凝胶上样缓冲液并煮沸。 2）动物组织 与细胞不同，组织块由于体积大而必须预先压碎并匀浆。 2.样品定量 电泳前需要确定蛋白浓度，以确保样品体积一致，这有利于后续的定量或半定量分析。有许多常用的测量蛋白质浓度的方法。它们的灵敏度和所需时间不同，并且不同的干扰物质会影响不同的方法。实验者可以根据样品的制备方法（裂解液组成，去污
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液相色谱柱的清洗
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、液相色谱柱的清洗简介： 迄今为止，反相色谱法是高效液相色谱法中使用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析大多数非极性物质以及许多可电离和离子化的化合物，使用反相方法时，必须考虑可能的基质相互作用，当色谱柱被污染时，其色谱行为将与未污染的色谱柱略有不同，污染的色谱柱会产生反压问题。 必须清洁并重建被污染的反相色谱柱，以恢复原始操作条件，通常，样本中包含分析师不感兴趣的内容，盐，脂质，含脂质的物质，腐殖酸，疏水性蛋白质和其他生物物质是一些在使用过程中可能与HPLC色谱柱相互作用的物质，这些物质的保留值小于或等于分析人员的目标。 二、液相色谱柱的清洗所需材料及试剂： 甲醇、氯乙烷、四氢呋喃 三、液相色谱柱的清洗步骤 再生受污染的HPLC色谱柱的关键是了解污染物的性质并找到合适的溶剂进行去除。如果在重复进样过程中由于强保留物质的积累引起污染，则使用简单的步骤去除这些污染物通常可以恢复其色谱行为。有时，在多次操作后，会用90％到100％的溶剂B（双溶剂反相系统中的较强溶剂）冲洗色谱柱，以冲洗20体积以除去污染物。 例如，塔中剩余的脂质可与非水溶剂（如甲醇，氯乙烷和四氢呋喃）一起使用。 四、液相色谱柱的清洗注意事项： 如果使用缓冲液系统，请勿直接切换到强溶剂，突然切换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动系统中的缓冲液沉淀，这可能引起更大的问题，例如柱头堵塞，管道堵塞和泵堵塞，泄漏，活塞损坏或喷射阀轴故障，应首先使用无缓冲流动相（即，将缓冲液更改为水），冲洗5至10体积后，更换强溶剂。 五、实验所需试剂清单： 1 甲醇 JT25999 2 氯乙烷 LSH57971 3 四氢呋喃 JT11423
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ABO血型鉴定方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验原理： 血型（blood group）就是红细胞上特异抗原的类型。在ABO血型系统，根据红细胞膜上是否含有A、B抗原而分为A、B、AB、O型。血型鉴定是将受试者的红细胞加入标准A型血清（standard serum A）（含足量的抗B抗体）与标准B型血清（standard serum B）（含足量的抗A抗体）中，观察有无凝集现象，从而测知受试者红细胞上有无A或／和B抗原。 交叉配血（cross-match test）是将受血者的红细胞与血清分别同供血者的血清与红细胞混合，观察有无凝集现象。为确保输血的安全，在血型鉴定后必须再进行交叉配血，如无凝集现象，方可进行输血。若稍有差错，就会影响受血者的生命安全，千万不可粗心大意。 二、实验材料与试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 碘酒 7553-56-2 JH0093 2 生理盐水 7732-18-5 FS0033 3 乙醇(95%) 64-17-5 JT26000 人;显微镜、 离心机、采血针、玻片、滴管、1ml吸管、小试管、 试管架、牙签、消毒注射器及针头、碘酒、棉球、消毒棉签;标准A、B型血清、生理盐水、75％酒精。 三、实验步骤 1.玻片法 （1）将标准A型与B型 血清 各一滴，滴在玻片的两侧，分别标明A与B。 （2）用75％酒精棉球消毒左手无名指端，用消毒采血针刺破皮肤。滴1滴血于盛有 lml生理盐水的小 试管 中，混均制成红细胞悬液（浓度约5％）。 （3）用滴管吸取红细胞悬液，分别滴一滴于玻片两侧的血清上，用两支牙签分别混匀（注意严防两种血清接触）。 （4）15分钟后用肉眼观察有无凝集现象。根据图40判定血型。 2. 试管法 取小试管 2支，分别标明 A、B字样。分别加入A、B型标准血清与受试者的红细胞悬液各1滴，混匀后离心1分钟（100转/min）。取出试管后用手指轻弹试管底，使沉淀物被弹起，在良好的光源下观察结果。轻弹管底时，若沉淀物成团漂起，表示发生凝集现象，若沉淀物边缘呈烟雾状逐渐上升，最后使试管内液恢复红
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PCR法检测支原体实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、PCR法检测支原体实验介绍 PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增技术，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA聚合酶的作用，使DNA 链扩增延伸。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。 二、PCR法检测支原体实验仪器设备与试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 dNTP 2 TapDNA聚合酶 9012-90-2 SS1358 3 AMV/MMuLV反应缓冲液 HC1315 4 琼脂糖 9012-36-6 SF0012 5 矿物油 8020-83-5 SF0015 6 去离子水 7732-18-5 SS1456 7 0.5ml离心管 F-EP005 超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混悬器等。 选用美国Stratagene公司生产的支原体检测试剂盒（内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean resin、缓冲液），dNTP，TapDNA聚合酶，缓冲液，琼脂糖，矿物油。 三、PCR法检测支原体实验操作 PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。 （1）样品的收集：待测细胞用无双抗培养基培养7d，用无菌容器取上清液500ul，4℃保存待测。 （2）模板的制作：在无菌的条件下，取细胞培养上清100ul于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子，95℃水浴加热5min。 （3）打开盖子，向管内加StrataClean resin10ul，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5—10s，吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕，4℃保存。 （4）PCR反应：反应体系最适条件为：10mmol/lTris-HCL（pH8.38）；50mmol/lHCL；1.5-2.5mmol/lMgCL2；200umol/ldNTP；2UDapDNA聚合酶。总反应体系为50ul，反应用去离子水均需用12000uw/cm2紫外灯照射。反应如下表： 程序 循环 温度/℃ 时间/min
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测定苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）的活性
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验原则 苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）催化苯丙氨酸的脱氨基反应，使NH 3释放形成反式肉桂酸。该酶在植物次生生物质（如木质素等）的代谢中起重要作用。根据其产品，反式肉桂酸在290 nm处的吸光度变化可以确定酶的活性。 二、实验材料，仪器和试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 硼酸 10043-35-3 JT0008 2 四硼酸钠 1330-43-4 JT0599 3 苯丙氨酸 PYJH50891 4 胆固醇 57-88-5 JT0008 5 巯基乙醇 60-24-2 JT27316 6 聚乙烯吡咯烷酮 9003-39-8 CG0277 7 石英砂 14808-60-7 JT0062 8 乙醇 64-17-5 JT26000 （1）材料：马铃薯块茎 （2）设备：1.紫外分光光度计； 2.离心机； 3.砂浆； 4.吸滤瓶； 5.红灯装置； 6.打孔器。 （3）试剂：1. 0.05mol / L硼酸盐缓冲溶液（pH8.8）； 2. 0.02mol / L苯丙氨酸（用0.1mol / L pH8.8硼酸缓冲液制备）； 3. 5mmol / L胆固醇基硼酸乙醇缓冲液。 三、实验步骤 1.准备马铃薯薄片洗净马铃薯块茎，将其削皮，用冲头（直径1.5cm）取下圆柱体，切掉表皮附近的两端，将中间部分切成2mm厚的圆盘。首先用自来水冲洗，用蒸馏水冲洗一次，然后用纱布吸干表面。 2.光感应：将光盘放在装有湿滤纸的培养皿中，并在20?30℃的红光下放置24小时以诱导PAL（也可以接种病原体的感应）。 3.粗制酶提取物5g土豆片经诱导处理，再加10ml含5mmol / L巯基乙醇的硼酸缓冲液，0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或PolyclarAT（去除酚类中毒，防止颜色干扰，研磨少量石英砂）通过抽吸过滤匀浆，以10,000rpm离心15分钟，上清液为粗酶提取物，在0?4℃下进行上述操作。 4.活性测定与计算1ml酶溶液加1ml 0.02mol / L苯丙氨酸，2ml蒸馏水，总体积为4ml。作为对照，不加入底物，并加入1ml蒸馏水。将反应
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病毒斑实验知识解答
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验介绍： 问：我要进行病毒斑块实验。我不知道如何配置甲基纤维素以覆盖培养基。 答：1.我这样做： 二、实验步骤 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 甲基纤维素 9004-67-5 HC1131 2 甲醛 100-52-7 JT12059 3 结晶紫 548-62-9 SX0037 4 碘液 7553-56-2 HC0408 5 乙醇95% 64-17-5 JT26000 6 中性红 553-24-2 FF0018 7 琼脂 9002-18-0 SW0006 24孔板VERO，HSV1 1）24孔板预板 2）24小时后，弃去培养液，并用汉克斯溶液清洗一次 3）接种病毒溶液0.1ml /孔 4）放入37度5％CO2培养箱中1h，在此期间每15分钟缓慢摇动以充分吸收病毒 5）加入1％甲基纤维素（1ml /）覆盖培养基，将其放入37度5％CO2培养箱中以继续培养 6）3天后，吸出培养基 7）加入5％甲醛1ml /孔4min，弃去甲醛，加入结晶紫0.8ml /孔染色20min 8）用自来水缓冲液洗涤缓冲液以计算孔点的数量 2.我的老师也使用甲基纤维素进行菌斑测试，但浓度为2％。配置方法为：甲基纤维素：3克溶于150ml蒸馏水中，终浓度为2％;染色用碘溶液：将25g溶于500ml 95％乙醇。最终浓度为5％非常好。但是，甲基纤维素应预先放置较长时间，约2周，高压后放入冰箱，使用前请无菌添加培养液，混入冰箱中，一天后取出，剧烈摇动。 ，使纤维素食主义者达到均匀状态后，静置直至起泡完全消失。可以将染色液与0.1％（w / v）中性红色培养箱孵育2-3小时。如果是6孔板，则每孔加1ml。倒数后。 三、实验遇到的问题： “ 1％甲基纤维素（1ml /）孔覆盖培养基，并将其放入37度5％CO2培养箱中以继续培养”是指将1％甲基纤维素直接添加到已放置培养基的孔中，或者甲基纤维素是否与培养基混合并添加到细胞中？配方比例是多少？甲基纤维素应提前很长时间准备，为什么要约2周？我什么时候可以数？标
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