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细胞的冻存与复苏
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
一、 程序冻存步骤（需梯度降温） 1、 配置冻存液，冻存液推荐配比：55%（基础培养基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；推荐使用Procell通用血清型程序冻存液，货号PB180436； 2、 制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量； 3、 细胞离心后尽量吸干净上清，离心转速1200rpm（250g）3min； 4、 加入配置好的冻存液重悬，调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL； 5、 分装入冻存管，一个冻存管分装1~1.5毫升； 6、 推荐使用程序降温盒，分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱过夜； 7、 如没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化； 8、 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。 注意事项： 1、 DMSO配制的时候会放热，一定要等冻存液冷却后使用，避免灼伤细胞； 2、 细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液； 3、 不建议手动梯度降温，温度不稳定，容易降低存活率； 4、 注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最-低刻度线；冻存5次后异丙醇需要更换一次，以免影响冻存效果；程序降温盒需恢复到室温以后才能继续使用，不能从冰箱拿出来直接使用； 5、 细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞损伤大，分装完成后立即转入程序降温盒放到-80度冰箱，不需要放4度； 6、 -80度冻存过夜后可以转入液氮长期保存，转入液氮的过程需要对冻存盒进行保冷，不要长时间在常温暴露，避免冻存管融化； 7、 若没有液氮罐，存放在-80度的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定。 8、 细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存； 二、 非程序冻存步骤（需使用无血清冻存液） 1、 冻存液丛冰箱提前拿出回温到室温，推
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冷冻细胞活化步骤
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
1.冷冻细胞的活化原则为快速解冻，避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，导致细胞死亡。 2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产 生单株抗体或是其它蛋白质)。2y2Q O6\#o&h4@+z,~ 3.材料37℃ 恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/离心管/培养瓶，液氮或干冰容 4.步骤： 4.1操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 4.2自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易 松掉。 4.3将新鲜培养基置于37°C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 4.4取出冷冻管，立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化以70%ethanol擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 4.5取出0.9ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10～1:15)混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。 4.6解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。 4.7若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
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血清的处理方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
血清或（血浆）标本的处理方法检验科收到临床标本后，应尽快低速离心分离血清或血浆进行测定。45℃水浴10分钟，再3000r/min离心5分钟，即可使LDH、K等显著升高。对血液标本外观观察是判断标本质量的最直观的方法，外观异常有溶血、黄疸、脂血等情形，是引起测定误差常见的因素。 （1）标本的离心离心分离血清应选择相对离心力（RCF）为1000g~1200g，离心时间为5~10分钟。增加相对离心力或增加离心时间，都易引起溶血。 （2）溶血标本的处理溶血可导致RBC内多种成分的释出，引起对测定方法的干扰，Hb≥0.2g/L，肉眼可见溶血。 ①间接干扰：Hb的释出，可引起间接的干扰，因Hb在波长为431nm和555nm处有光吸收，若被测物选用与之相近波长作比色分析时，可导致假性增高。处理方法：轻度溶血，同时作血清空白；严重溶血，重留样本。 ②直接干扰：RBC内含量高的血液化学成分溶血后，这些化学成分在血清中浓度就会增高，避免用溶血标本测定在RBC内含物高的化学成分。如钾、ALP、AST、Bil、CK、LD、ACP等。 （3）乳糜标本的处理高脂血症的病人往往可导致乳糜血，医学教|育网|收集整理为了不影响检测，应对乳糜血进行澄清。具体方法如下：血清和（或）血浆与氟利昂以1：1在玻璃试管中混合。氟利昂在血浆和（或）血清下，180℃颠倒试医学教育网管3min，使充分混合。然后3000g离心6min.上清液为澄清的血清，中层含沉淀的脂蛋白，下层为多余的氟利昂，澄清过程可重复多次而不影响酶的活性和底物。 （4）胆红素（黄疸）标本的处理胆红素的颜色对反应结果为黄色和红色化合物的比色分析有正向干扰，可用样品空白或动力学和双试剂消除。另外，胆红素不稳定，在碱性环境或强光线照射下，转变为胆绿素、胆褐素而褪色，如用碱性ku味酸法测定肌酐，黄疸标本常常会出现负数。另外胆红素还有还原性，对Trinder反应有负干扰，如氧化酶法测定葡萄糖、胆固醇、甘油三脂、尿酸等，可通过进行干扰试验消除
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如何选择合适的缓冲液
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
缓冲液在实验中的作用十分强大，由上于缓冲液的类别非常多，所以我们常会看到某某缓冲液的配制方法有哪些或者是一些使用方法等，但其他在选择上，也是十分重要，其作用主要是缓冲作用，而这种作用的前提是基于溶液，固有的时候也会被称为：缓冲溶液! 缓冲液的品种非常多，比如常见的有HEPES缓冲液，磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，甘氨酸缓冲液，虽然我们都知道这些缓冲液有很多的优点，但同时也有着不可避免的缺点；本文将为您一一进行揭晓，我们只有把这些问题弄清楚了，才可以更加清楚的去选择适合的缓冲液。 如何选择缓冲液， 缓冲液有什么优点及缺点 一般来说，在选择缓冲液时，我们需要遵循以下几个要求，特别是需要确定该缓冲液所需的PH值，具体如何选择请参考下面说明： 选择缓冲体系，其解离常数pKa值应该在设定的pH上下一个pH值单位内，因为缓冲液的pKa变化超过一个pH单位时，其缓冲能力就会明显下降； 缓冲体系不应影响蛋白质的活性或者DNA的稳定性，并避免其他离子的干扰； 最后，还要考虑温度的影响：温度不仅对缓冲液有影响，对细胞也有影响，大多数动物细胞在37℃的生理状况下pH为7.0~7.5，而在温度下降到0℃时可达到8.0。 那么缓冲液有什么优点及缺点有哪些呢?由于缓冲液的品种特别多，所以我们拿出几个系列的产品作详细讲述！ 磷酸盐缓冲液的优点及缺点： 磷酸盐缓冲液是使用广泛的一种缓冲剂，由于它有二级解离，所以缓冲的pH值范围很广，可配置各种pH值的酸性、碱性和中性缓冲液。 A、优点 易配成各种浓度 适用pH范围宽 pH受温度影响小 稀释后pH变化小 B、缺点 易与常见的钙离子、镁离子及重金属离子缔合成沉淀 Tris缓冲液的优点及缺点 Tris缓冲液是在生物化学研究中使用较广泛的一种缓冲剂，其本身为弱碱，常用有效pH在“中性”范围。 A、优点 碱性较强，可以只用这一种缓冲液配置由酸到碱的但范围pH缓冲液; 对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 B、缺点
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细胞传代时间经验技巧
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
养细胞的小伙伴们都知道，细胞一定要传代，因为细胞在培养过程中不断的繁殖，数量也随之增加，然而培养皿/培养瓶的空间有限，增殖受到抑制，所以必须将一部分细胞移至别的培养皿/培养瓶，让细胞有足够生长空间。 细胞传代也不仅仅是为细胞安一个更大的“家”，更重要的，是使细胞系或细胞株进一步增殖，这样，我们才能有足够的细胞做各种各样的实验。 但是，对于传代的时间，很多小伙伴都掌握不好，因为对于不同的细胞来说，判断能否开始传代的标准略有不同，今天，我们就主要来聊一下，细胞传代的时间问题。 什么时候进行细胞传代? 对于贴壁培养和悬浮培养而言，判断是否需要传代主要看以下2个方面： • 细胞密度： 贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代，正常细胞达到汇合状态时会停止生长 (接触抑制)，重新接种后需要较长时间才能恢复，转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。类似地， 悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。 • 培养基耗竭： 生长培养基 pH 值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性，而且 pH 值降低也是细胞生长的不利因素。pH 值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。 如果发现 pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 单位)，同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 细胞传代时间安排 注意，一定要严格按照预定时间进行细胞传代，这样才能确保细胞的生物学行为稳定，便于监测其健康状态。 要从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度，直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量，细胞偏离如此确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳 (例如：变质、污染) 或者培养体系的某一组分功能异常 (例如：未
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培养细胞时如何正确的使用胎牛血清
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
牛血清是细胞培养中常用的天然培养基，与合成的基础培养基配合使用，一般添加使用量在10~20%，主要作用是提供细胞生长所需的营养物质、激素和生长因子等。 养过细胞的小伙伴们应该都知道：血清，由于其复杂的内在成分和难以控制的外界因素，它既是细胞生长的营养，也是细胞死亡的“致命du药”，当我们废寝忘食的，呕心沥血的，鞠躬尽瘁的养着细胞同时，也极有可能因为一时的疏忽和大意选择了品质不好的血清，导致珍贵的细胞意外身外，一切归零，不得不重头开始! 血清质量的差异性大 市场上各种血清产品鱼龙混珠，一不小心，你可能就使用了品质不好的血清。 血清按照采血时间可分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，三者的优劣顺序为：胎牛血清>新生牛血清>小牛血清。 一般细胞建议使用胎牛血清培养，部分细胞可使用新生牛血清培养，小牛血清则不建议用于细胞培养。 血清在生产中受采血来源，条件和生产工艺等的影响，质量差异较大，即使相同厂家不同批次的血清都会有差异;另外不同种类的细胞对血清的适应也有不同，这可能与血清中所含的生长因子有关，所以血清在使用之前应提前验证一下对所培养的细胞生长的促进作用。 血清的正确保存及使用指南 1）保存：胎牛血清一般在-20℃以下冷冻保存，使用之前应先放到2~8℃冰箱过夜溶解，不建议直接放到室温或37℃水浴溶解(升温过快会导致血清中蛋白质大量沉淀，影响血清质量);若一次使用量不多，可溶解后分装至小包装冻存，避免反复冻融。血清解冻后在2~8℃保存时间一般不超过一个月。 2）灭活：一般血清使用时不需要灭活。灭活的作用是消除血清中的各种补体成分，但事实证明血清灭活之后会产生大量的沉淀，会对血清的营养物质造成较大破坏，对细胞的生长不利。 3）沉淀：血清中的沉淀一般为析出的纤维蛋白，另外新生牛血清中各种蛋白含量明显偏高，溶解时较易产生大量沉淀。血清中出现沉淀一般不会影响血清质量，并且升温至37℃时会溶解(不建议加热血清);若沉淀量较多，可在4
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核酸提取与纯化整体解决方案
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
核酸提取与纯化整体解决方案 核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，是生命最基本的物质之一。核酸存在于所有动物细胞、植物细胞、微生物内。生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。核酸主要包括RNA（核糖核酸）和DNA(脱氧核糖核酸)。核酸提取的原则首先保证核酸一级结构的完整性，其次要排除其它分子的污染。 核酸提取大致分为3大部分：破碎、提取、纯化。核酸提取是其中很重要的一个环节，核酸模板的质量很大程度上决定了下游PCR检测结果的准确性。 在目前的分子诊断实验室当中，磁珠法提取和硅胶膜离心柱法提取是的两种提取方法。那么，这两种提取方法各有什么特点？提取流程与原理又是什么呢？ 磁珠法特点主要体现在： 1、 能够实现自动化、大批量的实验操作。 2、操作简单，用时短，整个流程大约可以在30分钟内完成。 3、安全无毒，符合环保理念。 4、磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。 磁珠法吸附原理： 运用纳米技术，对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。核酸结合到磁珠上主要依靠静电作用、疏水作用和氢键作用。在盐酸胍、异硫氰酸胍和外加磁场的作用下，能从血液样本中分离出DNA，并洗去非特异性吸附的杂质，得到纯化后的DNA，可应用于实验室检测。磁珠法提取的原理，具有传统DNA提取方法的优势，可以应用在血液、组织、拭子、鼻咽分泌物等样本之中。 磁珠法核酸提取流程： Yeasen Auto-Pure32A全自动核酸提取仪 产品描述 Auto-Pure32A核酸提取纯化仪是通过使用磁珠法提取纯化核酸的设备，具有自动化程度高，提取速度快，结果稳定，操作简便等优点。使用96 孔深孔板试剂盒，可同时纯化1-32个样品。搭配不同种类的磁珠核酸试剂组，可以快速提取动植物组织、血液、体液、刑事检体等样品中的DNA
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关于TFF浓缩EV的相关知识
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
什么是EV? 细胞外囊泡(ev)是细胞分泌的纳米颗粒，主要参与细胞间通讯过程。在过去的几年里，EV获得了越来越多的兴趣从科学界，成为一个多学科的研究领域。EV具有由于纳米尺寸和生物活性含量所产生的独特的物理化学性质。EV能够跨越多种生物屏障，比如细胞膜和血脑屏障，它们参与了许多病理过程。基于这些原因，EV前景广阔，应用于药物靶点、生物标志物和给药载体。 传统EV浓缩方法 将EV用于科学和医疗应用的一个主要挑战是隔离过程，因为EV可以在各种复杂的生物基质中找到，这些基质是由大量的在尺寸和密度上重叠的纳米生物材料。 常用的隔离技术ev与其他流体组分的分离是超离心法(UC)，即密度梯度(DG)，阻垢层析(SEC)。然而，这些方法可能是有限的输入量、时间消耗和EV产量。例如UC协议能够处理体积较大(可达1.5 L)，但回收率较低[15,16]，且耗时较长离心步骤，经常破坏EV，并引起共沉淀污染物。虽然DG和SEC通常会产生纯度高的EV配方，这些方法耗费时间，导致低收益，并且需要较小的体积(小于5毫升)。此外，上述方法的临床实际操作具有挑战性临床级生产的无菌和放大要求。因此,改进技术能够以可扩展、可再生和无菌的方式浓缩EV，这对未来是必要的临床要求。 在过去的几年里，用于纯化合成纳米粒子、蛋白质、液体悬浮液中的病毒也被用于EV分离。这些新兴EV的分离方法主要是利用抗原-抗体结合亲和力、高性能液体色谱法或过滤。例如，场流分馏(FFF)]和非对称流场流分馏(AF4)依赖于作用于流经的液体悬浮液的场管式过滤器。切向流过滤是另一种新兴的耦合渗透技术膜过滤和流动，以从胶体基质中获得有效浓度的ev。 全新TFF技术 切向流动过滤(TFF)不同于传统的终端过滤，因为流体是切向流动的以避免滤饼的形成。事实上，通过终端过滤，较大的颗粒通常会堵塞膜孔，导致颗粒分离受损这是基于原始孔隙大小。TFF被评价为一种基于大小的EV浓度方法，能够处理可伸缩量的生物液体。UC和TFF的并行
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细胞培养时生长缓慢？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
细胞生长缓慢的常见原因: (1)培养基可能缺乏细胞生长所需的某种因子。 通常情况下，当小伙伴购买细胞，并没有按照ATCC或国内细胞库推荐的方法制备培养基，使用实验室兄弟姐妹使用的培养基来培养细胞。解决方法一般是按照推荐的方法制备培养基，或直接购买培养细胞的培养基。(B)细菌、支原体、真菌等污染:虽然培养基中通常添加双抗体(青霉素和链霉素)，但如果无菌操作观念不强，仍有可能造成污染。处理方法:如果有冷冻细胞，可以丢弃污染细胞。当然，丢弃并不是随意的，扔进垃圾桶。应按照实验室生物安全规定进行。然后复苏培养物，建议培养箱完全消毒。 (2)如果不冷冻，而且这种细胞非常珍贵，常用的**方法是药物**:细菌污染加5-10倍的抗生素;真菌污染加抗真菌药物;支原体污染再加上抗支原体药物，具体药物可以咨询技术支持，他们会更加专业。 (3)许多细胞的生长依赖于密度。如果传代后细胞密度过小，也会影响细胞生长。这段时间没有什么特别好的，就是更换液体。如果细胞培养瓶为T75，则可以消化、离心、复苏，然后接种到T25瓶中。 (4)冷冻细胞中添加DMSO(二甲基亚砜)的量不正确，没有逐渐梯度冷却。下一次恢复后的细胞总是坏的。处理方法:按推荐的冷冻保存方法制备冷冻液。部分细胞适合10% DMSO，部分细胞适合5% DMSO;严格遵循渐变冷却的原则，细胞恢复后迅速解冻。 (5)换液间隔时间太长。一些小伙伴真的把细胞“佛”系生长。当他们想到它的时候，才会换下液体，相信一个句子。“你已经是一个成熟的细胞了。你应该学会养活自己，成长”。在这种情况下，细胞培养瓶中积累了大量的细胞代谢废物，影响细胞活性。 (6)细胞的“消化”时间不宜过长，减少对细胞的损伤;此外，EDTA一般添加到胰腺酶中，螯合钙离子，影响细胞粘附。**方法:控制细胞“消化”时间，尽量去除干净的胰蛋白酶和EDTA。 PH值:细胞需要在一定的PH值下生长，这个小朋友知道。但是很多时候PH值是我们忽略的东西，这也是想强调的一点。随着使用时间的增加，
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ELISA实验中出现复测原因分析
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在ELISA实验过程中时常会出现复测现象，即我们时常说的"花板"现象，这种现象影响检验结果的正确判读，对工作造成一定的不利影响，一旦出现“花板”，实验结果必须放弃，重新进行，不仅浪费物料和时间，而且还会出现样本量缺少、交叉污染、报告延迟等一系列问题。 出现这现象的影响因素分析如下 1、标本因素 正确处理标本，防止大规模溶血、血浆层异物、使用一次性加样枪头，防止交叉污染。血清和血浆均可以用于检测，但血清的分离应在抽血后等血液完全凝固后再离心。 2、试剂因素 正确保存及使用有效试剂。使用过期试剂及底物接触金属容器、底物混合后放置时间较长均影响实验结果的准确性。选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好，批间差小的试剂。不同厂家的试剂不能混用，包括底物和洗涤液。检测前应将试剂放置室温平衡半小时，洗涤液应现用现配，同时观察浓缩洗涤液中有无结晶，若有结晶应放37℃水浴中融化后才可使用。 3、技术人员操作因素 严格按照相关实验SOP操作实验。加样时应尽可能的垂直加样，并加在包被孔的底部（注：勿应用力过度破坏底部包被物质），不可加在孔的上部及外部。 4、温浴的因素 使用水浴箱作为温浴设备时，应注意水的深浅对结果的影响，当水浴箱中水的的实测温度37℃时，则水面温度可能只有34℃，空气温度更低，甚至只有二十多度，所以当水浴箱中水位过低时则酶标微孔板没有浸入水中，则反应温度会达不到37℃，相应的就会影响酶促反应。为防止边缘效应，酶标板应尽量浸入水中，以保证受热的均匀。水浴时，酶标板应封好，以免水滴滴入包被孔中，或阳性标本的蒸发。严格掌握温浴时间，不可为了早点出结果擅自缩短温浴时间。 5、洗板机的因素 废液瓶装满后应及时清空，以防止废液回流对管道的污染，而使洗涤不彻底，造成“花板”。洗板结束后应用蒸馏水彻底清洗管道，以防止废液在管道中的残留。同时应根据仪器维护保养程序，定期对洗板机进行维护保养。 6、酶标仪 酶标仪应安置在避光
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细胞凋亡的机制有哪些？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
细胞凋亡是指人体自身为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的死亡，它与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡的机制有哪些？ （一）氧化损伤：氧自由基的损伤。各种氧化剂（H2O2等）可直接诱导凋亡，抑制SOD的活性也可导致凋亡。 机制：1、氧自由基激活P53基因；2、活化多聚ADP核糖转移酶；3、攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，直接造成细胞膜的损伤；4、激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶；5、引起细胞膜结构破坏，使Ca2+通透性增加；6、活化核转录因子NF-κB，AP-1等，加速细胞凋亡相关基因的表达。 （二）钙稳态失衡 机制：1、激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶；2、激活谷氨酰胺转移酶，利于凋亡小体形成；3、激活核转录因子；4、Ca2+在ATP配合下暴露核小体之间的酶切位点，有助于DNA内切酶切割DNA. （三）线粒体损伤： 机制：线粒体内、外膜之间的通透性转换孔（PTP）在凋亡诱导因素作用下由正常情况下的关闭状态转为开放，使细胞凋亡的启动因子从线粒体逸出。
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细胞培养常见问题及其解决办法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
细胞培养常见问题及其解决办法 1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 2. 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。 7.Hank's 蛋白酶(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 蛋白酶(HBS)和Earle's蛋白酶(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagl
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配对抗体的制备与筛选
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
配对抗体指的是可以同时结合在一个抗原分子上的两个抗体。配对抗体，一般应用于双抗夹心法 ELISA 实验。 抗体配对的原理 通常情况下，一个抗原分子拥有多个抗原决定簇，将抗原注射入动物体内进行免疫，针对不同的抗原决定簇会产生不同的抗体。产生的抗体具有特异性与专一性，即一个抗体分子只会特异性地结合一个抗原决定簇。两个针对不同抗原决定簇的抗体，有可能同时结合到抗原分子上。如果两个抗体同时结合到同一个抗原分子上，那么这两个抗体就是配对抗体。 配对抗体的制备与筛选 需要注意的是，即使两个抗体针对的是不同的抗原决定簇，也并不意味着这两个抗体分子一定可以同时与抗原分子结合。当一个抗体与抗原结合后，有可能会导致其他结合位点（抗原决定簇）构型的改变，从而导致其他的抗体无法正常结合到抗原上。位阻效应的存在，也可能使两个结合位点距离较近的抗体无法同时结合在抗原上。因此想要得到可以同时结合在抗原分子上的配对抗体，在制备出抗体后，还需要对得到的抗体进行筛选。这就意味着，要制备配对抗体，要完成以下两步工作：抗体的制备；配对抗体的筛选。 抗体制备 为了便于后续的筛选，制备的抗体应为单克隆抗体，通常利用杂交瘤技术进行单克隆抗体的制备。 注意：如果单克隆抗体很少，很可能会找不到可以配对的抗体，因此，在免疫动物的时候，应多免疫几只动物，以获得更多的单克隆抗体。 配对抗体的筛选 通常，配对抗体筛选的方法是双抗夹心 ELISA 法。筛选的原理为：在得到了单克隆抗体后，从中取出两种单克隆抗体，一种作为捕获抗体，另一种作为标记抗体（HRP 酶标记），将捕获抗体包被在抗原板上，先加入抗原，孵育后洗去未结合的抗原，再加入标记抗体 孵育后洗去未结合的标记抗体，最后加入显色液显色。如果可以显色，说明标记抗体与抗原特异性结合，该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。如果不能显色，说明标记抗体不能与抗原结合，从而被洗脱，该捕获抗体与标记抗体不是配对抗
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27个细胞传代培养常见问题汇总
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
1、一般拿到细胞后，应该注意什么? 收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒，放在培养箱静置若干小时后(看细胞密度而定)在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各两张)，排除细胞本身污染的情况。 2、何时须更换培养基? 视细胞生长密度而定，常规细胞2-3天更换培养基。 3、细胞何时进行传代较好? 一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了)，但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。 4、贴壁细胞如何进行传代? 去掉原T25培养瓶里面的培养基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;弃PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4 ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min;弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶补足培养基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。 5、悬浮性细胞应如何传代处理? 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加完全培养液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长，此时细胞生长状态良好，当补液时，需避免反复吹打。 6、贴壁细胞传代如何使用胰酶? 一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣子增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进
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细胞爬片的特点和注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
爬片又名细胞爬片，是指让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，病冻切片，细胞涂片，原位杂交等。 细胞爬片特点 1.玻片表面经过TC处理，双面均可使用. 2.γ射线灭菌,保证无菌. 3.使用便捷,只需打开包装,将爬片放入孔板内,将细胞悬液滴到爬片上即可培养. 4.爬片厚度为0.17mm,直径为8mm/14mm/20mm/25mm.分别适用于48孔细胞培养板/24孔细胞培养板/12孔细胞培养板/6孔细胞培养板 5.强吸附：该玻片表面具有yong久的阳离子电荷,可以通过静电作用吸附冰冻切片组织或细胞,使之粘附在玻片上,进而在玻璃和切片组织之间形成共价键.因此，无需粘黏剂或者蛋白包被，该玻片也能牢固的粘附切片或细胞。 操作注意事项 使用细胞爬片时(比如在六孔板中放入爬片,六孔板的孔底面积往往会比爬片面积多出一部分,加细胞悬液时常常就是细胞铺满整个孔底,有时细胞生长边集现象,就是靠近壁边缘密度要高些,这样处于中央玻片上爬的细胞数量就可能相对较少。比较好的做法是将玻片放入孔板的孔内后,加细胞悬液时只滴到玻片上,一直滴到液体布满整个玻片又不会溢出玻片边缘(因为液体表面张力作用可以很容易做到这一点。),放在培养箱里,等细胞贴壁后,取出,再滴加培养基布满整个孔底,继续培养,这样玻片上的细胞生长的密度就会很集中. 细胞爬片怎么保存 细胞爬片有三层包装,在超净台无菌的状态下打开包装.未用完的爬片按原先包装方式再包装起来即可. 友情提示 该爬片表面带有正电荷,请勿用手触摸,以免使用效果不佳. 玻片经过γ射线灭菌后,透明玻片颜色会略变为淡茶色,属正常现象.
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