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morris水迷宫实验准则（2）
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
Morris水迷宫硬件准则要求 1、水池和站台：对于水池的大小，存在一个人为选择的问题，看起来应该统一标准，其实并不容易。但是有个原则就是水池不能太小，站台也不能太大。Morris最初（1981年）用于大鼠的水池是直径1.32米、高为0.6米，水池的水深为0.40米;但后来（1984年）改为直径2.14米、高0.4米，水池的水深为0.25米。对于小鼠的实验水池，文献中介绍的迷宫直径差异巨大，小到0.6米, 大到2.0米。一般而言，过小的水池使小鼠爬上平台的偶然性增加，任务难度减小。过大的水池会使小鼠游泳路径延长，体力消耗过大，爬上站台的机率减少。现在国内文献中所用水迷宫水池大多数为大鼠1.6m或1.8m居多，而小鼠一般为1m或1.2m，高0.5m。站台一般为圆形，直径可分为大鼠12cm,小鼠6cm,表面粗糙，高度一般为30cm。国外文献中所用水迷宫水池大多数为大鼠1.8m或2.0m居多，高0.6m,站台直径10cm；而小鼠一般为1m到1.5m，高0.3m站台直径5cm。 2、水温：水的温度要求实验过程中恒温。大鼠温度范围一般为25± 1℃，小鼠可能低些在18~22℃。有文献报道，对小鼠进行了水温对迷宫成绩影响的观察，结果发现27~28℃组的小鼠成绩最差，而17~18℃组和21~22℃组小鼠的学习成绩没有区别，所以，我们推荐小鼠水迷宫的实验用21~22℃水。水温对潜伏期影响很大，特别是大鼠，如果温度过高，大鼠在游几次后渐渐适应了迷宫环境，它就会把迷宫当“浴盆”了，放进去以后，就漂浮不动；如果水温过低，大鼠体温下降很快，体力也会耗散太多，大鼠游泳能力不能坚持很久，就会出现游几次潜伏期突然增大的现象。甚至有些老鼠会出现较明显的应激反应，比如说会出现抽筋，腹泻现象。水温一般保持25度左右，另外气温也会导致水温偏差过大，应人为的调节水温。所以就要求在水池的底部装有可以恒定保持水温的加热棒或者其他加热装置了。 3、光源：要保证水池水面上没有光影，主要是要避免光线在水面的反射问题，以免留在水面的光照影子被软件的采集系统将光影和鼠的影子混淆
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morris水迷宫实验准则（3）
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
实验流程准则 Morris水迷宫实验主要测定空间学习记忆能力，主要的实验内容有隐蔽站台试验、空间探索试验、反向试验和可视站台试验等。在这里主要介绍下文献里面主要做的隐蔽站台试验和空间探索试验的流程准则。 隐蔽站台试验： 啮齿类动物第一次游泳时,一般不会找到藏于水面下的不可见的站台。若动物在入水游泳60～90s以内仍未能找到水池中的站台或未能爬上站台时,实验人员可将动物引导置于站台上站立10～30s,使动物体会站在站台上的感觉,这样从第二次开始,学习成绩就能迅速提高。动物爬上站台后,让动物在站台上站立5～10s。将大鼠从站台上拿下来,休息30～60s以后再进行下一次训练。在一般情况下,正常大鼠在经过4～6个实验日训练后,很快就学会以最快最佳的轨迹搜索到站台的确切位置。 每天开始时，将鼠任意从四个象限（东北、西北、东南、西南）之一面向池壁放入水中，站台放置于东南象限， 每次实验鼠共游泳60～90s来寻找隐藏的站台。如果成功地找到站台，鼠可以得到在站台上的10～30s休息时间；如果60～90s内未能成功的找到站台，就由实验人员将鼠人工置于站台上，且同样给予10～30s的休息时间。有时鼠可能会在10～30s间隔时间到达之前从站台上掉下或跳入水中继续游泳。一旦这种情况发生，则将鼠重新放回站台，并重新计时，使时间间隔到达（10～30s）。这样可以确保每只鼠在每次实验后有相等的时间来观察和获取空间信息。 空间探索试验： 隐蔽站台试验结束24h后，撤除站台。然后任选一相同入水点将鼠放入水中，记录鼠在60s或120s内的游泳路径，记录鼠在原站台象限的停留时间和穿越原站台次数，观察受试鼠的空间定位能力，及在空间探索过程中的变化规律。在电脑屏幕上用圆形环标记出站台原所在位置，这样可以记录穿越原站台所在位置的次数。 morris水迷宫实验准则（3）： 1、实验时间：隐蔽站台试验一般设计天数为4天或者6天，如果是年老体弱鼠可以将天数设计为4天。训练时间一般为60s或90s,也有
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Morris水迷宫实验准则（4）
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
-----统计方法学准则 潜伏期时间为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。计数资料，比如说穿越站台的次数，可用X2检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。 的实验数据较为复杂，其统计分析难度也较大，尤其是对大鼠在寻找隐蔽站台试验中所测得的逃避潜伏期如何进行统计学分析既往存在的问题较多。在过去的研究中，国内文献中有的直接计算每天的平均逃避潜伏期后再进行t检验或方差分析，或根据大鼠的逃避潜伏期在定位航行试验后3d趋于稳定的情况，仅对后3d的平均逃避潜伏期进行t检验或方差分析。有的研究则就1～5d的逃避潜伏期进行单因素方差分析。我们认为以上统计方法均不正确。一个较明显的错误是，以趋于平稳的后3d的平均逃避潜伏期代表记忆水平，首先遇到的问题是仅在生理状态下的大鼠才表现如此，而实验记忆损伤组大鼠往往后3d的逃避潜伏期仍然持续下降。正常青年组和初老年组大鼠的逃避潜伏期在后3d趋于平稳，但实验损伤组大鼠的逃避潜伏期由于学习记忆损伤后其基线较高，第3～5天逃避潜伏期仍然呈下降的趋势，并不象正常对照组一样趋于稳定。不仅如此，还存在上述统计方法对隐蔽站台试验中测得的逃避潜伏期数据统计学特征的认识错误。隐蔽站台试验中的逃避潜伏期具有以下特点：①系重复测量设计，Morris水迷宫实验准则（4）即在给予某种处理后，在不同的时间点上从同一受试对象上重复测量获得的数据(逃避潜伏期)；②影响逃避潜伏期(自变量)统计分析结果的至少有动物组别、检测时点等多个效应因子，效应因子之间存在交互影响效应；③同一受试动物的不同时间点所测得的逃避潜伏期存在高度
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morris水迷宫实验准则（5）
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
-----实验适用范围准则 与其他方法相比，在判定啮齿类动物认知功能中具有很多优点： （1）它不需要实验前训练阶段，而且可以在短时间内完成相对大量的动物。 （2）由于对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，Morris水迷宫是判断老年鼠空间学习记忆能力的特别有用的工具。通过探测和转移位置实验的训练，学习和回忆过程可以被记录分析，也可以在各组之间比较。 （3）虽然对于鼠类来说浸入水中是令其厌恶的，驱动动物逃避的是水刺激，而不需要食物剥夺和电击，因此，避免了剥夺食物给实验动物带来的新陈代谢和电击休克方面的问题，而这方面问题对某些品系的动物来说可能是危险的。 （4）气味或痕迹等干扰可以被去除。 （5）将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰。可见站台实验，可以识别可能影响实验结果的动物视觉缺陷，修正标准Morris水迷宫实验中得到的结果。 （6）通过改变站台的位置，可以完成学习和再学习实验，相应的，在同组动物中也可以测量不同用药量的效果。 （7）既可以检测空间参考记忆又可以检测空间工作记忆。在用固定平台测试小鼠的空间参考记忆后再将平台的位置改为不固定，就可检测它们的工作记忆能力 （8）通过使用窗帘、划分区域等，可以减少实验人员和实验以外的物体对视频跟踪系统记录的干扰。 （9）能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平，显然，寻找不固定平台的认知过程要复杂一些，需要动物对时间和空间上的分离信息加以整合和判断。 （10）操作简便，数据误差较小。 1、Morris水迷宫实验在神经退行性疾病如阿尔茨海默症（AD）和帕金森症（PD）以及血管性痴呆（VD）等的研究方面是非常有效的：这些疾病的最大特征是认知功能的减退。经典的Morris水迷宫所检测的是大鼠在多次的训练中，学会寻找固定位置的隐蔽平台，形成稳定的空间位置认知，这种空间认知是加工空间信息（外部线索）形成的
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神经功能行为、放射学及病理结果的变化
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一种慢性颈段脊髓压迫的大鼠模型的建立：神经功能行为、放射学及病理结果的变化 摘要： 颈髓病是由于脊柱退行变造成的脊髓的慢性部分受压所致。不管怎么样，慢性颈髓受压的确切机制还没有完全清楚。本研究的目的旨在建立一种有效的新的没有锥板切除的慢性脊髓压迫动物模型，来复制临床过程。系在一块塑料板上的聚乙烯线，用来绑在一个月大的大鼠的C4椎体上，缠绕三圈。术后，随着椎管和椎体的生长，聚乙烯线逐渐长入椎管背侧的骨头里，而产生脊髓渐进性的压缩。结果表明：在形成颈椎管狭窄9个月后，颈椎管狭窄模型的大鼠出现运动障碍和感觉障碍；然而，直到6个月才出现临床症状。12个月后，70%的颈椎管狭窄模型大鼠出现了脊髓内高信号。在病理切片，在形成颈椎管狭窄12个月后脊髓整个周围压缩。运动神经元数目减少，白质显示华勒氏变性。本模型也许能够复制临床慢性颈髓压迫的特征性临床特点，包括在潜伏期和隐形神经云减少后出现，进行性运动和感觉功能，以及代表了人类慢性颈髓压迫。 关键字：动物研究；行为评估；核磁共振；神经元死亡；脊髓损伤。 引言： 一般认为，慢性压迫脊髓病的病因与颈椎的病理特点相关，例如椎关节硬化，韧带骨化，椎管狭窄，以及椎间盘突出，或许由机械性压迫和血管病变两种因素引起所致。慢性压迫性脊髓病隐匿性地和进展性地损伤运动和感觉动能。很多病人数年没有临床症状，尽管这个时期内存在脊髓压迫和缺陷，一旦本疾病出现临床症状，神功功能障碍进行性加重，很少有逆转。随机选择的有症状队列的颈部核磁共振检查的一项研究表明大于64岁的受试者26%出现脊髓损伤，45-64岁受试者16%出现脊髓损伤。临床上，即使那些由神经影像学确诊的严重，检查经常显示不可预料的非重要性神经功能发现，和手术减压后的可观的神经恢复也许是可以预料到。因此，慢性脊髓压迫的一个急性脊髓损伤没有的特点就是脊髓的可塑性。到目前为止，临床上慢性颈髓术后效果在持续提高。不管怎样，仍有一些不满意
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脑立体定位仪实验使用方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
脑立体定位仪实验使用方法 一、实验目的 1. 了解脑立体定位技术。 2. 掌握脑立体定位仪及脑图谱的使用方法。 二、实验原理 脑立体定位技术被广泛的运用于脑的损毁、刺激和脑电记录的精确定位中，成为研究脑结构和功能必不可少的工具。脑立体定位技术主要是使用脑立体定位仪作为定位仪器，利用某些颅骨外面的标志（如前囟、后囟、外耳道、眼眶、矢状缝等）或其它参考点所规定的三度坐标系统，来确定皮层下某些神经结构的位置，以便在非直视暴露下对其进行定向的刺激、破坏、注射药物、引导电位等研究，是神经解剖、神经生理、神经药理和神经外科等领域内的重要研究方法。常用的实验动物，如大鼠、小鼠、猫等高等哺乳动物以及鸟类，其均有完全的外耳道，可用（耳棒）来定位。在确定了颅外标记之后，就可按脑立体定位图谱所提供的数据进行定位操作。 三、实验器材 ZS-B脑立体定位仪（规格参数参考网站：），MC-5微操作仪，常规手术器械，钻孔针，纱布，干棉球，酒精，0.4%戊巴比妥钠（麻醉剂，现配现用），生理盐水，1ml注射器，3%双氧水， 小白鼠。 四、实验步骤 1.脑定位仪的使用 1.1 校验仪器 定位仪经过搬动或长期不用后，使用前需先加以校验。重点是检验电极移动架各滑尺是否保持直角，可用三角板测定各滑尺所成的角度是否是直角；各衔接部与螺丝有没有松动；滑尺是否太松；检查主框两臂的平行情况；最后观察固定头的装置两侧对称程度，小框是否与主框平行。检查仪器无故障后，可进行下列校验性操作： （1）将两侧耳杆柱旋松，在主框上前后滑动，然后再按照原规定刻度装好，看两侧耳杆尖是否完全对正。 （2）取下一侧耳杆，将一侧电极移动架装好，前后左右上下移动各滑尺，使装在电极夹上的金属定位针尖正对耳杆尖的中心，记下各滑尺的刻度读数，再卸下移动架再装上，并按上法测定耳杆尖的部位，记下三个滑尺的读数，反复操作取平均数首先将放置水平的脑立体定位仪上的两个滑道，按实验的要求调节好合适的高
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Morris水迷宫_Y迷宫_八臂迷宫实验原理与发展
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
20世纪80年代初,英国的心理学家Morris和他的同事利用大鼠在盛有水和牛奶混合物的不透明水池中搜索目标物的方法,研究大鼠的海马等脑区受到损害后的学习、记忆和空间定向以及认知能力时取得了令人瞩目的结果。这种装置不但构思新颖、实验设计合理以及方法简便和实用,而且便于观察和记录动物入水后搜索藏在水下平台所需的时间、采用的策略和它们的游泳轨迹,从而可分析和推断动物的学习、记忆和空间认知等方面的能力。虽然起初的实验对象为大鼠，但此后该迷宫系统成为评估啮齿类动物空间学习和记忆能力的经典程序，广泛运用于神经生物学、药理学等领域的基础和应用研究中。它能较客观地衡量动物空间记忆、工作记忆以及空间辨别能力的改变。因此,这种研究方法很快就引起各国神经科学家的关注,并将此法称为Morris水迷宫法。国外有许多生产Morris水迷宫的公司，比如说德国的TSE公司，美国的Sandiegoinstruments公司、德国Biobserve公司、荷兰Noldus等等；20世纪80年代末,并于90年代初建立了Morris水迷宫图像自动采集和处理系统。国内随后出现了许多Morris水迷宫生产厂家，北京众实迪创科技是专业生产行为学仪器的公司，但是从国际到国内，Morris水迷宫的硬件设备，软件系统，实验方法，以及实验数据的处理方法都不尽相同，因此，从Morris水迷宫法的发明到现在已有20余年的历史了，应该制定一套比较标准的实验准则了。 光源：要保证水池水面上没有光影，主要是要避免光线在水面的反射问题，以免留在水面的光照影子被软件的采集系统将光影和鼠的影子混淆；如果是白色的水池背景，就可以在水池上方用两根条形的发散日光灯，这样可以减少反射光在水面的背影；如果是黑色的水池背景，就在水池四个象限的上方放置4个60瓦的灯泡或25瓦的管灯，不用功率特别大的灯。灯泡的高度应该足够高，不能被摄像头捕获到。另外还可以在水池四周装一圈帘子（颜色一般是黑色、浅蓝色或者白色），这样可以将光的影子挡住，又保持一定的透光度。同时也
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旷场实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
【实验目的】 观察实验动物在新异环境中的自主行为、探究行为与紧张度。 【实验器材】 实验装置由旷场反应箱和数据自动采集和处理系统两部分组成，。大鼠旷场反应箱高400mm，底边长1000mm，内壁涂黑，底面平均分为25个4cm×4cm小方格，正上方2 m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部。旷场光照为全人工照明，可人为设定“白天”和“黑夜”，白天由两侧墙壁的4只节能灯发出约2001ux照度来模拟，夜晚由一侧墙的红外光源提供照明。实验人员和计算机等设备位于另一房间以减小对动物的干扰，实验室背景噪音控制在65dB以下。 小鼠旷场反应箱高25～30cm，底边长72cm，内壁涂黑，底面（软件）平均分为64个小方格。数据自动采集和处理系统同上。 【实验原理】 旷场实验（open field test)又称敞箱实验，是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等，反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为，以尿便次数反应其紧张度。 【实验动物】 大鼠或小鼠。 【实验方法与步骤】 实验在安静的环境下进行。将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察一定时间后停止摄像，观察时间可根据实验拟定，一般为3～5 min。清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息（如动物的大、小便、气味）影响下次测试结果。更换动物，继续实验。 【观察指标】 根据计算机软件设计不同可观察的参数不同，如单位时间内动物在中央格停留时间，某一肢体越过的格子数为水平得分(crossing)，后肢站立次数为垂直得分(rearing)，修饰次数，尿便次数；运动速度，运动距离，休息时间，沿边运动距离，中央运动距离等。 【注意事项】 （1）动物在24 h内有其活动周期，故每次实验应选择在同一时间段内完成。 （2）实验应在隔音，光强度和温、湿度适宜且保持一致的行为实验室内进行。 （3）两次实验之间清洗实验设备，以免上次动物余留信息影响下次实验
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巴恩斯（Barnes maze）迷宫实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
巴恩斯迷宫（Barnes maze）是美国学者Carol ABarnes1979年发明的用于检测动物空间记忆的模型。与水迷宫和放射臂迷宫类似，巴恩斯迷宫利用啮齿类动物避光喜暗且爱探究的特性而建立的。动物获得的强化是从一个光亮、敞开的平台上面逃往位于平台下面的一个黑暗、狭小的箱里。该箱称为目标箱。经过训练，动物学习并记忆目标箱的位置。该模型对动物的应激性刺激较小，既不像放射臂迷宫那样需要禁食，也不像水迷宫那样应激性强。因此，在记忆研究中较为常用。尤其适用于与应激相关的记忆研究以及基因敲除小鼠的行为表型研究。 （一） 巴恩斯迷宫。它是由特制医用有机板制成的一个圆形平台，可旋转，直径122cm。平台周边有18个或40个等距离圆洞，分别用于大鼠和小鼠；洞的直径分别为10cm和5cm。其中一个洞（称为目标洞）与一暗箱（即目标箱）相联。其他圆洞则为空洞，不与任何物体相联。暗箱设置成抽屉式，便于从中取出动物。从平台表面看不见目标箱。迷宫抬高140cm。动物通过目标洞可逃至目标箱内。对于小鼠巴恩斯迷宫的设置，也有不同的考虑。例如，有的将迷宫直径缩短（如88cm），洞的数目也减少（例如12个），洞的直径则与上述相当。据认为，这样的设置有利于增加小鼠获得比率。但不管用哪种设置，实验操作都类似。通过训练，动物获得对目标洞的空间定位。 （二） 巴恩斯迷宫实验方法 1． 实验开始前一天，将动物单个从目标洞置于目标箱内适应4min。 2． 将动物置于迷宫中央的塑料圆桶（直径20cm，高27cm）内限制活动5s。 3． 移开圆桶，启动计时器，实验者在挡帘后进行观察。动物四肢均进入目标箱，则计为一次逃避（escape）,并让动物在箱内停留30s。每一动物一次最多观察4min。在此期间如果动物仍然找不到目标箱，则将动物从迷宫移开，放入目标箱内并停留30s。利用这一间隙清洁迷宫。动物每天训练两次，连续5~6d。 4． 从第二次训练开始，每次训练之前将迷宫随机转动一至数个洞的位置，但目标箱始终固定在同一方位
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八避迷宫实验方法交流和T形迷宫实验方法交流
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
实验方法 1) 动物适应实验环境1周后，称重，禁食24小时。此后每天八臂迷宫训练结束后限制性地给予正常食料（据体重不同，大鼠16-20g，小鼠2-3g），以使体重保持在正常进食大鼠的80%~85%。 2) 第二天，迷宫各臂及中央区分撒着食物颗粒（每只4~5粒，直径约3~4mm）。然后，同时将4只动物置于迷宫中央（通往各臂的门打开）。让其自由摄食、探究10min。 3) 第三天，重复第二天的训练。这一过程让动物在没有很强的应激条件下熟悉迷宫环境。 4) 第四天起，动物单个进行训练：在每个臂靠近外端食盒处各放一颗食粒，让动物自由摄食。食粒吃完或10min后将动物取出。 5) 第五天，将食物放在食盒内，重复前一天的训练，一天2次。 6) 第六天以后，随机选4个臂，每个臂放一颗食粒；八臂迷宫各臂门关闭，将动物放在迷宫中央；30s后，臂门打开，让动物在迷宫中自由活动并摄取食粒，直到动物吃完所有4个臂的食粒。如经10min食粒仍未吃完，则实验终止。每天训练两次，其间间隔1h以上。 Xmaze动物行为学软件会自动记录以下4个指标：1工作记忆错误（working memory errors）2参考记忆错误（reference memory errors ）；3总的入臂次数；4测试时间，即动物吃完所有食粒所花的时间。 实验方法 A. 传统T-形迷宫实验 （1）适应 在T-形迷宫臂内分撒6粒食丸（45g），让大鼠适应迷宫5min，每天一次，连续5天。 （2）强迫选择训练 将大鼠放入主干臂的起始箱，打开闸门，让大鼠进入迷宫的主干臂。随机、交替选择左右两臂之一放入4粒食丸，同时关闭另一臂，使动物被迫选择食物强化臂并完成摄食；每天6次，连续4天。 （3）延迟位置匹配（delayed matching-to-position,DMP）训练 a）将动物放入闸门关闭的起始箱，打开闸门，让动物进入主干臂。 b）关闭一侧目标臂，强迫动物进入另一侧开放臂以获得2粒食丸奖赏。 c）立即（最短延迟，少于5s）将动物放回主干臂，开始匹配训练中的第二次训练；此时两个目标臂均开放。动物将两前肢
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感受态制备：大肠杆菌感受态细胞的制备、重组DNA的转化、克隆筛选
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2. 相关知识及原理 感受态细胞(Competent cells)： 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 转化的方法： 化学的方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。 重组质粒克隆的鉴定 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有a- 互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合a-互补现象来筛选。 a-互补现象： 因为许多载体都带
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细胞转染实验介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、实验目的 学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。 二、实验原理 上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。 上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。 本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。 三、实验材料与器材 1、材料 293T细胞 MyoD表达质粒和EGFP表达质粒 DMEM培养基 链霉素/青霉素（双抗） FCS（小牛血清） PBS（磷酸盐缓冲溶液） 胰酶/EDTA消化液 转染试剂（TransFast） 2、器材 20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 恒温水浴箱 台式离心机 35mm培养皿 转染管 15ml离心管 观察用倒置显微镜 荧光显微镜和CCD 四、 实验步骤 1、细胞传代 （1） 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 （2） 弃掉
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细胞转染：脂质体转染的几个实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
摘要： 本实验介绍了脂质体转染的几个方法。 实验原理 脂质 体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它适用于把DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 实验步骤 1. 操作步骤(方法一)： 1) 取6孔培养板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 105 个细胞的培养基，37℃、18% CO2 培养基40%-60%汇合时。 2) 转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量)。 A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。 B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。 轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 3) 转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。 4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。 5) 其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。 6) 注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2. 快速脂质体转染法操作步骤(方法二)： 1) 将细胞以5 x 105个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。 2) 在试管中配制DNA-脂质体复合物。 a. 在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。 b. 旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。
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感受态制备：枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备可以：（1）用于建立枯草芽孢杆菌转化体系；（2）用于其基因改造；（3）用于提高枯草芽孢杆菌生产性能相关研究。 实验方法 化学法 化学改进法 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 一、试剂配制 1. SP 盐 0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。 2. CAYE (100×) 2 % Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培养基 SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100×CAYE 溶液。 4. SPII 培养基 SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2 溶液。 5. SP-A Salts Solution(500 ml) （1）0.4% (NH4)2SO4 ：2 g （2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g （3）1.2% KH2PO4 ：6 g （4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g （5）121°C灭菌20 min。 6. SP-B Salts Solution(500 ml) （1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g （2）121°C灭菌20 min。 7. 100×CAYE Solution(100 ml) （1）2% Casamino acid ：2 g （2）10% Yeast Extract：10 g （3）121°C灭菌20 min。 8. SPI Medium(20 mL) SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL (1%V)Glucose(50%w/v，115°C灭菌20 min) ：200 μL (1%V)100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium(6 mL) SPI Medium：5.88mL (1%V)50mM CaCl2 ：60μL (1%V)250mM MgCl2：60μL 11. 100×EGTA Solution 10mmol/L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH 至pH8.0。 二、实验步骤 1. 准备新鲜的168 单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB 平板，37°C 培养箱培养12 h。 2. 转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB 培养基中，37°C，250 r/min 培养过夜。 3. 第二天上午取160 μl 培养液转接至8 ml SPI 培养基中，37°C，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)。 4. 取0.2 ml 生长至对数期末的培养液至2 ml SPII 培养基中，3
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感受态制备：酵母感受态细胞制备实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
酵母感受态细胞制备可以：（1）用于建立酵母转化体系；（2）用于酵母表达系统构建；（3）用于酵母其他分子生物学研究。 实验方法 化学法 试剂盒制备法 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 一、试剂与耗材 1. 试剂 细菌用-酵母提取物（Fisher）、 细菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、细菌用-琼脂粉、去离子水、甘油(Sigma)、二甲基亚砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸锂(Sigma)、鲑鱼精子细胞DNA(Invitrogen)、酵母无氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-吗啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。 2. 仪器 水浴锅(VWR)、离心机(Eppendorf)、30 °C摇床与恒温培养箱(VWR)、培养皿。 二、 试剂配方 1. YPDA液体或固体培养基 （1）1%酵母提取物： 10 g/L （2）2%胰蛋白胨： 20 g/L （3）2%葡萄糖：20 g/L 2. 转化液 （1）聚乙二醇3350(50 % (w/v)：260 μl （2）1 M醋酸锂：36 μl （3）SsDNA（10 mg/ml）：10 μl （4）质粒：3 μl （5）总计：360 μl 3. YNB+ MA 培养基（100 ml） （1）YNB：0.67 g （2）2-(N-吗啉代) 乙磺酸（20mM ）：0.39 g （3）腺嘌呤：0.01 g （4）琼脂粉：2g （5）葡萄糖：2g 三、制备步骤 1. 在转化实验的两天前，于YPDA培养基的平皿上活化酵母菌株。 2. 转化前一天，挑取活化的酵母细胞（单克隆）于YPDA液体培养基中，30°C，200 rpm培养过夜。 3. 将培养过夜的酵母细胞液按1：3的比例转接与新的YPDA液体培养基中，于30°C摇床内，200 rpm培养4 h。 4. 3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞，用0.5倍体积的无菌水洗酵母细胞。 5. 再次3 000 g 离心 5分钟。 6. 用0.01倍体积的无菌水重悬酵母细胞，并转入适宜的离心管中，20°C ，3 000 g 离心 5分钟。 7. 用0.01倍体积的无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞。 8. 将重悬的酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中。 9. 将管放入塑料盒或
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