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多糖多酚植物RNA快速提取的方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
操作步骤： 提示： （1） 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇! （2） 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液**现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。 1. 直接研磨法（推荐）: a. 新鲜植物组织称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵）， 加入10体积（1ml）RLT(请确定已加入β-巯基乙醇)和1体积（100μl） PLANTaid 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。 b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13，000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，取450μl裂解物上清转到一个新离心管。 c. 加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 d. 立刻接操作步骤项下3。 2. 液氮研磨法: a. 取500μl裂解液RLT(已经加入β-巯基乙醇)，转入1.5ml离心管中，加入50μl PLANTaid混匀备用。 b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管, 立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。 在56℃温育1-3分钟有助于裂解植物,但是淀粉含量高的植物不能温育,因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。 c. 用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。 d. 将裂解物13，000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid, 将所有裂解物上清转到一个新离心管。 e. 较精确估计裂解物(上清)体积,加入0.5体积的无水乙醇,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 f. 立刻接操作步骤项下3。 3. 将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，弃掉废液。
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真菌菌丝的总RNA的提取的操作方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
试剂： RNA提取缓冲液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置），25mM EDTA, 0.5g/L 亚精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。 SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8.0，1.0 mM EDTA 10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。 3M NaAc 氯仿:异戊醇（24:1） 酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1） DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌 无水乙醇 70%酒精 方法 1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。 2.取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀。 3. 65℃水浴3-10 min，期间混匀2-3次 4. 加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min） 5. 取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min） 6. 加入1/4V体积10M LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或过夜) 7. 10,000 rpm，4℃离心20 min 8. 弃上清，用500 ulSSTE溶解沉淀 9. 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次，氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000 rpm，4℃，5 min） 10. 加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上 11. 12,000 rpm，4℃离心20 min 12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥 13. 加200 ul的DEPC处理水溶解 14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量 （在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数） 注意：提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能
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超声波细胞粉碎机基本原理及特点
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
超声波细胞粉碎机是利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而使液体中的固体颗粒或细胞组织破碎． 超声波细胞粉碎机简述 超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用能引起生物体的功能和结构发生变化，即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热（42-43℃），因为正常组织的临界致死温度为45.7℃，而肿瘤组织比正常组织敏感性高，故在此温度下肿瘤细胞的代谢发生障碍，DNA、RNA、蛋白质合成受到影响，从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡，使肿瘤出血、组织瓦解以致坏死。另外，空化泡破裂时产生瞬时高温（约5000℃）、高压（可达500×104Pa），可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。杀伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。 超声波细胞粉碎机基本原理 超声波细胞粉碎机是利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而使液体中的固体颗粒或细胞组织破碎．超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器二大部分组成。超声波发生器将市电转变成18-21KHz交变电能供给换能器。锆钛酸钡压电振子是换能器的心脏，它随交变电压以18-21KHz频率作伸缩弹性形变，换能器随之作纵向机械振动。振动波通过浸入在生物溶液中的钛合金变幅杆产生空化效应，激发介质里的生物微粒剧烈振动。 超声波细胞粉碎机
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血清中 miRNA 抽提和实验设计经验谈
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
人体内的血液循环系统犹如印度的圣河 – 恒河，河水中携带的养分滋养着古老的大地；洗涤带走地上的ㄧ切污秽，人们的一生都在河水中完成。如此的恒河可以想象，河水中充斥着各种物质，有废物有养分，只要你想都可以从河水中捞取。同样的我们的循环系统如同恒河；流动的血液如同恒河水，身体所需的ㄧ切由血液运送，身体产生的废物也由血液清运，同样可以想象血中的成份也是包罗万象。如果我们想知道大地有多纯净或污染有多严重，只要取一瓢水加以检视就可以知道答案；而相同的想了解人的生理状况，取一滴血加以检验也可以知道端倪，但是做这些检测并非漫无目标的，必须要知道哪ㄧ些物质是所谓的指针，在生物体内的这些指针就是我们熟知的生物标记(biomarker)。生物标记的研究和应用已有ㄧ段光景，各项代谢疾病的筛检广泛的被使用，而在癌症的筛检也已经有ㄧ些不错的生物标记，例如 AFP (Alpha-fetoprotein)。顺着 microRNA (miRNA) 的发现和研究热潮，已经约有 1000 个 miRNA 被发掘表现于人体中，miRNA 调控人体内基因表现的生理功能也为人们所熟知，加上 miRNA 相对于蛋白质标志的高稳定性，伴随着检测技术的一日千里，让血液中的 miRNA 表现成为新一代寻找生物标记的标的。本文内容介绍主要是以实验室在操作血清 miRNA 的萃取和芯片实验所累积的经验，和读者分享实验上遇到的ㄧ些难题和解决的方法。 血液中 miRNA 的组成 血液中的 miRNA 到底是从何而来? 要往哪里去? 这些 miRNA 的生理功能是什么?以上这三个问题是很多研究人员关心的问题，事实上这些问题目前并没有很明确的答案，我们知道 miRNA 是内生性的短片段 RNA，长度约 17 到 23 核苷酸，miRNA 可以藉由和信息 RNA (mRNA) 结合诱导信息 RNA 的降解，进而调控信息 RNA 和相对蛋白的表现。根据一些论文的揭示1和实验室实际的操作经验显示，正常人的血液中 miRNA 的含量是极微量的，但是在病人和检体制备不佳的血液样本中却可抽取到较大量的 miRNA，根据
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真空干燥箱使用操作说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
使用操作说明书： 控制面板 2.1、VD23 控制面板 图 2 VD23 控制面板 （1）主电源开关 （2a）红色安全报警灯 （2）过热保护开关 （3）真空表 （4）气阀（进惰性气体或者空气） （7）程序控制器 RD3 （8）真空关闭阀 2.2、VD53/115 的控制面板 图 3 VD53/115 控制面板 （1）主电源开关 （2a）红色安全报警灯 （2）过热保护开关 （3）压力表 （5）气阀（进惰性气体） （6）气阀（进空气） （7）程序控制器 RD3 （8）真空关闭阀 东南科仪公司 中文仪器使用说明书 版权所有 不得翻印 违者必究 3、设备后面连接 图 4 VD 背面 （9）RS422 端口 （10）主电源线 （11）进惰性气体连接，适配器管尺寸为 8mm （12）真空连接口 （13）DIN 插座（操作 2 线）选择程控 （14）DIN 插座（操作 1 线）选择真空连接和泵 （15）测量连接口 （16）DIN 插座显示样品的温度 二、安装 1、安装环境应通风良好，温度低于 32ｏC，湿度小于 75%RH。 2、确保安真空烘箱装位置平稳，搬运时禁止抬门把手或门。 3、VD 真空干燥箱不能堆叠放置，如多台同型号真空箱摆放应之间距离最小 250mm。 4、连接正确的电源（230V±10%，50-60HZ） 。 5、连接真空泵（BINDER 的真空泵能力 1-30m３/h，抽真空可达 10ˉ２mbar） 东南科仪公司 中文仪器使用说明书 版权所有 不得翻印 违者必究 注意： 1、禁止放易燃、易爆物质到 VD 真空箱内。 2、环境温度不能超出 22ｏC 过多，否则不同的环境条件，相关指定的技术数据有偏差。 过高的环境温度可能导致 VD 真空箱内温度波动。 三、参数设置 图 5 程度控制 RD3 1、温度控制器 电源开关打到“1”处，显示屏 1 显示实际温度（室温） ，显示屏 2 显示设置温度。加热时， 加热指示灯亮，当到达设置温度时，加热指示灯灭。 2、温度设置 1、按 2、通过 3、按 4、通过 5、按 键一次 设置温度为 30℃ 键确认 设置开关状态为 000 键确认 6、调整安全控制器至适宜位置 7、加热灯亮，仪器开始加热至设置温度，然后进入保温状态 注意： 1、
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RNA的变性琼脂糖凝胶电泳实验原理、材料和操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、实验目的 学习RNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术。 二、实验原理 RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。 判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。 三、材料、试剂及器具 1、 材料 总RNA提取物。 2、 试剂 （1）0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 （2）10x电泳缓冲液。 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） 0.4mol/L（pH 7.0） NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L （3）50mL变性琼脂糖凝胶（1%） （4）10x电泳缓冲液 5 mL 琼脂糖 0.5 g 0.1%DEPC水 36.5 mL 加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。 （5）上样缓冲液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。 （6）甲酰胺（去离子）。 3、器具 （1）电泳系统 （2）紫外透视仪 四、操作步骤 1、 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。 2、 制胶： 称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 3、 加样： 在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：电泳缓冲液（10x）2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。 4、 电泳： 打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。 5、 电泳结束后通过紫外透视仪观察。 五、注意事项 本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。
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Northern blot实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。 实验方法 Northern blot技术 Northern Blot 实验方法原理 Northern blot的基本概述是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移至尼龙膜等固相膜载体上，用放射性或非放射性标记DNA或RNA特异性探针对固定于固相膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除非特异性结合杂交信号，经放射自显影或现色反应，对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小；对杂交信号的强弱比较，可以知晓该基因表达mRNA水平的强弱。 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 一、RNA转移与固定 1. 变性琼脂糖电泳分离总RNA样品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝胶片刻，10×SSC中浸泡平衡凝胶30 min。 2. 按southern blot实验中DNA转移方法及装置转移总RNA至尼龙膜上（过程中注意无RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干，夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。 4. RNA染色，干燥的尼龙膜先于5%冰乙酸中室温浸泡15 min。5. 于0.5 mol/L 乙酸钠和0.04%亚甲蓝溶液中浸泡5~10 min。6. 去离子水淋洗膜5~10 min，可见RNA标准及28s及18 sRNA的条带，软铅笔标记。 二、预杂交、杂交及显色 1. Washing buffer润洗1遍（3~5 min）。 2. 100 ml blocking buffer工作液封闭30 min。 3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。 4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。 5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。 6. 将尼龙膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光数min至1天（出现颜色时不
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细胞质RNA提取实验操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。 实验方法 基本方案 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 1. 对于单层培奍细胞（1）每10 cm 培养皿培养的细胞，用冰冷PBS洗涤3次。（2）每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞，转移至冰浴的离心管中。（3）300 g 离心5 min，弃上清，继续冰浴。 2. 对于悬浮培养细胞（1）300 g 离心5 min，弃上请。（2）细胞以1/2原体积的冰冷重悬，再离心后弃上清。 3. 重悬细胞于375 μl 冰冷的细胞裂解缓冲液，并置冰浴5 min。4. 于4℃在微量离心机中离心2 min，将上清移至一个洁净的已加有5 μl 20%SDS的管中，立即在旋涡混合器上振荡。 5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K，37℃温育15 min。 6. 加入400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提，在旋涡混合器上振荡用微量离心机离心，上清移至干净的离心管中，重复抽提1遍。7. 再以400 μl 氯仿/异戊醇抽棰，上层水相转移至干净的离心管中。8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸钠缓冲液（pH7.5），再加无水乙醇，混匀后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃过夜。 9. 用微量离心机4℃离心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸钠（pH5.2）冼涤沉淀。10. 干燥后用100 μl 处理过的水重溶沉淀，取10 μl RNA稀释于1 ml 水中，测A280和A260，其与的RNA可在-70℃贮存。
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核糖核酸酶保护分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、体外转录 在无菌1.5 ml 微型离心管中，结合以下内容： 4 ul 5倍转录缓冲液 2 ul 0.1 M DTT 4 ul 2.5 MM NTP（A，C，G） 0.8 ul RNA酶抑制剂（25 U/ul）RNA酶抑制剂（Promega）中 100 UM冷UTP 1 ul/ug UL线性DNA模板 5 ul 10 UCI / UL P32 UTP（800Ci/mmol） 1 ul RNA聚合酶SP6，T7或T3 总体积〜20 ul。 孵育1小时，37℃。 2 ul 每个转录的DNA酶I，孵育20分钟， 37℃。 二、探头净化 净化探头使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除试剂盒或Boehringer离心柱（G50葡聚糖凝胶）。检查1 ul 在闪烁计数器，P32通道。一个很好的探头将5×105~1×106 CPM。 三、杂交 打开heatblock到95C。对于在水或乙醇中的样品，干燥适当的RNA量，并包括一个管与1 ul tRNA或糖原（Sigma公司），这是作为阴性对照。 每个样品应具有以下： 24 ul 甲酰胺 2 ul 0.6 M管 2.4 ul 5 M氯化钠 0.3 ul 0.1 M EDTA 2×105 cpm探针 5×104 cpm加载控制探针 DEPC水 总体积30ul 以及混合样品。加热95℃，10分钟。孵育4小时， 55°C。 四、RNase消化 核糖核酸酶消化缓冲液： 300 MM 醋酸钠 10 mM 的TRIS 5 mM EDTA 每个样品添加350 ul 消化缓冲液。 1 ul 4 mg/ml 核糖核酸酶A和0.4 ul 10 u/ul 核糖核酸酶T1。 孵育，30℃，45分钟至1小时。 五、蛋白酶K 向每个样品中添加20%SDS和2.5 ul 的10 mg/ml 的蛋白酶K孵育，37℃ 10 μl 的15-20分钟。 六：清理 提取一次400 ul 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 将上清转移到新的试管中。加入1000 ul 的100%乙醇和1 μl 为10 mg/ml 的糖原。拌匀。 在-70℃，30分钟或在干冰/ ETOH浴中10分钟孵育样品。 旋转的离心15分钟。吸EtOH。让小球在空气中晾干。 重悬在8 ul 甲酰胺的装载染料。允许坐在RT 5-10分钟，经常搅拌。 七：聚凝胶电泳分析 热样品5分钟，100℃。加载到5%polyacrylamide/7 M尿素变性凝胶2000 cpm 的分子量标记物。运行凝胶38-42mA。干凝胶，暴露于膜O / N在-70C增感屏。
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实验鼠的生理数据介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
小鼠 体温38(37～39)℃，呼吸频率163(84～230)次/分，心跳频率625(470～780)次/分，耗氧量1530mm2/g活体重，通气量24(11～36)ml/分，潮气量0.15(0.09～0.23)ml，收缩压113(95～125)mmHg、舒张压81(67～90)mmHg，红细胞总数9.3(7.7～12.5)百万/mm3，血红蛋白14.8(10～19)g/100ml，白细胞总数8.0(6～12)千/mm3，总蛋白4.8(4.2～5.5)g。 大鼠 体温：39(38.5～39.5)℃，心跳频率475(370～580)次/分，呼吸频率85.5(66～114)次/分，通气量7.3(5-10.1)ml/分，潮气量0.86(0.6～1.25)ml，耗氧量2000mm3/g体重，麻醉时收缩压116(88～138)mmHg红细胞总数8.9(7.2～9.6)百万mm3,血红蛋白14.8(12～17.5)g/100ml血，白细胞总数：5000～15000/mm3,血小板10～30万/mm3，血容量占体重的7.4%，红细胞比重1.090,总蛋白7.2(6.9～7.6)g。 豚鼠 正常体温38.6(37.8～39.5)℃，心跳频率280(200～360)次/分，呼吸频率90(69～104)次/分，潮气量1.8(1.0～3.9)ml，通气率16ml(10～28)/分，耗氧量816mm3/g活体重，血压75-120mmHg，红细胞总数5.6(4.5～7.0)百万/(mm3)，血红蛋白14.4(11～16.5)g/100ml血，白细胞总数5000～6000mm3,血小板11.6万/mm3，血浆总蛋白5.4(5.0～5.6)g，血容量占体重的6.4%，染色体32对，寿命5～7年。 金地鼠 心率为400次/分，呼吸频率73.6(33～127)次/分，呼吸量60(33.3～82.8)ml/分，在20～21℃血液量为体重的5%，寿命为的条件下，每小时每克体重要消耗氧2.3ml。颈动脉血压，8～12周龄时为78.7～101.3mmHg，12～17月龄为64.3～88.3mmgHg，17～24月龄为65.5～92.5mmHg，24月龄以上为62.0～91.8mmHg，红细胞总数5.9～8.3百万/mm3，血红蛋白14.85～16.20g/100ml血，白细胞总数7.200～8.480／mm3，成年地鼠2.5～3.0年。
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中医动物模型的研制方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
中医动物模型是根据中医理论，对人类疾病原型的某些特征进行模拟复制，创造出的人工疾病和证的实验动物。通过对动物模型的研究，探讨证的实质，提示辨证论治的基本规律，规范中药及复方的使用，使实验中医学与临床有机地结合，才能使中医理论的发展有所突破，从而有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施。 中医动物模型的建立，其造模方法的选择至关重要，造模方法大致可归纳为如下三种类型。 一、模拟中医传统病因建立动物模型 此类模型是依据中医传统理论，以研制开发“纯”中医病证动物模型为目的，一般不与现代医学疾病模型相等，造模方法有单因素和复合因素两种。 1. 单因素造模：如根据中医“恐伤肾”原理，采用猫吓孕鼠法，得到子代先天肾虚模型；用耗气破气理论，以中药(大黄、厚朴、枳实)灌喂大鼠，塑造脾气虚动物模型；以寒邪伤阳、迟脉主寒证的原理，用寒冷刺激法(大鼠在零下15C的冷环境中，持续4H左右)，复制“迟脉”模型，然后应用温阳活血中药(附子、党参、丹参、红花等)使其复健。 2. 复合因素造模：用睡眠剥夺的小站台法，模拟中医理论的“惊”和“劳”等病因，在大鼠身上建立心虚证模型；用中医先天不足和后天失养的病因，复制仔兔体弱易感动物模型，以“捋捏、三揉、三里求”的按摩手法复健，表明此法具有扶正祛邪的作用；采用麻黄汤发汗复加风寒刺激和高温发汗复加风寒刺激制作小鼠卫气虚动物模型，玉屏风散对此模型具有纠正作用；根据血虚证其因不外生血少和耗血多两个方面的理论，用放血和限制饮食法复制“血虚”动物模型；采用饥饿、酒醋及大黄等综合方法塑造“脾虚证”大鼠模型，并经四君子汤在辰、戌两时**，结果提示，戌时比辰时**效果好。 二、采用西医病因病理复制动物模型 此种模型多是在特定的化学、生物、机械和物理的致病因素作用下，复制出西医或中医病名的动物模型，或再用中药或中医疗法观察疗效及监测病理改变，其在造模时重视动物
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实验动物给药量的确定
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
在观察一个药物的作用时，应该给动物多在的剂量是实验开始时应确定的一个重要问题。剂量太小，作用不明显，剂量太大，又可能引起动物中毒致死，可以按下述方法确定剂量： 1．先用小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一为应用剂量，一般可取1/10-1/5。 2．植物药粗制剂的剂量多按生药折算。 3．化学可参考化学结构相似的已知药物，特别是化学结构和作用都相似的药物的剂量。 4．确定剂量后，如第一次实验的作用不明显，动物也没有中毒的表现（体重下降、精神不振、活动减少或其他症状），可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，**同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。 5．用大动物进行实验时，开始的剂量可采用给鼠类剂量的十五分之一～二分之一，以后可根据动物的反应调整剂量。 6．确定动物给药剂量时，要考虑给药动物的年龄大小和体质强弱。一般说确定的给药剂量是指成年动物的，如是幼小动物，剂量应减少。如以狗为例：6个月以上的狗给药量为1份时，3-6个月的给1/2份，45-89日1/4份，20-44日的给1/8份，10-19日的给1/16份。 7．确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，所用剂量也不同，以口服量为100时，灌肠量应为100-200，皮下注射量30-50，肌肉注射量为25-30，静脉注射量为25。
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Y迷宫实验方法与步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
1． 筛（预)选 （1）将大鼠放入Y-迷宫箱中适应3～5min后，给予适当电击至其对3臂均探索进入为止。选择活跃，对电击反应较敏感，逃避反应迅速者供测试用。淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠。 （2）预选出达到电击次数≤3次时连续2次正确反应的动物，即对电击反应较敏感的大鼠供实验用。 （3）在上述初步筛选的基础上，通过正式迷宫训练，淘汰达不到学会标准(学不会)的大鼠。 2． 正误判定的标准 大鼠受电击后从起步区直接逃到安全区或通电后10s内一次性跑向安全区为“正确反应”，若逃到无灯光的任何另一臂，则记为错误反应。 3． 达标（学会）标准 （1）连续10次中有9次或以上正确反应(正确反应率≥90％)定为学会标准。 （２）每个实验日进行20次训练测试，错误反应次数（errors number EN）≤2次。全天总反应时间（total reaction time TRT）≤120s作为判定大鼠学会的标准。因为EN反映大鼠反应的正确程度，TRT反映大鼠反应时间的长短，可综合评价大鼠的学习记忆能力，因而此标准更为合理。 以上为每只大鼠达标(学会)标准，全组大鼠达标(学会)标准为全组正确率(学会动物数／该组动物总数×100％)达85％以上。 4． 学习测试 实验时先将大鼠放入迷宫中适应3～5min，然后再开始正式实验。 （1）随机休息法：安全区以无规则次序变换，以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力，大鼠受电击后逃到安全区后，灯光继续作用10～15s，熄灯后结束一次测试，大鼠所在支臂就作为下一次测试的起点，两次测试时间间隔为30s或休息1min 后再予以第2次测试，依次重复，测试至达连续9／10标准。 （2）随机不休息法：安全区以无规则的次序变换开始时，对大白鼠所在支臂与另一支臂通电，动物在电击下逃窜至灯光区后再保持l0s或30s为一次测试。然后动物所在支臂为下次测试的起始位置进行下一次测试。 （3）顺序法：三臂末端按Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂轮流作为起步区或安全区。 以上方法还可以分为两类：①每天固定训练
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场景恐惧的实验方法介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
分为训练和测试两阶段 （一）训练阶段（第一天） 1．调试仪器，以确保格栅地板有电流刺激，扩音器有声音刺激，并分别记录电流强度和声音强度（分贝）。 2．将大鼠放入条件恐惧箱2min（A相），记录这最初2min内动物的凝滞（freezing）时间作基线。 3．接着加入卡嗒声，80Db,30s(B相)。 4．紧接着再给予电击，0.35mA，2s（C相），完成一轮训练。如需要多轮训练，则重复A、B、C三相训练即可。 5．记录整个训练阶段动物凝滞时间（s），用以测量动物的非条件恐惧（unconditioned fear）。 6．将大鼠移开操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液彻底清洁操作箱，以备进行下一批动物的训练。 （二）测试阶段 在训练后的第二天进行，包括关联（context）测试、变更关联（altered context）或条件刺激前（pre-conditioning-stimulus，pre-CS）测试以及条件刺激（conditioning stimulus，CS）测试。测试阶段没有电击刺激。关联测试和变更关联测试中也没有听觉条件刺激，但每只动物所用的操作箱应与训练阶段的相同。 1．关联测试 将动物放入箱内，计算机自动记录动物的凝滞行为。若用人工观察，则观察者（应不知道动物的处理或基因型）用静声秒表通过箱门上的猫眼（小窗口）观察动物的行为并计分：凝滞为1分，活动（moving）为0分（也有只记录凝滞时间）。每10秒观察一次，共5min，这样可记录到30次（bout）可能的凝滞（即最大凝滞得分为30分）。用在这一阶段记录到的、动物在同一操作箱内的凝滞时间测量动物的关联条件恐惧（contextually conditioned fear）。此为关联测试。观察结束后将动物放回笼内，清洁操作箱，进行下一只动物的观察。
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改善记忆作用检验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
1动物实验 1.1跳台实验 1.1.1原理 反应箱底铺有通36v电的铜栅，动物受到电击，其正常反应是跳上箱内绝缘的平台以避免伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台，如此训练5min，并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数，以此作为学习成绩。24h或48h重作测验，此即记忆保持测验。记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数。停止训练5天后（也可以在训练后的一周、两周或其它时间点）进行记忆消退实验。 1.1.2仪器与试剂 跳台仪：该装置为10×10×60cm3的被动回避条件反射箱，用黑色塑料板分隔成5间。底面铺以铜栅，间距为0.5cm，可以通电，电压强度由一变压器控制。每间左后角置一高和直径均为4.5cm的绝缘平台。 试剂：樟柳碱、环已酰亚胺、乙醇。 1.1.3实验方法 1.1.3.1实验动物 断乳鼠，体重10g左右；或成年鼠，体重18-22g用于改善老年人记忆的产品必须采用成年鼠。雌雄均可，单一性别不少于10只（最后有效数据）。推荐使用近交系小鼠。 1.1.3.2剂量设计和分组 共设高、中、低、对照四个组，根据推荐的人体每日每公斤体重摄入量，扩大10倍作为其中一个剂量组，根据受试样品的具体情况另设两个剂量组。经口给样。原则上连续给样30天，也可根据实验需要自行设定给样期限。 1.1.3.3实验方法及步骤 1.1.3.3.1受试样品对正常小鼠记忆的影响 末次给样后次日（或一次给样后1h）开始训练。将动物放入反应箱内（台上、台下）适应环境3min，然后将动物放置反应箱内的铜栅上，立即通以36v的交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台（绝缘体），以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台上。训练一次后，将动物放在反应箱内的平台上，记录5min内各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期，以此作为学习成绩（记忆获得）。24或48h后进行重测验，将小鼠放在平台上，记录各鼠第一次跳下平台的潜伏期、各鼠3min内电击次数和
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