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细胞凋亡，细胞凋亡通路和细胞凋亡检测的几种检测方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、形态学观察方法 1、HE染色、光镜观察：细胞凋亡后呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 2、丫啶橙(AO)染色，观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。细胞凋亡|后（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测）核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 3、台盼蓝染色：（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测）：如果不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察：（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测）：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近吞噬现象。 二、 (一)、检测原理（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测） 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但细胞凋亡后DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180-200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 (二) 细胞凋亡，结果判断 正常活细胞 电泳出现阶梯状(LADDER)条带; （细胞凋亡）后，坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测） 细胞凋亡的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测，细胞凋亡。 (一) （细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测）检测步骤 1、细胞凋亡后，将其裂解后高速离心，其上清液中含有核小体 2、在微定量板上吸附组蛋白体 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DN
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细胞技术专题：小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养可以：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因**研究。 实验方法 腹腔取材法 实验方法原理 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。 实验材料 小鼠 试剂、试剂盒 RPMI1640培养基 酚红 酒精 小牛血清 巯基乙醇酸钠 双抗 培养液 小牛血清 青霉素 链霉素 台盼兰 碘酒 仪器、耗材 绵球 手术直剪 注射器 培养皿 超净台 解剖板 眼科剪 离心管 眼科镊 实验步骤 一、实验材料准备 1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。 2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。 3. 器械：一次性注射器、手术器械。 二、实验方法 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。 1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。 2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。 3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法
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细胞技术专题：大鼠主动脉内皮细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
大鼠血管内皮细胞培养可以：（1）用于血液流动性、防止血栓形成、调节血管张力等研究；（2）用于选择性通透性以及免疫调节等方面研究。 实验方法 贴块法 实验方法原理 贴块法适用于内皮细胞产量低的、管径较小血管的内皮细胞培养，其方法较酶消化法简便、经济。但缺点使易混有成纤维细胞和平滑肌细胞，前者的贴壁时间和内皮接近，后者贴壁较内皮慢，而且会被肝素所抑制。 实验材料 雄性Wistar大鼠 试剂、试剂盒 DMEM 胎牛血清 内皮细胞生长因子 肝素钠 青链霉素 明胶 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液 仪器、耗材 手术器械 眼科剪 眼科镊 培养皿 手术刀 培养瓶 CO2培养箱 实验步骤 一、实验方法 1. 颈椎脱臼处死大鼠，将整个大鼠浸泡于75%乙醇中消毒约1 min。在无菌状态下，逐层剪开胸腔，分离取出主动脉，放含无菌 D-Hanks’液培养皿中。 2. 用眼科剪、镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织。然后，用含抗生素的D-Hanks’液冲洗血管的外表面及血管腔内的凝血数次，再放入另一无菌培养皿中。 3. 用眼科剪纵向剪开血管，平展在培养皿中。用非常锐利的手术刀将其切成1 mm3 大小的动脉植 块(或者用剪刀剪，依照个人习惯)，然后种植到培养瓶或培养皿(培养瓶或皿用1%明胶预置 37℃下过夜， 使用前2 h 移入CO2培养箱中。用时可以先经含 10%小牛血清的培养液冲洗)。将动脉植块的内膜面与瓶底接触，种植密度约为 1 块/cm2 。 4. 置培养箱中静置2 h(干贴壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培养液，液量以略盖过动脉植块内膜面，而又不使植块漂浮为宜。24 h 后，更换培养液，加入 2-3 ml 培养液。 5. 72 h 左右的时候，当观察到内皮细胞充分长出，而成纤维细胞刚要长出的时候，将动脉植块除去，刮除成纤维细胞，换培养液1 次。以后每2 天换液一次，每次换1/2~1/3 的液量。继续培养 8-10 d， 细胞融合成单层，即可传代。二、实验结果 植块培养法进行的原代培养，一般在培养2-3 天，动脉植块周围即有细胞生长，并渐
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细胞技术专题：细胞周期测定实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
标签： 细胞周期 体外培养 周期测定 细胞周期测定可以：（1）作为生物相容性评价指标；（2）用于研究细胞凋亡；（3）作为选择细胞的依据。 实验方法 细胞计数法 BrdU渗入法 流式细胞仪测定法 实验方法原理 体外培养细胞 生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 分裂指数指细胞 群体中分裂细胞 所占的百分比，它是测定细胞 周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 实验材料 细胞 试剂、试剂盒 胰酶 甲醇 培养液 冰醋酸 Giemsa染液 仪器、耗材 CO2培养箱 普通显微镜 培养皿 盖玻片 吸管 实验步骤 一、消化细胞 ，将细胞 悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。 三、取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。 四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 五、计算分裂指数=分裂细胞 数/总细胞 数×100% 注意事项 1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 其他 一、Giemsa染液配制称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。56℃中保温90-120分钟。加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。 实验方法原理 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另
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细胞技术专题：平板细胞克隆形成试验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
概念： 细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
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细胞技术专题：细胞划痕实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
材料： 6孔板 marker笔 直尺 20微升枪头（灭菌） 无血清培养基 PBS 准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内） 流程： 1、先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2、在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。 3、第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜。 4、用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。 5、放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样，拍照。
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细胞技术专题：肿瘤细胞侵袭试验（Tumour Invasion Assay）介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一 、 原理 Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 二 、 材料 1、Matrigel 基质胶（威格拉斯生物技术（北京）有限公司），10mg/ml，5ml，分装成0.5ml/只10个EP管中；用时加
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细胞技术专题：小鼠肝细胞原代培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
小鼠肝细胞原代培养可以：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因**研究。 实验方法 胰酶消化法 实验方法原理 将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 实验材料 小鼠 试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM培养基 胰酶 PBS 仪器、耗材 饭盒 纱布 剪子 镊子 烧杯 平皿 研磨玻片 滤网 离心管 6孔培养板 吸管 移液管 手套 微量加样器 实验步骤 一、实验材料准备 1. 动物：小鼠。 2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS。 3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。 4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。 二、方法 1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。 2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。 4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。 6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。 7. 再次离心5 min，弃上清液。 8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。 10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养
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细胞技术专题：光学显微镜检测肿瘤细胞形态实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
光学显微镜检测肿瘤细胞形态可以：（1）辅助判断肿瘤细胞是否凋亡；（2）用于病理检查；（3）提取肿瘤细胞微细结构信息。 实验方法 瑞氏-吉姆萨混染法 HE染色法 实验方法原理 吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。 1）嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质； 2）细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质； 3）中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。 PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均分布蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清洁，无酸碱污染。配制必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。 用途：适合大多数细胞组织的染色，包括血涂片、各种组织石蜡切片、冰冻切片、以及各种培养细胞。染色体显带、多种微生物的鉴别染色和细胞凋亡的检测等。 实验材料 肿瘤细胞 试剂、试剂盒 甲醛 二甲苯 Gimsa染液 Sorensen磷酸缓冲液 香柏油 蒸馏水 仪器、耗材 光学显微镜 树胶 载玻片 盖玻片 洗瓶 离心机 离心管 实验步骤 一、试剂配制 1. 瑞氏染液配制 称瑞氏染料0.1 g于研钵，少量多次加入AR级甲醇至完全溶解，后补充至60 ml棕色瓶密封保存，可加3 ml甘油防止挥发。 2. 吉姆萨染液配制 0.1 g吉姆萨染料放入有6.6 ml甘油的圆锥烧瓶内，56度，水浴90-120 min，当染料与甘油充分混合后加入6.6 ml甲醇，充分摇匀后过滤，棕色瓶室温可保存一周。 二、染色 1. 收集细胞制成悬液后涂片、晾干。悬浮培养细胞离心收集。贴壁细胞可直接培养在载玻片上。组织取材需机械零散。
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细胞技术专题：大鼠乳鼠成骨细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
大鼠乳鼠成骨细胞培养培养可以：（1）获得大鼠乳鼠成骨细胞；（2）用于骨修复的细胞学机制研究。 实验方法 酶消化法 实验方法原理 取材于出生2~3 d 小鼠颅骨，以含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养，采用胶原酶消化法分离成骨细胞，并进行细胞接种与传代。采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法。 实验材料 SD大鼠 试剂、试剂盒 F12 完全培养液 胰蛋白酶 Ⅱ型胶原酶 酒精 仪器、耗材 手术器械 磁力搅拌器 实验步骤 一、实验步骤 1. 拉颈处死24 小时内新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出头盖骨，分离顶骨和额骨，冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血，放入另一盛有F12 完全培基液的培养皿中再洗涤， 将颅骨剪成2～5 mm2 碎片，将洗涤过的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 预消化15 min，以清除纤维组织细胞，弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。 2. 然后以0.1% Ⅱ型胶原酶10 ml，在37℃环境中消化 20 分钟，室温下磁力搅拌消化20 分钟。静置数分钟，收集消化液，室温下以1200 rpm离心10 分钟。去除上清液，用20% 胎牛血清的F12 培养液4 ml 悬 浮细胞，接种于75 ml 培养瓶中，补培养液8 ml 使每瓶液体量达到12 ml；对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20 分钟、磁力搅拌消化15 分钟、离心10 分钟，将获得的3 瓶细胞放置于二氧化碳培养箱，在5% CO2，95%空气，37℃温度下培养，24 小时后可见细胞贴壁生长，胞质开始伸展，换新鲜培养液，以后每隔48 小时换培养液(注：消化视具体情况而定，也可多消化 1 遍)。 3. 原代培养一般接种后第7 天能长满。传代时，取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞 1 瓶，弃去培养 液，传代时先以 PBS 冲洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml，室温下消化3～5 分钟，将胰蛋白酶液弃去，加 F12 培养液充分吹打8-10 分钟。将已消化的细胞收集、合并，计数；用 F12 完全培基调节至细胞浓度为合适浓 度。一般取2-5 代成骨
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细胞技术专题：大鼠胰岛细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
实验方法原理 水合氯醛腹腔麻醉，采用胶原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度离心的方法分离、纯化大鼠胰岛，并分离、培养胰岛单细胞。 实验材料 一周龄Wistar 大鼠 试剂、试剂盒 D-Hanks’液 胰蛋白酶 Ⅴ型胶原酶 葡萄糖 碘乙酸 仪器、耗材 手术剪 手术钳 眼科剪刀 眼科镊子 大头针 手术刀片 培养皿 实验步骤 一、实验步骤 1. 一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15 分钟，无菌取出胰腺，于冰冷无菌D-Hanks’液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中。 2. 加入少量无菌D-Hanks’液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks’液反复清洗 8~10 次，加入10 倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05 g 胰蛋白酶，0.025 g Ⅴ型胶原酶(663 U/mg)，0.05 g 葡萄糖，溶于100mL 无Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS(pH 值为 7.4)溶液，用0.22 µm 微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10 分钟后弃去上清液。 3. 用无菌D-Hanks’液将组织块清洗 2~3 次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤，此时组织块边缘模糊。 4. 将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10 分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500 rpm离心 10 分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks’悬浮，离心，重复 1~2 次，再用培养基洗 2~3 次，用培养基悬浮即得细胞悬液。 5. 将消化过的组织块重复消化5~6 次至组织块消化完全，重复以上操作。 6. 合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为 2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24 孔塑料培养板中，每孔1 mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。 7. 由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15 h 后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。 8. 将新培养板中细胞培养 48 小时后，换新鲜配置的含
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细胞技术专题：肿瘤细胞的软琼脂集落培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团，称之为集落。肿瘤细胞能无限繁殖，所以具有这种能力，而成熟分化的细胞则不能形成集落。 实验方法 基本方案 实验方法原理 HL-60细胞是一种急性早幼粒细胞白血病细胞，在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落。二甲基亚砜是一种细胞分化诱导剂，经二甲基亚砜处理后的HL-60细胞按粒系途径定向成熟分化，同时细胞的增殖力降低，几乎全部细胞丧失了软琼脂中形成集落的能力。因此，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤**的疗效检验等方面。 实验材料 HL-60细胞 试剂、试剂盒 小牛血清 RPMI1640培养液 台盼兰 琼脂 二甲基亚砜 仪器、耗材 超净工作台 二氧化碳培养箱 显微镜 培养瓶 吸管 酒精灯 血细胞计数板 多孔培养板 实验步骤 1. 收集对数生长期的HL-60细胞，先按实验十三测定细胞活力，然后调整细胞浓度，制成300~1 000活细胞/ml 的细胞悬液。 2. 取二个培养瓶每个瓶中加9 ml 调整好浓度的细胞悬液，然后各加入1 ml 3%琼脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混匀。 3. 用微量加样器吸140 μl 二甲基亚砜（MDSO），加到一个瓶中，充分混匀，为实验组，另一瓶不加DMSO，为空白对照组。 4. 取一个16 mm 多孔培养板，每孔加1 ml（35 mm 培养皿需加2 ml）细胞琼脂悬液，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。 5. 在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。 6. 然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。 7. 培养7~10天，肉眼观察并计数细胞集落。 8. 结果：以肉眼可见的细胞团（含500个以上细胞）作为计数集落的标准。对照组HL-60细胞在含0.3%的软琼脂培养基中生长良好，每个孔中可见有多个集落形成，而实验组HL-60细胞因经二甲基亚砜诱导分化，细胞在软琼脂中的集落形成明显减少。 9. 集落的计数和计算： （1）集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔 （2）集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100%
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细胞技术专题：staurosporine诱导小鼠心肌细胞凋亡模型构建
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
原代心肌细胞的培养及实验方案 取出生后0~24 h C57BL/6cr小鼠心脏，按改良的Lader方法进行细胞的分离。 获取博动的心脏迅速放置于无Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡液中。剪碎心脏，放置在4℃条件下100 g/L的Trypsin溶液中消化16~18 h，用Trypsin抑制剂中止消化。然后在37℃下，用胶原酶Ⅱ于CO2培养箱内，在摇床上继续孵化消化45~60 min，最后用70 μm直径尼龙过滤网过滤获取心肌细胞，用含有25 mmol/L HCO3-，100 mL/L FSB，1×105 u/L青霉素G和50 g/L链霉素的M199培养基制成细胞悬液，按差速贴壁分离法纯化心肌细胞。加入10 μmol/L BrdU到细胞悬液，以6×105密度种植于96或24孔细胞培养板上，置37℃培养箱培养. 培养的心肌细胞24 h后更换含有10 μmol/L BrdU新鲜M199培养基，培养72 h后进行实验使用. 设立阴性、阳性对照及实验组，每组20孔；阳性对照加入4 μmol/L STS，实验组中加入4 μmol/L STS后再分别加入250 μmol/L DIDS或100 μmol/L NPPB，100 μmol/L Quinine和1 mmol/L BaCl2孵化4 h，更换新鲜M199培养基继续孵化4 h后进行各种指标的检测。 细胞存活试验 按照实验方案处理后的培养心肌细胞，每100 μL培养基的小孔中加入10 μL的MTT再孵化2 h，用分光比色仪进行检测，实验结果以细胞存活率表示，细胞存活率=A试验组/A对照组×100%. MTT法A值既能反映心肌细胞内线粒体脱氢酶活性，又能间接反映心肌细胞的增殖与存活情况. 凋亡琼脂糖凝胶电泳检测 收集24孔板处理过的细胞，弃上清加入50 μL含有200 mg/L的RNase细胞裂解液(10 μmol/L Tris.HCl，0.1 mol/L EDTA，5 g/L SDS)，37℃孵化1 h再加入500 mg/L蛋白酶K继续孵化。1 h后加入等体积的酚、氯仿、异丙醇（25∶24∶1）充分摇匀，离心取上清再加入等体积的氯仿抽提1次，转移的上清液中再加1/10体积3 mol/L醋酸钠及两倍体积的无水乙醇过夜后离心，700 mL/L的乙醇洗涤后，TE液溶解DNA，于20 g/L含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪下观察、记录拍照. Caspase3活性的检测 使用Ap
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细胞技术专题：大鼠脑微血管内皮细胞原代培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
参考文献 [1] Grant GA et al. News Physiol Sci, 1998, 13：287 [2] Panula P et al. Experientia, 1978, 34：95 [3] 王建民等。解剖学杂志，1998，21：495 [4] 许彦钢等。微循环技术杂志，1997，2：63 [5] 钱志远等。细胞生物学杂志，1999，21：42 [6] Kis B et al. Neuroreport, 2001, 12：4139 [7] Szabo CA et al. Neurobiology (Bp), 1997, 5：1 [8] Abbott NJ et al. J Cell Sci, 1992, 103：23 [9] Gordon EL et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1991, 27A：312 [10] Diglio CA et al. Lab Invest, 1982, 46：554 [11] Rupnick MA et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1988, 24：435 [12] Ichikawa N et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 1996, 36：45 [13] Scott PA et al. J Cell Sci, 1993, 105：269 [14] Domotor E et al. Neurochem Int, 1998, 33：473
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细胞技术专题：兔膀胱平滑肌细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
二、参考文献 1. Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers. J Pediatr Surg, 2003,38(1):21-24. 2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI. Ca2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder.Exp Physiol,1996,81(4):553-564. 3. ChamLey CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture. Physiol Rev,1979,599(1):1-61. 4. Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int,2003,92(4):476-478. 5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. J Urol, 2001,165(2):627-632.
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