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细胞培养中为什么要冻存细胞？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
随着实验室细胞培养的发展，除了原代培养之外，还将建立开发或获得众多的细胞系。每一个细胞系均扩大了其起源细胞的应用，成为有价值的资源。若该细胞系颇为独特，则其可能是不可替换的；替换至少也是昂贵与耗时的。因此，必须通过保存细胞系来保证这种重要投资。 由于培养早期传代培养的选择，有限细胞系的衰老以及连续细胞系的遗传和表现不稳定性，使细胞系在连续培养时有变异倾向。此外，即使在管理好的实验室中也有可能发生仪器故障和污染。交叉污染以及错误辨识的发生率也很高。因此，存在诸多理由进行冷冻储存细胞，总体概述有10个不得不冻存细胞的理由： （1）由于遗传不稳定性而导致基因漂移； （2）衰老，最后导致细胞系消失； （3）生长特性的转化以及恶性相关特性的获得； （4）由于选择和去分化导致表型的不稳定性； （5）微生物污染； （6）其他细胞系的交叉污染； （7）由于操作粗心而导致的错误鉴别； （8）孵育箱故障； （9）对于保存那些不立即使用的细胞系，可节省时间和材料； （10）需要将细胞系转给其他使用者。 在考虑冻存细胞之前，需满足以下特定条件： 1.确认冻存前需证实细胞系未受污染，且确为该细胞系。尽管对于新获得的细胞系，可以在完全确认前冻存几支，但在大量冻存前应进行彻底确认。 2.冻存时间，如果是有限细胞系，这些细胞应经5代倍增生长，获得足够量的细胞再进行冻存。连续细胞系应将其克隆化，选择特征性的克隆，待生长至足够数量再进行冻存。连续细胞系有其优势：它们可无限生长，生长比较迅速，容易克隆，但是它们缺乏遗传稳定性。有限细胞系通常或接近二倍体。在一定传代水平间是稳定的，但是，它们很难克隆，生长缓慢，最终死亡或发生转化。
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培养肿瘤细胞存在哪些问题？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
肿瘤细胞培养存在着与正常组织中的特殊细胞培养类似的问题，尤其是人原发性肿瘤细胞。肿瘤细胞必须与正常的结缔组织细胞分开，**通过使用支持肿瘤细胞生长而不支持正常细胞生长的选择培养基进行分离。尽管正常细胞选择性培养基的研制有了很大进展，但肿瘤细胞培养的进展却受到肿瘤组织样本间和样本内，甚至相同肿瘤类型的各种变异的限制。常惊奇地发现，肿瘤在体内生长，但在体外难以生长，这主要是因为肿瘤在体内生长具有显著地自主性，而不受正常的调控。有些肿瘤细胞难以存活可能有许多原因。这些肿瘤细胞的营养需求不同于同等组织的正常细胞，或许除去间质实际上可能使肿瘤细胞失去了存货必须的基质、营养物质或信号。另一方面，对肿瘤细胞的稀释可为每个细胞提供足够的营养，但也可能由此稀释了细胞产生的自分泌生长因子。严格来讲，如果自分泌因子释放至细胞表面并作用于同一细胞，真正的自分泌因子不会受稀释的影响。但是，某些所谓的自分泌生长因子实际上可能是同分泌因子，即这些因子作用于邻近的同类细胞，而不是作用于释放因子的细胞本身。因此，需要相互作用的细胞群。如果间质能够自发地或对肿瘤细胞反应后产生需要的生长因子，与某些类型的间质细胞相互作用可提供旁分泌作用。认为肿瘤细胞对生长因子的依赖性类似于肿瘤周围组织的正常细胞可能是不正确的。肿瘤细胞能够产生内源性自分泌生长因子如TGF-a，给予外源性生长因子如 EGF可竞争结合相同受体。另外，肿瘤细胞对―种生长因子或激素的反应将取决于其他生长因子的存在和细胞状态，有些其他生长因子可能是肿瘤细胞释放的。能够表达生长抑制和衰老基因的正常细胞，与含有一个或多个不活化或发生突变基因细胞的反应可能不同于与高表达促进生长癌基因细胞的反应。因此，有许多可能的原因使肿瘤细胞对于营养和代谢环境的反应不同于同一谱系的正常细胞。为了证实这种差异，在肿瘤细胞的营养需要方面需要掌握更多的信息。但是，对于肿瘤异质性方面的研究令人为
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间质干细胞的表面抗原和培养原理
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
间质干细胞的表面抗原 通过流式细胞仪分析，间充质干细胞特异性表面抗原有：SH2、SH3、 CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。 BMSC：是骨髓中除HSC 以外的非造血性干细胞，骨髓中绝大多数是HSC，BMSC 只占骨髓有核细胞的0.001%～0.01% 。因此鉴定BMSC 的方法是在骨髓的干细胞中排除HSC——BMSC：CD45-、CD34-、CD29+、 CD14+/ HSC：CD34+。 间质干细胞的培养原理概述 间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在适宜的培养条件下可分化成多种组织细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。 间质干细胞最早是从骨髓中分离得到的，正常情况下，它在骨髓中的比例非常低，仅占单核细胞的1/105 ~1/104 。骨髓中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090 g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/ml，血小板为1.030~1.035 g/ml。为此利用一种密度介于1.075~1.092 g/ml之间而近于等渗的溶液（分层液）进行密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 在骨髓的原代培养物中，除了贴壁生长的成纤维细胞样的间质干细胞外，还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的间质干细胞，必须除去其他细胞。根据其他细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去。对于贴壁的单核巨噬细胞，可根据其黏附能力的不同，通过调整Trypsin/EDTA 的消化时间，保证间质干细胞在短暂的作用时间内与塑料培养瓶壁分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养瓶壁，从而使间质干细胞与其他的贴壁细胞得到分离。 在传代培养中，接种密度是影响体外培养间质干细胞增殖潜能的重要因素。低密度接种时，间质干细胞的增殖
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细胞冻存的注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
一、怎样冻存动物细胞? 细胞冷冻过程有四个要点：细胞的收获、保护剂的使用、冷冻速率和储存环境。 (1) 细胞的收获 用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满 90% 的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液。收获用来冻存的细胞开始时方法和平时一样，用 100xg 离心 5 分钟收集细胞再重悬，活细胞记数。稀释或浓缩到细胞保存的最终细胞浓度的二倍(一般是 400-1000 万 细胞 /ml )，加入已经配好的等体积的培养液保护剂混合溶液中轻轻混匀，分装到冻存管，冷冻保存。 (2) 保护剂的使用 细胞冻存中， 一般使用DMSO 作为保护剂。在细胞冻存中， DMSO 使用的最终浓度一般是 5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。对特别敏感的细胞特别是杂交瘤细胞在冻存时使用 95% 血清和 5%DMSO 可能会好些。保护剂在使用时先用培养液或血清配成最终浓度的2倍，再与等体积的悬浮细胞的培养液混合。 (3) 细胞冻存的速率 细胞的冷冻速率最适控制在让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导致细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的。通常的操作是把细胞先在-20℃1-2个小时，再放入 -80℃冰箱过夜(如果没有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再转入液氮罐或低于 -130℃的冰箱长期保存。 (4) 储存环境 细胞长期保存温度是 -130 ℃或更低。液氮罐中气态层温度在 -140℃至 -180℃之间，细胞可保存在气态层或浸入液氮中，如果可能**保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸(但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加)。细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。 二、怎样化冻动物细胞? 化冻过程的原则是要让冻存的细胞快速融化。 如果细胞储存在液氮液面下，使用者**准备好必要的防护器具(至少要戴上护目镜，**戴上面罩和较厚的手套)，防止进入冻存管的液氮骤然膨胀引起爆炸而造成伤害。从冰箱或液氮罐取出细胞后将冻存管放37℃水浴
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原代细胞的取材和分离方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 原代细胞培养的步骤一般是：取材→分离→培养和维持，今天我们重点介绍原代细胞的取材和分离方法。 一、取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 取材的基本要求： ① 取材要注意新鲜和保鲜 ② 应严格无菌 ③ 防止机械损伤 ④ 去除无用组织和避免干燥 ⑤ 应注意组织类型、分化程度、年龄等 ⑥ 作好记录 各类组织的取材技术： ① 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。 ② 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 ③ 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中(如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等)分离细胞，取材时应注意抗凝。 ④ 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 ⑤ 动物组织取材 I 鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后(注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力)，取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解
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细胞解冻过程中，存活率低怎么办？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
出现低存活率的可能原因及推荐解决方案如下： 1.解冻过程中细胞裂解 推荐的解决方案：可预期到一定量的细胞死亡，因此细胞的浓度应足够高，考虑到这一损失。起始浓度为106至107细胞/毫升。 2.解冻过程中的问题 推荐的解决方案：在-70℃至-80℃下保存冷冻的培养物，保存时间为1-5天，但这不是保存的优先方法。在37℃充分解冻后应立即开始培养。 3.对冷冻液过敏 推荐的解决方案： A.完全或部分更换培养基，减少培养基中冷冻液的量。在24小时后更换培养液体可全部去除冷冻液。 B.留出更多时间供培养物恢复。有时细胞需要几周时间才能形成单层或密集的悬浮物，取决于冷冻时细胞的年龄或传代次数或在生长阶段中的位置。冷冻的最佳条件在对数期。 4.被冷冻的原种细胞的年龄或冷冻时培养物的年龄 推荐的解决方案：解冻最近冷冻的细胞。细胞处于冷冻状态的时间越长，存活率越低。检查冷冻细胞的时间和方法。在冷冻时细胞应处于对数期。 出现大量细胞碎片的可能原因及推荐解决方案如下： 1.冷冻时细胞密度过低 推荐的解决方案：缩短解冻过程中的时间。将细胞取出后，立即将冻存管浸入在37℃的水浴中，并震荡至全部融化，然后迅速地转移到预热的培养基中。 2.不适当的冷冻过程 推荐的解决方案：解冻不同冷冻室总的试管。确保在冻存过程中采用的适当的技术，并确保使用了适量和适合的冷冻液。 出现生长缓慢的可能原因及推荐解决方案如下： 1.培养瓶的大小 推荐的解决方案：一些细胞在培养基中倾向于维持一定的密度。将培养物转移到较小的培养瓶中，使细胞密度上升；如，根据培养基的体积，从75cm2的烧瓶转移到2或3个25cm2的烧瓶中。 2.细胞密度过低 推荐的解决方案：提高未来冷冻物种细胞的冻存密度，或使用较小的培养容器，或解冻多个试管来进行培养。
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如何进行细胞冻存与复苏？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
为什么要进行细胞冻存？ 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。 除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。 细胞冻存的步骤 （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天**换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为5×106～1×107/mL之间。 （3）将分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管0.25ml。冻存管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。；如果有程序降温器(放在-80℃冰箱过夜，放入液氮罐)**;或者可以在4℃，2h;然后转到-20℃，2h;-80℃，2h;放入液氮罐。 （5）细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，**取出一只冻存管细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。 如何进行细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸
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使用血清的小技巧
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
1.血清必须贮存于20～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。!`%V5 3.瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4.热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体受到破坏。 5.勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。 6.血清之沈淀物 6.1.凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。生物 6.2.显微镜下观察之小黑点：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是小黑点，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此微生物，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应
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关于支原体培养的相关知识
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
关于支原体培养的相关知识 支原体定义： 支原体（mycoplasma）是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病，对人致病的支原体主要有肺炎支原体、溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体等。 支原体结构： 支原体的大小为0.1～0.3um，可通过滤菌器，常给细胞培养工作带来污染的麻烦。菌落小（直径0.1-1.0mm），在固体培养基表面呈特有的"油煎蛋"状。无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性，对渗透压敏感，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。细胞膜含甾醇，比其他原核生物的膜更坚韧。凡能作用于胆固醇的物质均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。 支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。 肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminal structure），能使支原体粘附于呼吸道粘膜上皮细胞表面，与致病性有关。 支原体分类： 一般能分解葡萄糖的支原体则不能利用精氨酸，能利用精氨酸的则不能分解葡萄糖，据此可将支原体分为两类。解脲支原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。 各种支原体都有特异的表面抗原结构，很少有交叉反应，具有型特异性。应用生长抑制试验（Growth inhibition test,GIT）、代谢抑制试验（Metabolic inhibition test,MIT）等可鉴定支原抗原，进行分型。 它广泛分布于自然界，有80余种。与人类有关的支原体有肺炎支原体（M-pneumonie，Mp）、人型支原体（UU 分解尿素支原体）和生殖器支原体（M.genitalium，MG）等。 肺炎支原体引起肺炎。现已从人类泌尿生殖道分离出来7种支原体，其中分离率较高而与泌尿生殖道疾病
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胎牛血清市场现状及选购指南
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
目前中国国内市场上的胎牛血清种类繁多，鱼龙混杂，很多科研工作者，特别是刚接触细胞培养的人，难以分辨血清质量的优劣。小编汇总了多家用户和血清经销商以及网络的经验，分析如下： 养过细胞的童鞋大都有着这样的共识：血清，由于其复杂的内在成分和难以控制的外界因素，它既是细胞生长的营养，也是细胞死亡的致命，当我们废寝忘食的，呕心沥血的，鞠躬尽瘁的养着细胞同时，也极有可能因为一时的疏忽和大意选错了血清，导致珍贵的细胞意外身外，一切归零，不得不洗心革面重头开始！ 一、首先跟大家介绍几种常规的血清品牌： 1.Gibco品牌大，市场占有率高。但正品价格太贵，用户直呼用不起，同时市场上Gibco品牌产品参差不齐，价位从2000-8000的都有，若没有孙悟空的火眼金睛，实难保证产品质量啊。 2.Corning2011年收购mediatech北美的生产培养基和血清的工厂，在2015-2018年间，又收购了2家美国血清工厂，新西兰血源，与Gibco、Sigma不相上下的生产工艺，虽然进入中国市场稍晚，得益于corning敏锐的市场嗅觉，及对中国市场的重视和不遗余力的推广，供应链日趋成熟，现货充足，质量稳定，市场上有口皆碑，品牌值得信赖！ 3.sigmaSAFC血清国内拥有大批的粉丝在追寻，特别是一些大的药厂和疫苗企业，质量比较稳定，无奈品牌血清受监管严重，导致供应量是严重不足，终端科研用户能使用到正品sigma血清的 4.Hyclone进入中国市场最早的血清品牌，但随着品牌并购整合、正品断货、假货横行导致客户对hyclone已失去耐心，市场上已难觅踪影。 5.Ausgenex血清澳洲本土血清品牌，处于第一批海关放行的血清清单，曾经抓住很多品牌血清断货的契机，市场增长很快，价格相对便宜，也受到部分实验室的欢迎。 6.Bioind血清简称BI血清，曾经凭借低价策略在中国市场占有率还是比较高的，近两年有部分客户反应批间差较大，质量不够稳定，选择时务必要谨慎小心。 7.Bovogen也是澳洲本土血清品牌，位于澳
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细胞的冻存与复苏
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
一、 程序冻存步骤（需梯度降温） 1、 配置冻存液，冻存液推荐配比：55%（基础培养基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；推荐使用Procell通用血清型程序冻存液，货号PB180436； 2、 制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量； 3、 细胞离心后尽量吸干净上清，离心转速1200rpm（250g）3min； 4、 加入配置好的冻存液重悬，调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL； 5、 分装入冻存管，一个冻存管分装1~1.5毫升； 6、 推荐使用程序降温盒，分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱过夜； 7、 如没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化； 8、 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。 注意事项： 1、 DMSO配制的时候会放热，一定要等冻存液冷却后使用，避免灼伤细胞； 2、 细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液； 3、 不建议手动梯度降温，温度不稳定，容易降低存活率； 4、 注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最-低刻度线；冻存5次后异丙醇需要更换一次，以免影响冻存效果；程序降温盒需恢复到室温以后才能继续使用，不能从冰箱拿出来直接使用； 5、 细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞损伤大，分装完成后立即转入程序降温盒放到-80度冰箱，不需要放4度； 6、 -80度冻存过夜后可以转入液氮长期保存，转入液氮的过程需要对冻存盒进行保冷，不要长时间在常温暴露，避免冻存管融化； 7、 若没有液氮罐，存放在-80度的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定。 8、 细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存； 二、 非程序冻存步骤（需使用无血清冻存液） 1、 冻存液丛冰箱提前拿出回温到室温，推
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冷冻细胞活化步骤
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
1.冷冻细胞的活化原则为快速解冻，避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，导致细胞死亡。 2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产 生单株抗体或是其它蛋白质)。2y2Q O6\#o&h4@+z,~ 3.材料37℃ 恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/离心管/培养瓶，液氮或干冰容 4.步骤： 4.1操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 4.2自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易 松掉。 4.3将新鲜培养基置于37°C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 4.4取出冷冻管，立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化以70%ethanol擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 4.5取出0.9ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10～1:15)混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。 4.6解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。 4.7若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
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血清的处理方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
血清或（血浆）标本的处理方法检验科收到临床标本后，应尽快低速离心分离血清或血浆进行测定。45℃水浴10分钟，再3000r/min离心5分钟，即可使LDH、K等显著升高。对血液标本外观观察是判断标本质量的最直观的方法，外观异常有溶血、黄疸、脂血等情形，是引起测定误差常见的因素。 （1）标本的离心离心分离血清应选择相对离心力（RCF）为1000g~1200g，离心时间为5~10分钟。增加相对离心力或增加离心时间，都易引起溶血。 （2）溶血标本的处理溶血可导致RBC内多种成分的释出，引起对测定方法的干扰，Hb≥0.2g/L，肉眼可见溶血。 ①间接干扰：Hb的释出，可引起间接的干扰，因Hb在波长为431nm和555nm处有光吸收，若被测物选用与之相近波长作比色分析时，可导致假性增高。处理方法：轻度溶血，同时作血清空白；严重溶血，重留样本。 ②直接干扰：RBC内含量高的血液化学成分溶血后，这些化学成分在血清中浓度就会增高，避免用溶血标本测定在RBC内含物高的化学成分。如钾、ALP、AST、Bil、CK、LD、ACP等。 （3）乳糜标本的处理高脂血症的病人往往可导致乳糜血，医学教|育网|收集整理为了不影响检测，应对乳糜血进行澄清。具体方法如下：血清和（或）血浆与氟利昂以1：1在玻璃试管中混合。氟利昂在血浆和（或）血清下，180℃颠倒试医学教育网管3min，使充分混合。然后3000g离心6min.上清液为澄清的血清，中层含沉淀的脂蛋白，下层为多余的氟利昂，澄清过程可重复多次而不影响酶的活性和底物。 （4）胆红素（黄疸）标本的处理胆红素的颜色对反应结果为黄色和红色化合物的比色分析有正向干扰，可用样品空白或动力学和双试剂消除。另外，胆红素不稳定，在碱性环境或强光线照射下，转变为胆绿素、胆褐素而褪色，如用碱性ku味酸法测定肌酐，黄疸标本常常会出现负数。另外胆红素还有还原性，对Trinder反应有负干扰，如氧化酶法测定葡萄糖、胆固醇、甘油三脂、尿酸等，可通过进行干扰试验消除
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如何选择合适的缓冲液
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
缓冲液在实验中的作用十分强大，由上于缓冲液的类别非常多，所以我们常会看到某某缓冲液的配制方法有哪些或者是一些使用方法等，但其他在选择上，也是十分重要，其作用主要是缓冲作用，而这种作用的前提是基于溶液，固有的时候也会被称为：缓冲溶液! 缓冲液的品种非常多，比如常见的有HEPES缓冲液，磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，甘氨酸缓冲液，虽然我们都知道这些缓冲液有很多的优点，但同时也有着不可避免的缺点；本文将为您一一进行揭晓，我们只有把这些问题弄清楚了，才可以更加清楚的去选择适合的缓冲液。 如何选择缓冲液， 缓冲液有什么优点及缺点 一般来说，在选择缓冲液时，我们需要遵循以下几个要求，特别是需要确定该缓冲液所需的PH值，具体如何选择请参考下面说明： 选择缓冲体系，其解离常数pKa值应该在设定的pH上下一个pH值单位内，因为缓冲液的pKa变化超过一个pH单位时，其缓冲能力就会明显下降； 缓冲体系不应影响蛋白质的活性或者DNA的稳定性，并避免其他离子的干扰； 最后，还要考虑温度的影响：温度不仅对缓冲液有影响，对细胞也有影响，大多数动物细胞在37℃的生理状况下pH为7.0~7.5，而在温度下降到0℃时可达到8.0。 那么缓冲液有什么优点及缺点有哪些呢?由于缓冲液的品种特别多，所以我们拿出几个系列的产品作详细讲述！ 磷酸盐缓冲液的优点及缺点： 磷酸盐缓冲液是使用广泛的一种缓冲剂，由于它有二级解离，所以缓冲的pH值范围很广，可配置各种pH值的酸性、碱性和中性缓冲液。 A、优点 易配成各种浓度 适用pH范围宽 pH受温度影响小 稀释后pH变化小 B、缺点 易与常见的钙离子、镁离子及重金属离子缔合成沉淀 Tris缓冲液的优点及缺点 Tris缓冲液是在生物化学研究中使用较广泛的一种缓冲剂，其本身为弱碱，常用有效pH在“中性”范围。 A、优点 碱性较强，可以只用这一种缓冲液配置由酸到碱的但范围pH缓冲液; 对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 B、缺点
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细胞传代时间经验技巧
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
养细胞的小伙伴们都知道，细胞一定要传代，因为细胞在培养过程中不断的繁殖，数量也随之增加，然而培养皿/培养瓶的空间有限，增殖受到抑制，所以必须将一部分细胞移至别的培养皿/培养瓶，让细胞有足够生长空间。 细胞传代也不仅仅是为细胞安一个更大的“家”，更重要的，是使细胞系或细胞株进一步增殖，这样，我们才能有足够的细胞做各种各样的实验。 但是，对于传代的时间，很多小伙伴都掌握不好，因为对于不同的细胞来说，判断能否开始传代的标准略有不同，今天，我们就主要来聊一下，细胞传代的时间问题。 什么时候进行细胞传代? 对于贴壁培养和悬浮培养而言，判断是否需要传代主要看以下2个方面： • 细胞密度： 贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代，正常细胞达到汇合状态时会停止生长 (接触抑制)，重新接种后需要较长时间才能恢复，转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。类似地， 悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。 • 培养基耗竭： 生长培养基 pH 值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性，而且 pH 值降低也是细胞生长的不利因素。pH 值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。 如果发现 pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 单位)，同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 细胞传代时间安排 注意，一定要严格按照预定时间进行细胞传代，这样才能确保细胞的生物学行为稳定，便于监测其健康状态。 要从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度，直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量，细胞偏离如此确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳 (例如：变质、污染) 或者培养体系的某一组分功能异常 (例如：未
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