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科研党实用软件,快收藏
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
说起科研人员，身穿白大褂，手持精密的仪器，对着数据运筹帷幄的智者形象，但其中的变数与奥妙，可谓是一言难尽啊。整天面对一堆数据，枯燥而乏味，一个不小心，实验惨败，重头再来吧！ 在科研过程中，一些工具的使用会让工作事半功倍。对科研工具的熟练掌握、高效运用，不仅有助于研究生阶段的学术研究，对未来的职业生涯也会起到一定的帮助。今天，小编就向大家推荐一些实用的科研工具，一定要收藏备用哦！ 1.中国知网 知网，是国家知识基础设施的概念，由世界银行于1998年提出。CNKI工程是以实现全社会知识资源传播共享与增值利用为目标的信息化建设项目。由清华大学、清华同方发起，始建于1999年6月。通过与期刊界、出版界及各内容提供商达成合作，中国知网已经发展成为集期刊杂志、博士论文、硕士论文、会议论文、报纸、工具书、标准、国学、海外文献资源为一体的网络出版平台。中心网站的日更新文献量达5万篇以上。 2.国家哲学社会科学文献中心 2016年9月，中宣部部署，由中国社会科学院牵头，教育部出版广电总局配合建设“国家哲学社会科学文献中心”。这是一项由国家投入的公益工程，由国家免费向公众提供学术资源。国家哲学社会科学文献中心主要开设有资讯、资源、专题、服务四个栏目，资源包括中文、上线体验外文学术期刊7000多种，还有外文图书、古籍等四类，上线文献数据超过1000万条，与国内60多家社会科学研究机构网站导航链接，初步形成国家哲学社会科学学术期刊数据库，外文学术期刊数据库，中国社会科学院科研成果数据库等特色资源数据库。 3.德尔塔生物 德尔塔生物从事酶联免疫学11年有余，技术成熟，产品稳定，发表高质量文献5000余篇，影响因子最高可达17.60。为您提供全面的、创新的、优质的、便捷的科研产品和服务。目前，其自主研发的重组蛋白、抗体、ELISA检测试剂盒得到广大科研用户的认可。 4.Mendeley 面对数量众多的文献，也许你还不知道如何管理，也许你还在为下
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外泌体研究常见问题汇总
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
外泌体（Exosome）发现于1986 年，是一种直径约30~100nm 的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、 网织红细胞、 血小板、 神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生， 广泛分布于外周血、尿液、唾液、 乳汁、腹水、羊水等体液中。 外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能， 使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为**手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床**。 01 外泌体研究，应选用血浆还是血清？ 答： 血清是血液凝固之后收集的液体，所以其中少了纤维蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体，有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。 血浆=血液-血细胞 血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子 所以一般实验选择血浆，在特殊情况下，如研究与血小板相关的疾病的时候，当然是血清更适合。 02 外泌体的分离方法这么多，选择哪种更好？ 答： 外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、 超滤、 沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离： 1、 超速离心法（差速离心） 超离法是常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（ 如图所示） ，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。 2、密度梯度离心 在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布
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细胞因子的原理与应用
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
原理 为了维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，防止肿瘤发生，机体的许多细胞，特别是免疫细胞合成和分泌许多种微量的多肽类因子。它们在细胞之间传递信息，调节细胞的生理过程，提高机体的免疫力，在异常情况下也有可能引起发烧、炎症、休克等病理过程。这样一大类因子已发现的有上百种，统称为细胞因子，包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核细胞产生的单核因子、各种生长因子等。许多细胞因子是根据它们的功能命名的，如白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、红细胞生成素(EPO)等。 作用 细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。细胞因子与其受体集合后启动复杂的细胞内分子间的相互作用，最终引起细胞基因转录的变化。 参与免疫应答与免疫调节，调节固有免疫和适应性免疫应答;刺激造血功能;刺激细胞活化、增殖和分化;诱导或抑制细胞毒作用，诱导其凋亡。细胞因子的作用方式:1.自分泌作用。2.旁分泌作用。3.内分泌作用。 细胞因子的作用特点:多效性、重叠性、协同性、拮抗性和双重性。 细胞因子研究具有非常重要的理论和实用意义，它有助于阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和**，特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于**肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好疗效，具有非常广阔的应用前景。 细胞因子正逐渐作为佐剂用于疫苗的研制，如白介素-2、IL-12等。 上海德尔塔生物科技有限公司专业供应高品质人ELISA试剂盒、大鼠ELISA试剂盒、小鼠ELISA试剂盒、豚鼠ELISA试剂盒、兔ELISA试剂盒、牛ELISA试剂盒等各种ELISA试剂盒及生物试剂、培养基、标准品、对照品、血清等试验耗材！上海恒远公司是一家专业从事“产品研发生产、市场销售、技术服务”为一体的高科技生物技术公司，在科学研究和医疗检测领域享有极高的声誉。
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细胞培养的血清 血清解冻灭活等问题
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
细胞培养基的配制 细胞培养 液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。 血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆 细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。注意以下几点： (1)需要长期保存的血清必须储存于-20℃或-80℃低温冰箱 中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月。由于血清结冰时体积会增加约10%，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。 (2)Cyagen提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。否则会导致营养物质的流失! (3)瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20 ℃或 -80 ℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20 ℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。影响使用效果! (4)热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分(complement )灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。Cyagen提供的血清是经过严格处
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关于碳量子点CQDs你知道多少？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
关于碳量子点CQDs你知道多少？ 产品名称：碳量子点CQDs 别称：水溶性碳量子点，绿光碳量子点CQDs 英文名称：carbon quantum dot 粒度：5 nm 发光颜色：绿光（Ex: 400 nm; Em: 490 nm） 量子产率：7%（相对量子产率，参照物：罗丹明B） 溶剂：水 合成方法：葡萄糖和氢氧化钠溶解在水中超声合成 备注：碳量子点粉末在乙醇中的分散性良好，水中稍差，可能会出现浑浊或沉淀。 碳量子点是一种碳基零维材料。碳量子点具有优秀的光学性质，良好的水溶性、环境友好、原料来源广、成本低、生物相容性好等诸多优点。自从碳量子点被发现以来，人们开发出了许多合成方法，包括电弧放电法、激光销蚀法、电化学合成法、化学氧化法、燃烧法、水热合成法、微波合成法、模板法等。碳量子点的应用，在医学成像技术、环境监测、化学分析、催化剂制备、能源开发等许多的领域都有较好的应用前景。 碳量子点是近年来发展起来的低维碳材料的一个分支。和无机半导体量子点相比,由于其具有原料成本低、制备方法简单、环境友好等特性,近年来受到人们的关注。碳量子点独特的结构赋予其独特的物理及化学特性,如上转换发光和激发波长依赖性等。油溶性碳量子点因为在有机溶剂中良好的溶解性,使得其在光电器件领域具有潜在的应用价值。但近年来研究较多的当属水溶性碳量子点,而对于油溶性碳量子点的研究相对较少[1]。本文以单尾链有机小分子为原料,通过简单的加热回流,制备出发蓝色荧光的油溶性碳量子点。通过HR-TEM、荧光光谱、红外、XPS等方法证明了油溶性碳量子点的成功合成,之后,将其应用到荧光墨水中 碳量子点结构： 碳量子点（Carbon Quantum Dots, CQD）是由分散的类球状碳颗粒组成，尺寸极小（在10nm 以下），具有荧光性质的新型纳米碳材料。 碳量子点合适的尺寸、低廉的成本和良好的生物兼容性对于生物标记等领域的研究是至关重要的，因此它的出现引起了研究者的关注。 碳基纳米点简称碳点，如图1所示，可分为石墨烯量子点、
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Synaptic Systems 高质量抗体验证方案
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
随着现在生物技术的发展，抗体已经成为了强大的诊断和研究工具，其应用范围也日益扩大。抗体可以用于包括WB(蛋白质印迹)、ICC(免疫细胞化学)、IHC(免疫组织化学)、IP(免疫沉淀)、ELISA(酶联免疫吸附)等多种实验中来检测、分离或可视化相应的抗原。大多数情况下，抗原是一种蛋白质，但也可以是化学修饰或任意小分子的化合物。 长期以来，抗体一直备受生物科研工作者的青睐，无数科研人员每天都需要使用抗体来识别和分离各种应用的蛋白质。然而，近年来，抗体的使用出现“再现性危机”和“抗体危机”的问题，其主要因素在于抗体的交叉反应性和变异性。 一般而言，抗体的质量主要取决于两个方面特性：亲和力和特异性。 亲和力主要表现在测量表位和抗体的抗原结合位点之间相互作用的强度。抗体的亲和力越高，基于抗体测定的灵敏度就越高；特异性则是衡量抗体区分不同抗原的程度。这意味着即使是 抗体也有检测限，或者在J端情况下可能会显示假阳性结果。例如，如果一个高特异性和高灵敏度的抗体的目标抗原在要分析的样品中含量很低，那么通常会增加样品量，并以更高的浓度使用该抗体来放大信号。如果样品中存在另一个被该抗体结合得很弱的目标，那么这个非目标和抗体本身的不利的高浓度就会导致非特异性结合和假阳性结果。 不同的实验方法需要不同的抗体特性，因为抗原以不同的方式呈现。在变性SDS-PAGE 后，抗原可能是蛋白质印迹检测中呈线性的氨基酸序列，或者在细胞免疫分离、免疫沉淀或基于 ELISA 的方法中整体是天然结构。在免疫染色中，必须检测固定细胞或组织中的交联、化学修饰结构。这意味着一种抗体可能在一种应用中表现出优异的性能，但在另一种应用中却完全不适用。这也意味着一种检测的特异性并不能保证在不同应用中的特异性。必须对所有应用程序独立进行验证。 抗体验证八种方法 1. 省略一抗 这是测试由二级试剂引起的潜在背景的有用且重要的控制。然而，这个实验没有提供关于一抗质量的信
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血小板裂解物的制备方法有哪几种？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
血小板中含有很多不同的细胞生长因子，包括PDGF, VEGF，EGF等，存在血小板颗粒中的大量生长因子和细胞因子可以通过凝血酶激活和凝固自然释放，也可以通过冷冻/解冻介导的血小板溶解、超声或化学**人工释放。以不同的释放策略制备的人血小板裂解物被视为可以替代胎牛血清（FBS）作为培养基补充剂的合适选择，使人类细胞在无动物血清条件下高效增殖，在体细胞**和组织工程中具有广泛的应用前景。 血小板裂解物的制备方法有哪几种？ 诱导血小板释放生长因子和其他生物活性分子的四大方法： （1）多次冷冻/解冻循环（反复冻融法）： 多次冷冻/解冻循环是常见的简单有效和经济的方式诱导血小板激活释放因子。典型的情况是，浓缩的血小板在-80℃时被休克冷冻，37℃时解冻，从而使血小板激活和碎裂。 （2）直接激活法: 这种方法是加入钙盐溶液(通常是CaCl2)，以激活内源性凝血酶，从而纤维蛋白形成和血小板脱颗粒。也有人或重组凝血酶的直接激活，但重组凝血酶的使用可能会使HPL用于细胞**的监管和批准复杂化。 （3）声波降解法: 多年来，超声单独或与冷冻/解冻循环相结合也被用作一种快速、高效和经济高效的释放血小板的方法。在20kHz频率下超声作用30分钟可有效释放血小板颗粒含量。 （4）溶剂/洗涤剂 (S/D)处理: 从制备工艺上来说，S/D处理法略微复杂。用1%磷酸三丁酯(TNBP)和1%的TritonX-100在30℃下处理新鲜冷冻血浆（FFP）4小时，制备S/D-FFP。添加的试剂用大豆油萃取和不溶性C18树脂层析除去。用S/D-FFP免疫家兔，然后用未经处理的FFP吸附诱导的抗体，证实没有新的免疫原的形成。这种方法还有一个好处就是可以灭活被脂质包裹的病毒。
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培养RAW264.7细胞常见问题及原因分析
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在日常培养过程中发现RAW264.7细胞容易出现的问题主要为以下几种： 1.复苏不易成功2.细胞形态变异明显3.消化困难4.细胞生长缓慢，当你的细胞培养遇到上述瓶颈，不妨试一试以下几种解决办法。 1、复苏难以成功 原因：RAW264.7对空间十分敏感，复苏密度太高，细胞增殖太快，加剧细胞营养缺失，加速细胞老化。 解决办法：T75培养瓶复苏细胞数量控制在104~105 2、细胞变异明显 原因：细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促使该细胞呈现梭形、长梭形 解决办法：改善细胞培养环境，例如与细胞接触的玻璃器皿均高温灭菌，换flask培养瓶，采用一次性器具，使用质量较高的胎牛血清 3、消化困难 原因：细胞老化后，细胞伪足多且长，使细胞难消化，使用胰酶或细胞刮会对细胞损伤较大 解决办法：无需胰酶使用吸管重复吹打，可消化大部分正常状态的细胞；但若细胞为“长脚”状态，即使加入胰酶消化超过10min，也难以消化下来，勉强消化，对后续的实验数据也有较大影响。 4、生长缓慢 原因：支原体污染会导致细胞生长缓慢，甚至难以贴壁 解决办法：定期进行支原体检测，如发现支原体污染，即刻使用支原体去除试剂
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临床M2巨噬细胞相关基因辅助**胰腺导管腺癌
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
胰腺导管腺癌(PDAC)是全球七大癌症相关死亡原因，也是最常见的人类恶性肿瘤之一。根据2018年全球癌症统计，大约有45.9万名新确诊患者和近43.2万人死亡患者。由于早期准确诊断和肿瘤快速进展等困难，大量PDAC（胰腺导管腺癌）病例在诊断时出现临床晚期或远处转移。因此，开发新的、可靠的预后评估和疗效预测指标以进一步推进针对性**具有十分重要的意义。 越来越多的证据支持浸润M2巨噬细胞在胰腺导管腺癌(PDAC)的肿瘤进展中起关键作用。然而，对M2巨噬细胞浸润和中枢基因(FAM53B)在临床结局和免疫**中的生物学作用缺乏全面的分析。近期有一个研究团队针对M2巨噬细胞相关基因表达进行研究，以期望能探索出评估PDAC预后及疗效的新指标。 研究人员合并了两个PDAC样本数据集，GSE16515和TCGA-PAAD，以研究M2巨噬细胞分析的潜在作用。使用CIBERSORT算法获得M2巨噬细胞图谱，然后通过WGCNA发现与M2巨噬细胞相关较为显著的模块。然后，利用多cox回归模型进一步确定模块中的候选基因，最终确定5个关键基因。然后，建立了多基因风险模型和综合预后图。在后续分析和外部试验组(ICGC-PACA-CA)中验证其预后价值。随后，研究潜在的信号通路和**预测的风险评分。最后，进一步探讨FAM53B在预后预测、免疫浸润和免疫**中的生物学功能，为PDAC的临床**策略提供可靠的见解。 22个候选基因的LASSO系数谱 为了进一步研究候选基因的预后价值，研究人员从TCGA-PAAD项目中提取了表达数据和随访信息。在单因素Cox分析的帮助下，鉴定了22个M2巨噬细胞相关基因，具有显著的预后价值。并对这些hub基因进行了Lasso回归，识别出PDAC中与预后相关的9个M2巨噬细胞相关基因。进行多因素COX回归分析，确定5个M2巨噬细胞相关基因(FAM53B、SPINK2、ABCB4、GH1、INTU)为中心基因，所有这些基因均被认为是有益的预后指标(所有HRs
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学会这6步，轻松搞定transwell实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
做肿瘤研究的人，很少有不知道 transwell 实验的，它是用来研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。今天咱们就来讲讲怎么做肿瘤细胞的侵袭转移实验。 Transwell 侵袭实验，其实原理简单地说，就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。 我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞就要分泌金属蛋白酶将基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。 Transwell 简易图 以下就来为大家介绍侵袭实验步骤： 实验前准备：transwell 小室（一般选用 12um），24 孔板，基质胶（corning），细胞实验所需的基本的材料。 1 基质胶铺板 用 Matrigel 1：8 稀释（可以直接用无血清的培养基稀释），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝胶（时间不宜太长，之前有人说在 37 度孵箱过夜，反正元元师兄觉得不太可能）。 注意事项： 1. 铺胶之前将枪头以及所用的耗材至于冰箱 4 度当中，否则配胶的时候会直接凝固。 2. 铺胶的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。 3. 注意铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。 4. 注意无菌操作。 2 制作细胞悬液 1. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 2. 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 PBS 洗 1－2 遍，这一步很必要，否则细胞表面覆有血清培养基，细胞没有迁移侵袭的动力），用无血清培养基重悬。 3 接种细胞 1. 细胞悬液 200µl 加入 Transwell 小室（肿瘤细胞数目需要
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进行 ELISA 前制备样品的提示
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
样品制备方法 细胞培养物上清液 将培养基移至离心管， 4℃， 1,500 rpm 离心 10 分钟。 立即进行上清液的分装（血清）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数 细胞提取物 将组织培养板放置在冰上 吸出培养基并用预冷PBS 轻轻洗涤细胞一次 吸出 PBS ，加入100 mm 培养板加入0.5ml完全提取缓冲液 收集细胞至在倾斜板中，然后移至经过预冷的离心管中。 短暂涡旋后在冰上孵育 15-30 分钟 在 4℃ 下13,000 x rpm 离心 10 分钟，沉淀不溶性内容物 将上清液（这里是指可溶性细胞提取物）分装至预冷的离心管中，并于 -80℃ 保存。尽可能减少反复冻融次数。 条件培养基 将细胞接种到完全（含血清）生长培养基中，使细胞增殖达到一定的融合率。 弃去培养基，数毫升预热PBS 小心洗涤。重复洗涤步骤。 弃去PBS 洗涤液并小心加入无血清培养基。 孵育 1-2 天。 将培养基移至离心管， 4℃ 1,500 rpm 离心 10 分钟。 立即分装上清液（血清）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。 乳汁 收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。 分装上清液并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。 血浆 将全血收集到含抗凝剂的管中，例如 BD 抗凝真空采血管（目录号：363080/363080）或添加 0.1M 柠檬酸钠至 1/10 终体积。 4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。 立即分装上清液（血浆）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。 尿液 收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。 等分上清液（血清）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数 唾液 收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。 立即分装上清液（血浆）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。 血清 将全血收集到未经处理的测试管中，或者到不含抗凝剂的管中，如 BD 血清用真空采血管（目录号：367812)。 在室温下连续孵育 20 分钟。 4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。 立即分
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细胞生长缓慢的原因分析
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
转载： 细胞生长缓慢的原因分析： 一.个别人的培养体系出现问题 1.检查你所培养的细胞是否存在污染。 (a) 如果培养细胞未添加抗生素(必须添加!),细胞污染则是不可避免的。 1)用肉眼和显微镜进行检查 2)如果细胞被污染则要弃掉。 (b)由于支原体污染不容易觉察到，因此必须定期检测 (c)检测可能污染的途径和原因 2.检查你用于培养细胞的培养基和血清(例如:是否批次不同或厂商不同)。如果你常规使用的是粉剂或10X储存液，而现在购买的培养基更换为1X液体，而随后证明问题就出自于此，处理方法请参见下则分享内容。 3.如果问题与培养基无关，那么很可能还是细胞的问题。 (a)复苏另一支冻存的细胞，并且与正在培养的细胞加以比较。两种细胞的培养应分开，以免在培养之初就产生污染。随后按(b) ~ (d) 步的方法做排查: (b)对传代培养的细胞进行计数，并绘制生长曲线与以前培养该细胞的资料进行比较，检在是否有下列改变: 1)传代时是否接种密度过低。 2)细胞传代是否过于频繁。 3)传代前细胞平台期是否过长。 (c)是否更换了胰蛋白酶或其他分离剂的批号?检查批号和供应商。 (d)是否细胞分离过程中严重损伤了细胞?应检测: 1)胰蛋白酶(其他消化试剂)消化时间是否过长。 2)消化液的浓度和活性是否过高、过强。 3)胰蛋白酶消化时、孵箱温度是否过高。 4)吹打消化细胞时是否过于用力。 5)细胞是否对EDTA过于敏感(如果添加了EDTA)， 6)胰蛋白酶稀释是否有误。 7)是否使用了一批劣质的胰蛋白酶消化液。 二.问题较为普遍，其他人也遇到同样的困难 检查共用的设备和试剂 温室和孵箱温度 1.温度和温度设定不准。 (a)自动调温器损坏。 (b)开关孵箱门过于频繁。 (c)孵箱门未关紧。 (d)风扇损坏造成散热不均。 用便携式温度表重新标定孵箱温度。 2.孵箱湿度不能维持 (a)水盘中未加水， (b)孵箱有渗漏。 (c)开关孵箱门过于频繁， (d)在Petri培养皿中放置一定量的PBSA,每日称重，以
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细胞培养小常识
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
切记，细胞培养基的储存条件是2-8℃。如果细胞培养基不小心被冻，您应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。 2.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢钠导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15min，来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。 3.当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 4.一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 5.总之，大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 6.血清的热灭活在免疫分析时可以灭活补体系统。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。热灭活是以往公认的操作步骤，并没有确凿的证据说明这样做是有益的。相反，对大部分细胞而言，GIBCO和HyClone都不推荐热灭活血清。因为加热可能使血清中的沉淀增加，使您误以为污染。 7.在进行传代培养时，我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释(1∶4或1∶2)进行传代，不进行活性检测，您可能接种比你认为的低得多的浓度的细胞，这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。 8.在订购的细胞到达后，应立即复苏，如果培养基还没有准备好，可将其放入液氮中，尽快复苏。千万不能放置在-20或-80℃的冰箱内。 9.细胞复苏往往是比较容易出问题的步骤。请在订购细胞时就向供应商索取详细的复苏步骤，并仔细阅读。有些供应商就不推荐在复苏时离心，对此类细节，应特别留意。 如何避免血清中沉淀物的产生? 1.
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初代细胞培养——消化培养法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
材料与仪器 组织 Hanks 培养液 胰蛋白酶 吸管 平皿 培养瓶 烧杯 搅拌器 三角烧瓶 不锈钢筛 眼科剪 眼科镊 计数板 实验步骤 1. 准备 取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20 分钟； 2. 布局 点燃酒精灯（或煤气灯），安装吸管帽（应通过火焰）； 3. 处理组织 把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60 分钟； 4. 剪切 用眼科剪把组织块切成2~3 毫米大小的块（用手术刀割亦可），以便于消化；加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞； 5. 消化 或用恒温水浴，或置入37 ℃温箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好（消化前瓶中需置一无菌搅棒）；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定； 6. 分离 在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块（必要时可继续进行消化）；低速（500~1000 转/分）离心消化液5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再加入培养液）； 7. 计数 用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH 要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说胆液体变酸，可用NaHCO3调整； 8. 培养 置入36.5 ℃温箱培养；如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。
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细胞培养中出现小黑点是什么原因？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在细胞培养中常可见到细胞及培养液中有一些大小不等、形态不同的黑色未知颗粒，去网上搜和请教师哥师姐得到的答案也多种多样。 那么这些小黑点究竟是什么那？我们又该怎么去应对这种情况那？ 小黑点都有哪些说法？ 非生物类 细胞碎片类 在细胞培养的时候， 由于细胞代谢、物质交换、周边环境变化，尤其是在从37度培养箱中拿出来观察的过程中，由于液体培养基的比热较大，液内温度高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，当然这些小碎末就会被搅动起来形成似乎“游动”的感觉；随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂，破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和残渣的出现； 再者，“小黑点”问题是很多细胞培养者已经发现的问题，但到目前为止尚未找到其监测和排除的试剂和手段，这首先是由于所谓“小黑点”病原体根本难以收集和捕捉， 这也从另一个侧面证明了“小黑点”问题的难以确定性；再说任何一种外来的微生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单地运动那样的外观性表现。 举一个例子：如果“小黑点”的运动状况已经到了用显微镜已经可以观察出的程度，其营养代谢和能量需求也就可想而知。这样，培养液中的影响消耗、酸碱含量程度等都要发生明显变化。 比如说：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡、引发其它类型微生物侵染等等。而这些状况，在所谓的“小黑点”感染中，是很难观察到的。同时“小黑点”的出现而影响细胞状态似乎得不到有力的证据。倒是细胞状态下降的时候，“小黑点”明显增多了。很有可能是细胞状态下降时，细胞衰亡产生的细胞碎片。所以小黑点属于细胞碎片是比较可能和合理的。 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西 网上有一篇文章说，小黑点其实不是一种生物，是无机物，其本质是玻璃培养瓶里的硅颗粒。可影响细胞生长，细胞状态好时，不
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