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微流控系统里的响应性
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
响应性（Responsiveness）通常指功能单元或系统在给定时间内完成指定任务的特定能力。微流控系统里的响应性可定义为：系统流体管路中的压力或流量达到需求值所花的时间，可通过以下三个“时间”来描述微流控系统的响应性： 1.响应时间（Response time） 2.上升时间（Rising time） 3.稳定时间（Settling time） 响应时间（Response time） 微流控系统中，响应时间是指从发送指令开始，至流体开始发生“动作”所持续的时间。系统响应时间越短越好，在如泵、阀等硬件组件中，其电气或机械响应时间应足够的短，以尽可能的降低系统响应时间。 上升时间（Rising time） 在微流控中，上升时间是指系统将流量从设定值的10％调至90％（有时为95％）所需的时间，它反映了系统调节其流量的快慢程度。有的系统可能具有很出色的响应时间和上升时间，但直到压力或流量稳定之间，其波动较大，如：高流阻的注射泵，控制算法不完善的压力泵。 稳定时间（Settling time） 在微流控系统中，稳定时间通常定义为：系统管路流量达到需求值并保持在±5%的误差范围内所需的时间，它反映了系统将流量稳定在设定值附近的快慢程度，稳定时间包括响应时间、上升时间和将值稳定在误差范围内的时间三个部分。 响应性越好的微流控系统，越能保证实验精度，节省时间和试剂。微流体泵类产品中，Fluigent压力泵与其他技术的泵相比，具有更加良好的响应性，特别适合与如液滴之类的对流量有高精度要求的应用。下图展示了一种高精度注射泵和Fluigent压力泵的响应性对比。 如何改善微流控系统中的响应性 在不更换硬件设备的前提下，微流控系统的响应性主要受响应时间的影响，而响应时间会受流阻与管路收缩（管路收缩将增大流阻，尤其在使用带有弹性的PDMS芯片时）的影响而导致响应延迟。可以这样理解：系统在响应之前，需要将“能量”积累至一定值，如果流阻越大，所需积累“能量”的时间就越长，响应时间也就越长。 因此，要改善系统响应性，**的策略就是使用
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如何选择合适的微流体导管
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
搭建微流控系统时，经常会用到各种微流体导管，选择合适的微流体导管，以一种简单可靠的连接方式去搭建系统，可以降低系统连接复杂度，改善实验性能表现，获得更可靠的实验结果。 如何选择合适的微流体导管？ 选择微流体导管通常考虑两个因素：导管尺寸和材质。 微流体导管尺寸 微流体导管常见尺寸如下： 1.导管外径：在产品信息里通产以OD（outside diameter）表示。 2.导管内径：指流体路径的直径，在产品信息里通常以ID（ inner diameter）表示，内径越小，导管带来的流阻就越大。 3.导管长度，在产品信息中心以L（Length）表示。搭建系统时，通常选择尽可能短的导管，以减小系统内部体积，导管长度越长，流阻越大。 微流体导管的尺寸转换 微流体导管尺寸通常以英寸表示，有时也会以英寸和毫米二者的混合形式表示，下表为常见的英寸-毫米单位转换表。 如何正确剪切微流体导管？ 许多微流体导管内径偏小，材质偏硬，为了防止剪切后的导管接口变形、堵塞或者受到污染，在剪切导管时，需要使用专门设计的导管切割器。 微流体导管的材料 具有相同规格的微流体导管种类众多，选择时应着重考虑导管材质的生物和化学相容性，微流体导管主要材料有： 1.PEEK（Polyetherether ketone）：一种柔性材质，对大多数化学试剂呈化学惰性，表面光滑，易切割成形，用PEEK制成的导管内径可以非常小，适用于低压和高压应用。 2.PTFE（Poly tetra fluoro ethylene）：PTFE又被称为特氟龙（Teflon），对最常用的溶剂呈化学惰性，无毒，无孔，透明，耐磨性强，主要用于低压应用。 3.FEP（Fluorinated ethylene propylene）：与PTFE相同，对最常用的溶剂呈化学惰性，透明，具有生物相容性，主要用于低压应用。 4.ETFE（Ethylene-tetra-fluoro-ethylene）：保留了PTFE的诸多优点，但更加坚固，适用于高压应用。 5.熔融石英（Fused silica）：又叫高纯度玻璃，主要用于毛细管，通常外径小于1/32英寸（如：外径360 µm，外径510 µm）。注意
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微流体操控之序列进样
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
在细胞灌流式培养应用中，需要将多种试剂连续不断的输送至细胞培养腔或反应器中，其中涉及到的多种试剂的连续进样被称为序列进样。序列进样操作繁琐，手动操作时会存在巨大的时间与成本（尤其在使用珍贵试剂时）问题，所以科研人员更加倾向于选择一种全自动或人工参与极少的系统来辅助完成序列进样。通常，可使用以下两种方式来实现无特殊要求的自动化序列进样： 1.注射泵结合阀门控制实现序列进样； 2.压力泵结合阀门控制实现序列进样。 注射泵结合阀门控制实现序列进样 系统示意图如下图。图中，注射泵与1个6位换向阀中心阀口相连；6位换向阀的1个出口与微流控芯片相连，其余5个出口与5个试剂瓶相连；与微流控芯片相连的废液池用于收集废液。 此系统工作原理为：首先，阀门中心阀口切换至与试剂瓶相连状态，注射泵吸入定量试剂，随后阀门中心阀口切换至与微流控芯片相连状态，注射泵将试剂推至微流控芯片中，接着阀门中心阀口切换至与另一试剂瓶相连状态，如此往复操作，便可实现多种试剂的连续进样。上图中，注射泵正将第2种淡黄色试剂吸入至注射器中。 此系统采用注射泵作为动力源，注射器可以更换为小体积注射器，具有死体积小、流量控制十分精确（如AMF的SPM精确度可达0.25μL/min）的优点，另外，注射器与换向阀之间直接连接，可减少系统中毛细管连接，从而减小系统内部体积。但同时，由于注射器的往复吸推操作，进样连续性表现欠佳，每次进样也不可能完全将吸入的试剂完全泵出，因此会存在一定的交叉污染。系统实物图见下图。 用压力泵结合阀门控制实现序列进样 系统示意图如下图。图中，1个Flow-EZ压力泵通过控制板分别与10个试剂瓶相连；10个试剂瓶分别与1个10位换向阀的外围入口相连；10位换向阀的中心阀口通过1个流量传感器（形成反馈，调节流量）与微流控芯片相连；与芯片相连的废液池用于收集废液。 此系统工作原理为：Flow-EZ压力泵输出压力，通过控制板可将压力输送至10个试剂瓶中的其中一个，从而
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微流体操控之循环进样
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
在细胞培养或器官培养中了在微流控芯片内模拟生物体内环境，除了温度、湿度和酸碱度等条件之外，还需要模拟生物体内如血液循环之类的流体流动，尽可能的为细胞提供与在生物体内一致的培养环境，同时，在流体循环过程中，也方便收集细胞产物。此外，在做一些微流体的过滤实验时，也需要进行流体循环，如使用全血过滤膜滤除全血中的红细胞时，通过流体循环使全血多次穿过全血过滤膜，可提高红细胞滤除率。 微流体循环中，需保证流体在微流控芯片中的流向一直保持不变，一般来讲，实现微流体循环的常见方案有以下3种： 1.利用循环模组实现微流体循环。 2.利用两向六位阀（L-Switch）实现微流体循环。 3.利用注射泵结合阀门控制实现微流体循环。 利用循环模组实现微流体循环 系统连接示意图如上图所示。图中，两个Flow EZ压力泵分别驱动储液池A和储液池B中的流体，流体被泵出后（单次只泵出储液池A或B中的流体），依次经过2位换向阀和循环模组，通过2位换向阀和循环模组内部的流路切换，可保证流体永远从循环模组A口流出，依次经过微流控芯片与流量传感器，从而保证流体在微流控芯片中以同一方向流动，之后流体再从循环模组B口流入，经过2位换向阀，最后流至储液池A或B中。 此系统进行流体循环时，流体流向在“储液池A-微流控芯片-储液池B”和“储液池B-微流控芯片-储液池A”两种状态下切换。 利用两向六位阀（L-Switch）实现微流体循环 此系统组成部件包括：MFCS多通道压力泵，两向六位阀（L-Switch），流量传感器，微流控芯片和A 、B两个储液池。其连接方式如下图所示。 此系统进行微流体循环时，会在位置1和位置2两种状态下进行切换。 位置1：MFCS压力泵将A储液池中的流体泵出，依次经过L-Switch的port 3和port 2、流量传感器、微流控芯片，然后再经过L-Switch的port4、port5和port6、port1，最后再流至B储液池中。 位置2：压力泵将B储液池中的流体泵出，依次经过L-Switch的port1和port2、流量传感器、微流控芯片，再经
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如何建立可靠无泄漏的微流体毛细管连接
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
在微流体实验中，若不能正确的连接各毛细管，很容易发生流体管路堵塞或漏液（或高压漏液）的情况，从而降低实验效率。如何建立可靠、安全无泄漏且零死体积的微流体毛细管连接，通常分为以下两步： 1.裁剪合适长度的毛细管。 2.正确的连接毛细管。 裁剪合适长度的毛细管 通常来讲，一个良好的微流控平台布局将最大程度的减少毛细管使用量，从而减少实验中试剂使用量，所以我们建议先布置微流控平台各组件（但不将各组件固定），然后再确认所需毛细管长度。 裁剪毛细管时，因许多微流体毛细管内径偏小，材质偏硬，为了防止剪切后的毛细管接口变形、堵塞或者受到其它污染，在剪切毛细管时，需要使用专门设计的毛细管切割器，见下图。 正确的连接毛细管 下面以毛细管、接头和底座为例来介绍毛细管的连接，可分为以下几步： 1.将毛细管插入接头并穿出接头大约1mm左右，如下图所示： 2.将带有毛细管的接头插入底座并拧紧。这一步通常做法是，一边把着毛细管往底座里推到头，同时一边拧紧接头，如下图所示。拧紧后，接头末端的锥形部分在底座中会被压缩，锁紧毛细管，从而将毛细管位置固定，同时防止漏液。 注意：此步骤切勿过分拧紧接头，以防损坏接头或底座。 3.轻轻的将毛细管往外拔（见下图），以确认连接牢固，如有松动，或者毛细管被拔出，可能是因为毛细管与接头的尺寸不匹配，需要重复以上步骤。 可能出现的连接情况 下图展示了在连接毛细管时，可能出现的3种连接情况。 1.红色毛细管未穿过接头，当拧紧接头时，接头前的锥形孔将会挤压毛细管的末端，很可能会造成毛细管阻塞。 2.黄色毛细管已插至一端较深的距离，但未插到底，此种情况下，流体能够正常流动，但毛细管末端和流体管路之间的空间会构成死体积，如果死体积空间很大，此连接也可能会造成漏液。 3.绿色毛细管完全插到底，可保证流体的畅通流动，属于可靠的、无泄漏的且零死体积的毛细管连接。
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如何避免微流体实验中的气泡
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
在微流体实验中，气泡的产生会带来诸多问题：气泡是动态的，会随着压力和温度的变化发生膨胀或收缩，因此会吸收压力变化，降低系统的响应时间，同时也会改变流阻，导致流量不稳定，此外，在细胞培养中，气泡会导致细胞死亡。 本文内容分为以下3个部分： 1.气泡是如何产生的？ 2.如何避免气泡的产生？ 3.如果气泡不可避免，怎么办？ 气泡是如何产生的？ 一般来讲，微流体实验中的气泡来源分为以下几个方面： 1.微流控系统非完全密封，存在漏气情况。 2.更换试剂进行进样时，可能会往系统中引入气体。 3.流体能溶解一定量的气体，随着压力或温度的变化，气体溶解度发生变化，可能会释放出气泡。 4.微流控芯片的部分结构会导致气泡产生，图1为常见的几种会产生气泡的结构：死角（图1. a）、尖角（图1. b）、宽且浅的腔室（图1. c）和两块材料间的不规则接触结构（图1. d）[1]。 如何避免气泡的产生？ 避免气泡的产生，可从以下几方面入手： 1.控制外部环境： （1）压力：低压相对高压而言，会降低气体溶解度。 （2）温度：实验中保持恒温，可避免气体溶解度发生变化而释放气泡。 （3）时间：实验时间越短，气泡增长到影响实验结果的可能性就越小。 2.改进芯片内部设计：避免在芯片设计中出现以下结构：死角、尖角、宽且浅的腔室和两块材料间的不规则接触结构（见图1）。 3.改善系统外围设备及连接： （1）检查所有接口的密封性。 （2）尽量减少连接头、连接器的使用，每多一个连接头，都会增加气泡产生的潜在风险。 如果气泡不可避免，怎么办？ 如果在实验中，气泡还是不可避免的会产生，可采用以下办法： 1.对试剂预先进行脱泡处理。 2.用异丙醇或表面活性剂（如SBS）清洗系统管路。 3.使用一些现有的商业化产品，如法国Fluigent的去泡器（Bubble trap）或美国Corsolution的脱气器（Degasser），其原理均是采用了一种透气不透液的膜，通过施加真空的方式，实现气液分离，从而去除已产生的气泡。 参考文献： Per
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干货|什么是微流控系统？
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
微流控系统，指的是集微流体的驱动、操控、监测、反应、检测与分析等功能于一体的实验平台，常规来讲，一个微流控系统应包含以下几个子系统： 1.流体驱动子系统。 2.过程监测及控制子系统。 3.微流控芯片。 4.检测分析子系统。 下图为PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）微球制备微流控系统的实物连接图，可辅助理解微流控系统的概念。 流体驱动子系统 此部分通常由微流体驱动泵组成。 压力泵、注射泵和蠕动泵是最常用的微流体驱动泵，可满足多种微流控应用需求，其中，压力泵常用于高精度高稳定性微流体进样（如液滴制备），注射泵常用于中等精度和高压微流体进样（如微流控石油驱替），蠕动泵常用于低精度大流量循环流体进样。 下图展示了FLOW-EZ压力泵工作原理和一个简易微流控系统示意图。 过程监测及控制子系统 此部分通常由流量传感器和各种阀门组合而成。 在此子系统中，即可实现流量的反馈控制，同时，结合阀门控制，也能实现流体的序列进样、循环进样和体积定量等多种流体操控，实例可参考下图。 微流控芯片 微流控芯片为微流控系统中的核心部件，通常需在搭建微流控系统前，根据所研究应用设计微流控芯片，再根据芯片功能需求选择所需的驱动源、阀以及显微镜和CCD等组件。 通常情况下，考虑到成本、实验室环境以及时间等因素，可在标准微流控芯片、定制微流控芯片和搭建自己的芯片研发实验室之间做出选择。 下图为Micronit所研发的多种标准微流控芯片及其部分夹具展示。 检测分析子系统 在细胞培养、细胞成像和石油驱替等多数应用中，需要对微流控芯片上反应进行观察、记录及分析等操作，而这些微反应是肉眼不可见的，需要使用高速CCD，显微镜或光谱仪等高精度设备对实验现象进行检测、数据采集及分析。 下图展示了一种微米级光谱仪，以及其所记录的数据和数据分析。 在搭建微流控系统时，我们可以选择功能比较齐全、适配性较高的通用型微流控综合实验平台（见下图），但在更多时候，针对不同应用，尤其是微
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液滴微流控（一）：液滴制备方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
基于液滴的微流控系统，因其提供了方便处理微流体(μL，pL)的混合、封装、分选等多种操控的可行性，并适合高通量实验，在近几十年期间，得到高速发展。 什么是液滴？液滴微流控有哪些应用？如何搭建液滴制备系统？有关液滴的诸多问题，将会是我们近期所要分享的内容。 什么是液滴？ 微流控里的液滴，可以理解为两种互不相溶的液体，在特定条件下发生“融合”，变成了一个个微弹的，类似皮球状的微球（见下图A），通常可分为水包油和油包水两种液滴，当对已经生成的液滴进行再次包裹，便会得到双乳滴（见下图B）。 液滴制备所用的两种互不相溶的液体，又被称为连续相（Continuous phase）和分散相（Dispersed phase），液滴生成的大小将会受到连续相和分散相的流量比，两相之间的界面张力和用于生成液滴的结构等因素的影响。 如何制备液滴？ 液滴制备可分为“主动”与“被动”两种方式，两者相比，前者需要一些外部能量才能进行液滴操控，如：电、磁或离心力，而后者，仅需要几种简单的微流控芯片结构，便可产生液滴，因此，“被动”制备液滴方法应用得更为广泛。 常见的“被动”制备液滴方法可分为3种[1]： 1. T型结构法（T-junction） 此方法由Thorsen[2]等人于2001年首先提出，是最简单的一种液滴制备方法。在此结构中，连续相和分散相在T形口处汇聚，分散相逐渐进入主干道，在连续相的剪切下，最终“断裂”，形成液滴。 2. 流动汇聚法（Flow focusing）[3] 此结构中，分散相直接进入主干道，连续相垂直于分散相从分散相两侧注入，分散相被“夹住”，由于粘性力与两相间表面张力的作用下，最终形成液滴。与T形结构相比，最大区别在于其对称性。 3. 共轴聚焦法(Co-flow)[4] 此方法设计了两个同心的毛细管结构，内部毛细管注入分散相，外部毛细管注入连续相，当分散相逐步进入主干道时，连续相所产生的的粘性力会促使分散相“断裂”，从而形成液滴。 参考文献： [1] Zhu P , Wang L . Passive and active droplet generation w
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液滴微流控（二）：液滴制备系统
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
成功制备稳定、均一的液滴需同时具备三大关键要素：稳定的压力输出，精确的流量控制和合适的芯片设计。本文以十字型液滴芯片为例，介绍一种可靠的液滴制备系统，其示意图见下。 液滴制备系统概览 此液滴制备系统组成部分有：2个FLOW EZ压力泵，2个储液池，2个过滤器，2个流量传感器，1个芯片夹具，1个十字型液滴芯片和1个回收池组成。下图为液滴制备系统实物连接图。 此系统工作时，2个FLOW EZ压力泵分别将油相与水相从储液池中泵出，首先经过过滤器，滤除试剂中的杂质（防止因杂质造成芯片堵塞），然后经过流量传感器（通过反馈控制，进一步提高流量控制精度），再经过固定在芯片夹具（芯片夹具具有一定重量，防止芯片发生位移）中的十字型液滴芯片，最终，油相与水相在液滴芯片中形成液滴后，于回收池中完成收集。 为什么选择压力泵？ 注射泵、蠕动泵因其工作原理属于机械驱动，每“行进”一步之间存在一定的时间间隙，因此会存在一定的脉冲效应，造成输出压力存在脉冲现象，流量稳定性欠佳，而压力泵工作原理为压力驱动，不存在脉冲效应，可实现十分稳定的压力输出，从而获得十分稳定的流量控制，是作为液滴制备驱动源的不二选择，再搭配其配套的流量传感器，短时间之内便可实现流量的精确稳定控制。 合适的芯片设计 合适的芯片设计是成功制备液滴的关键，我们应根据自身所要制备液滴的实际情况，在不同通道宽度，通道亲水或疏水，不同结构设计，顶部进样或侧边进样等多种液滴芯片中做出选择，下图展示了三种液滴芯片。 液滴生成展示 通过调节压力泵的输出压力，改变油相与水相的流量，便可实现不同大小、频率的液滴制备，下图分别展示了本文所用系统在4种不同压力下的液滴生成情况。 搭建液滴制备系统，须严格满足三大要素：稳定的压力输出，精确的流量控制和合适的芯片设计。
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液滴微流控（四）：在液滴中培养大肠杆菌
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
已有研究表明，使用氟化油进行油包水液滴制备，可用于长期细胞培养[1]，相较矿物油，氟化油表现出更好的生物相容性[2]，但要找到一种有效稳定液滴的表面活性剂，仍是一个挑战。本研究的目的是：通过在液滴中培养大肠杆菌（Escherichia coli），说明新型表面活性剂dSURF的生物相容性及液滴稳定表现。 此研究由Dr Oksana Shvydkiv在其实验室（Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology. （超链接https://www.leibniz-hki.de/en/institut.html））完成。 材料及设备 连续相试剂：含0.5%或3%的dSURF（Fluigent）氟化液Novec HFE-7500（Sigma Aldrich）。 2.分散相试剂：500μl OD600值为0.005（5 x 106 CFU/ml）或0.01（10 x 107 CFU/ml）的大肠杆菌悬浮液ECJW922。（CFU，colony forming unit，菌落形成单位；OD，Optical Density，光密度） 3.液滴制备解决方案：液滴PDMS芯片由研究者自行设计，液滴制备解决方案为Fluigent所提供的液滴制备系统（见下图），主要部件包含压力泵FLOW EZ（压力泵流量控制稳定）、流量传感器。 实验过程简述：压力泵FLOW EZ将试剂泵至液滴芯片，以生成液滴；PC端AIO软件监测并控制流量，以达到合适的液滴大小及生成频率。 液滴监测 为监测液滴的稳定性并观察大肠杆菌的生长状况，将液滴转移至微流控芯片观察室，于倒置显微镜（Axio Observer Z1, Zeiss)上进行观察，所用物镜放大倍数为10倍，使用PCO相机在开始培养的2小时，4小时和20小时后进行图像采集。 培养结果 使用OD600=0.005大肠杆菌悬浮液，0.5% dSURF表面活性剂，在37℃温度下的培养结果： （A）培养4h后的明场液滴图像；（B）培养20h后的明场液滴图像 （C）培养4h后的暗视液滴图像；（D）培养20h后的暗视液滴图像 观察上图，可明显观察到稳定的单分散液滴，含大肠杆菌的液滴数量占比为46±0.8 %，理论计算值为54%（液滴尺寸为67.3μm，160pL）。它们之间的差异可以解释为实验过程中出现的一
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肿瘤**预后与免疫参数改变的关联
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
胰腺癌，尤其是导管腺癌，是恶性程度最高的肿瘤之一，5 年生存率仅 9%。提高胰腺癌的诊疗水平，改善预后是急需解决的重要临床问题。 现有数据表明，PD-1/CTLA-4抑制剂可以阻断肿瘤对T 细胞的抑制，在胰腺癌方面，也有多个初步临床数据证实PD-1与新辅助化疗联合应用，能显著延长患者的无进展生存和总生存。 可见，免疫系统在肿瘤发生发展和**中是非常重要的，改善患者的免疫功能状态，可能有助于提高**疗效。那么，有必要对患者**过程中免疫功能的改变进行监测吗？让我们一起在下面这个病例中一探究竟： ------------ 肖某，男，60 岁，因腰背部疼痛 2 月余就诊。 入院检查： 外周血 CA199 > 1200 U/mL，胰腺增强动脉造影示胰腺癌。2019 年 5 月 24 日超声内镜引导下的细针穿刺（EUS-FNA）诊断胰腺癌。 既往病史： 高血压病史，控制良好，无心脑血管病史，无糖尿病史。10 年前因胆囊结石伴慢性胆囊炎行腹腔镜下胆囊切除术，因甲状腺瘤行腔镜下甲状腺瘤切除术。 吸烟 20 年 × 20 支，未戒烟，少量饮酒。入组新辅助化疗后手术组。 **经过： - 2019 年 6 月 4 日起，行 S1（替吉奥）+ 白蛋白紫杉醇化疗 8 个周期； - 2019 年 9 月 6 日，开始射波刀 6 次放疗，合计照射剂量 40.8 Gy； - 2019 年 9 月 24 日，全麻下行开腹胰体癌根治手术、左肾上腺切除术和腹膜后淋巴结清扫术，术后病理诊断胰腺导管癌。 诊断初期先进行了新辅助化疗，完成化疗周期及射波刀**之后，血清肿瘤标志物均降至正常，MRI 提示肿瘤显著缩小，提示放化疗对患者**效果显著。 辅助检查： 1、胰腺磁共振 2、肿瘤标志物检测 在患者化疗前、化疗及射波刀**后及外科手术前 1 天、手术后三月余进行肿瘤标志物检测，结果如下： 3、免疫功能参数检测 在患者启动化疗初期、放化疗完成后手术前 1 天和手术 1 天后，采用十三色流式细胞仪（DxFlex，Beckman coulter）进行了三次免疫评估，拟观察患者系统免疫参数变化及其与其他
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如何提高PCR的扩增特异性
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
疫情当下，最热频的词汇莫过于核酸检测了。而核酸检测最核心的技术也越来越被大众所熟知，就是我们高中就学过的聚合酶链式反应，又称为PCR。 自从1983年，Kary Mullis才发明出这个用于扩增目标DNA的研究工具—PCR技术后，其逐渐成为分子生物学研究必不可少的一部分，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。而Kary Mullis也因这一发明获得了1993年的诺贝尔化学奖。 而熟悉PCR的同学们都知道，PCR之所以能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍以便于下游实验检测，主要依靠这三个步骤连续多次循环而实现： （1） DNA变性：首先对双链DNA模板进行高温加热，使DNA双链变性解离成单链； （2） 引物退火：被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合； （3） 延伸扩增：DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。将这些步骤重复（“循环”）25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。 而PCR这项核心技术的核心是强大的DNA聚合酶，其在新DNA链合成中扮演着重要的角色，是PCR反应不可或缺的组成部分，是保证PCR扩增产物特异性、热稳定性、保真度等方便的重要因素。 而对目的基因进行PCR扩增的过程中，延伸错配的非特异产物和引物二聚体的产生是PCR实验中常遇到的问题，这些都与DNA聚合酶有关。因为这种非特异扩增会显著降低目的基因扩增的产率和灵敏度，从而影响扩增结果的合理解释和下游实验应用的成功。 那么，问题来了，如何减少非特异性扩增？ 方案之一：在冰上配制PCR反应，这是我们经常的操作。因为这样有助于将DNA聚合酶的活性保持在低水平。 但在PCR开始之前，依然可能会合成不需要的产物。 另一个办法是将DNA聚合酶的加入时间推迟到第一个循环的退火步骤。因为只有在90℃以上的初始变性步骤之后才能开始扩增，所以该技术被称为“热启动”。所以后来为了避免非特
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液滴微流控（六）：单细胞高通量液滴测序（Drop-seq）
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
细胞是生物结构与功能的基本单位，形态类型千差万别。通过细胞基因组学，可以描述细胞特性及功能，本文所介绍的单细胞（single-cell）高通量液滴测序（Drop-seq）技术，是一种快速分析成千上万个单细胞的方法，通过将每个细胞包裹在纳升级微滴中，进行RNA杂交并生成mRNA转录物，制作细胞基因表达谱，进一步可分析mRNA转录物的起源细胞。 原理简述 Drop-Seq基于液滴微流控技术，首先，将细胞悬浮液与带有分子条形码的微珠悬浮液泵至微流控芯片，汇聚并形成层流，之后再与油相汇聚，形成单分散的微滴，将每个细胞与一个微珠一同包裹于同一微滴中，随后完成RNA杂交并裂解微滴，释放mRNA杂交物，完成逆转录，最后，以PCR方式完成核酸扩增，并进行测序分析。 测序过程 1.准备材料：从组织中分离细胞，制备细胞悬浮液；制备带有分子条形码的微珠悬浮液。 2.制备微滴：将细胞悬浮液与微珠悬浮液泵至芯片，再与油相汇聚形成单分散的微滴，将每个细胞与一个微珠一同包裹于同一微滴中。 3.RNA杂交：裂解微滴中的细胞，细胞释放mRNA，与微珠上的分子条形码杂交。 4.逆转录：裂解微滴，释放mRNA杂交物，开始逆转录，以形成mRNA逆转录物（STAMPS）。 5. PCR扩增：在核酸外切酶的作用下，将每条mRNA逆转录物“切下”，并以PCR方式进行核酸扩增，以放大基因信息。 6.测序分析：使用各种生物信息学工具进行测序分析。 为什么用液滴微流控？ 液滴微流控将微体积样本快速分离，可实现成千上万个细胞的平行高通量分析，通常情况下，每秒可产生1000个微滴，每个微滴的体积为1nL，因此在试剂量上来讲，成本将成千倍的降低，此外，其实验过程无需用到流式荧光细胞仪等高端仪器，操作简单、快捷。 液滴测序芯片图解 此微流控芯片是开源的，开源链接：http://mccarrolllab.org/dropseq/。 液滴测序系统配置 液滴测序系统主要组件： 1.三个Flow EZ压力泵或一个MFCS EZ压力泵（四通道）。 2.三个流量监测传感器。 3.一个数字高速
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液滴微流控（七）：单细胞高通量分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
细胞是生命结构与功能的基本单位，在对生命健康与疾病研究的探索中，常需以细胞研究为基础，而细胞之间的差异，使得在对群体细胞的研究中，不可避免的会掩盖了许多个体细胞的独特信息，为了更全面的探索生命，更好的服务人类健康，单细胞分析愈发受到重视，其难点在于对单个细胞的捕获、刺激以及检测分析等，而液滴微流控技术，因其具有流体操作简便、高单分散性、小型化、低成本、高灵敏度、高通量等优点，迸发出鲜活的生命力，已成为单细胞操控与分析的有力工具。 案例一：高通量筛选 Thomas[1]等人研发的单细胞高通量筛选系统，通过将单个酵母细胞包裹在20pl的微滴中，在微滴中对酵母细胞孵育并使其分泌出一种酶，接着在微流控芯片对每个液滴注入荧光底物，最后，使用荧光检测模块以300滴每秒的频率对液滴进行分选。其操作流程可见下图。 案例二：高通量计数 Heng[2]等人基于液滴微流控，研究了一种简单而精确的细胞计数方法，实现了大量人体细胞与细菌的计数，证实在液滴中的细菌和人体细胞分布与预期的泊松分布高度一致，并通过大量的统计数据，进一步评估了液滴中人类细胞的细胞活性。 上图中，a为人类细胞计数的明场图像，b为HL60 细胞的荧光图像，c和d分别为每滴微滴中计数HL60细胞和H1975细胞的计数分布图。 常见液滴单细胞应用 1.单细胞基因组或转录组分析：检测所需分子量更小。 2.组织分析：研究细胞间异质性。 3.谱系示踪：进行基因组与生化分析，比传统FACS分选技术更加灵活。 4.细胞分选：与流式细胞仪相比，所需细胞数量更少，更适合稀有样品的计数。 5.体化医疗：对肿瘤单细胞的异质性分析，以进行癌症免疫**。 参考文献： [1].Thomas, Stéphane, Andrew D, et al. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica[J]. Microbial Cell Factories, 2017, 16(1):18. [2].Heng, Ouriel, Jeremy, et al. High throughput
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浅析新冠病毒疫苗研发技术路线及工艺解决方案 (上)
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
全球新冠疫情愈演愈烈的背景下，疫苗被寄予彻底终结疫情的厚望。然而，世界卫生组织不止一次强调疫苗的开发很难在18个月内完成。要知道，最近几年人类的疫苗研发往往耗时数年。但这一次，人类必须提速。那么我们要如何优化研发流程才让全球不同背景的研发者都可以跑步前进研发新冠疫苗呢？ “药”点分析： ● 全球新冠疫苗开发现状 ● 新冠疫苗不同开发思路解析 ● 赛多利斯针对不同类型疫苗的工艺解决方案 1. 全球新冠疫苗开发现状 根据WHO官网提供的的全球疫苗临床实验项目清单，截止到4月20日，一共有下列项目位居前列： · WHO：全球新冠疫苗试验候选清单 其中，核酸疫苗属于新型疫苗，早期研发速度快，但风险在于并没有已经的上市品种作为验证；腺病毒载体疫苗由于有埃博拉研发先例，因此研发进度相对较快；灭活疫苗技术最传统，但同时综合风险也最低。 疫苗虽然是药品，但它比较特殊。与其他药品相比，它是给健康人群，甚至是给婴幼儿、老年人等特殊人群使用的。 所以对于疫苗，人们的主要关注点在于： 1）疫苗是否有效？ 2）疫苗是否安全？ 3）疫苗是否经济？ ——疫苗研发不是投入500万做出一支疫苗只给一个人使用，而是研发出一支几十元、几百元的疫苗给几百万人使用。 疫苗研发必须要平衡这三点：安全性、有效性、经济性。 2. 新冠病毒疫苗的开发策略浅析 新冠病毒是一种新型的冠状病毒，跟SARS和MERS病毒属于同一属。这个病毒大小是125纳米，结构上相对比较大。比流感病毒，略大，（流感病毒80-120纳米）。针对本次新冠病毒疫苗的开发，各个国家的研究团队策略不同。其中有的传统，有的新锐。不同的疫苗研发路线，各有优缺点。 一种是基于传统病毒疫苗的开发思路——也就是用病毒培养的方式。然而，即使都是病毒培养的方式，也不尽相同，有的方式是用细胞工厂或微载体；有的则在灭活脊髓灰质炎的平台操作；有的是基于流感疫苗基培的基础做的。 重组蛋白的疫苗研
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