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对医疗器械进行手动目视检查的挑战与解决方案（上）
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
如何借助数字化增强解决方案克服这一挑战（上） 本文旨在对医疗器械行业中普遍存在的手动目视检查是如何导致不一致结果这一问题进行讨论。此外，本文还讨论了质量经理和操作员在进行手动检查时所面临的挑战，以及他们是如何使用数字化增强检查解决方案来克服这些挑战的。手动检查导致出现不一致现象的原因是多方面的。主要原因在于，很难保证进行检查的多名操作员都遵循标准规程，因为检查过程中存在很多手动步骤，如数据传输和纸质文档，而非数字文档。相反，数字化增强解决方案可以实现更一致、更有效的检查。为了帮助用户实现这一目标，用于可追溯显微镜检查的智能设备Exalta可为所有进行检查和缺陷分析的操作员提供逐步作业指导，使用易于显示的参考图像并进行叠加以便进行比较，将结果与既定规格进行比较，并能实现数据的自动化存储及数字报告生成。 引言 在医疗器械行业，我们经常对产品部件进行手动目视检查，以便进行产品质量保证和质量控制（QA/ QC），尽管手动目视检查可能会导致出现结果不一致的情况。手动检查之所以如此困难且可靠度不高，其原因是多方面的。而手动检查所面临的挑战，以及数字化增强检查解决方案如何能够克服这些挑战也一直是人们讨论的话题。借助Leica Microsystems制造的用于可追溯显微镜检查的智能设备Exalta，医疗器械行业的质量经理和操作员可以采用这样一种数字化检查方式。与通常使用的手动解决方案相比，该设备有助于客户进行更快捷的分析，并为客户带来更加一致、可靠的检查结果。 数字化与手动检查对比优势 1. 所有操作员都遵循标准操作规程（SOP） 2. 所有操作员进行一致检查 3. 自动化生成报告及处理 使用显微镜进行手动目视检查 在许多情况下，使用显微镜进行手动目视检查会导致效率低下，检查结果不可靠。之所以会存在这种缺点，可能是由于整个检查流程中多个步骤的不一致性所导致的——从标准规程的定义和执行，到设备的实际检查和结果报告生成。典型的手动检查
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流式细胞术的基本原理和常见应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）从字面意义理解，Flow——Fluid、Cyto——Cell、Metry——Measurement，流式细胞术指的就是检测流动细胞的一种技术，能在细胞流动的状态下，快速检测细胞或颗粒物的特异性指标。它是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 基本原理 流式细胞术用到的仪器叫流式细胞仪（Flow cytometer ），是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。目前广泛应用于外周血细胞的免疫表型分析、凋亡分析和细胞因子的检测。 在一定的压力下，鞘液带着细胞或者微粒通过喷嘴中心进入到流式照射室，在流式照射室的分析点，激光照射细胞并发生散射和折射，发射出散射光，同时被荧光标记的颗粒发射出荧光。散射光和荧光分别被不同的检测器接收，通过光电倍增管将检测到的荧光信号转换成电信号，这些电信号放大后再经过数据化处理输入电脑，供我们进行分析。 流式细胞仪工作原理 流式通道 流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道。 流式细胞仪中能测定两种方向的散射光信号，即FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）。 FSC的值代表细胞的大小：细胞体积越大，其FSC值就越大。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。 SSC的值代表细胞的颗粒度：细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越
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药用注射级胆固醇的提取方法及作用效果
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
在脂质体制备过程中为何都要使用胆固醇？药用注射级胆固醇有何效果是如何被提取出来的？本篇文章就让AVT小编带大家了解一下药用注射级胆固醇吧！ 胆固醇有药用的用途，临床使用的很多激素都是用胆固醇来合成，另外，胆固醇还是一些先进药物载体的添加剂，说到作用原理，小伙伴们应该知道，胆固醇可调节磷脂双分子层膜的流动性，使膜通透性降低，减少药物渗漏。同时可使脂膜维持一定柔韧性，增强脂质体囊泡抗击外部条件变化的能力，并对磷脂的氧化有一定保护作用。 制备普通载药脂质体，胆固醇是必须的添加物，用量一般为CHO:PC=0.3~1（摩尔比）。因PC和药物的不同，存在胆固醇的zui佳用量。在一定范围内，脂质体的粒径、氧化稳定性、物理稳定性与胆固醇添加量成正相关，超出范围时，超过膜负荷，会造成部分脂质体破裂。另外，胆固醇的添加会对膜相变温度有一定影响，临界值以内使相变温度降低，临界值以上，使相变温度升高。 温敏脂质体有特殊的动力学特征，为了降低相变温度时的稳定性，迅速释放药物，可不添加胆固醇。 | 中文名称：胆固醇（供注射用） | 商品名：CHO-HP | 英文名称：Cholesterol (for injection) | 化学名称：胆甾-5-烯-3β-醇 | 英文化学名称：Cholest-5-en-3β-ol | 分子式： C27H46O | 生产商：日本精化株式会社 | CAS号：57-88-5 | DMF号：024780 | EINECS号：200-353-2 | 备案登记号：F20170000106 | 级别：药用注射级 | 执行标准：USP、EP、CP | 用途：脂质体膜材、乳化剂 | 溶解性：易溶于甲醇、乙醇、氯仿，不溶于水 | 分子量：386.7 | 保存条件：常温 | 注意事项：避免强酸、强碱、强氧化性物质 | 货号：001001 药用的胆固醇每年需求量很大，但是，因为是多手性物质，合成困难，目前还是采取动物组织提取及羊毛脂提取两种方式获得。 动物组织提取 动物组织提取法是以新鲜动物内脏、骨髓及脑为原料，工艺为bin酮提取→乙醇精制→硫酸水解→低温结
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药物稳定性研究的实验原理和注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
药品的稳定性是指其保持理化性质和生物学特性不变的能力。若药品的稳定性差，发生降解而引起质量变化，则不仅可能使药效降低，而且生成的杂质还有可能有明显的毒副作用，影响药品使用的安全性与有效性。 稳定性试验的目的是考察原料药或药物制剂在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立药品的有效期，保证用药安全。 一、稳定性试验基本要求 要求1: 影响因素试验用1批供试品进行（原料药或制剂）。加速试验与长期试验要求用3批供试品进行。 要求2: 原料药供试品应是达到一定规模生产的产品。供试品量相当于制剂稳定性试验所要求的批量;原料 药合成工艺路线、方法、步骤应与大生产一致。 要求3: 药物制剂供试品应是放大试验的产品，其处方和工艺与大生产一致。药物制剂，如片剂或胶囊剂，每批放大试验的规模，至少应为10000片或粒。大体积包装的制剂，如静脉注射液等，每批放大规模的数量至少应为各项试验所需总量的10倍。特殊品种、特殊剂型所需数量，根据具体情况另定。 要求4: 供试品的质量标准应与临床前研究及临床试验和规模生产所使用的供试品质童标准一致。 要求5: 加速试验与长期试验所用供试品的包装应与上市产品一致。原料药所用包装应采用模拟小桶，但所用材料与封装条件应与大桶一致。实验室规模的产品仅可用作辅助性稳定性预试验。 要求6: 研究药物稳定性，要采用专属性强、准确、精密、灵敏的药物分析方法与有关物质(含降解产物及其他变化所生成的产物)的检查方法，并对方法进行验证，以保证药物稳定性结果的可靠性。在稳定性试验中，应重视有关物质，特别是降解产物的检查和鉴定。 要求7: 由于放大试验比规模生产的数量要小，故药品注册申请人应在获得批准后，从放大试验转人规模生产时，对最初通过生产验证的3批规模生产的产品仍需进行加速与长期稳定性试验。 二、原料药物与
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伊尼霍夫氏碱法与盖勃法(酸法)两种乳脂快速检测方法介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
牛乳脂肪作为一项国家检测牛乳质量的重要指标之一，已被广大生产厂家和消费者所重视。牛奶脂肪含量的测定方法有重量法和容积法，容积法较重量法测定速度快、省时、省力。常用的一些方法有罗兹—哥特里法、伊尼霍夫氏碱法、盖勃法等。在我国最常用的乳脂测定方法，分别是伊尼霍夫氏碱法与盖勃法(酸法)。 牛乳脂 牛乳的脂肪以微细的球状呈乳浊液分散在乳中，是牛乳的主要成分之一。 牛乳中的脂肪含量随乳中的品种及其他条件而异，质量分数一般为３％～５％之间。 由于乳脂肪的乳浊液相当稳定，所以测定乳脂肪时，借助醇、酸、碱等化学处理的方法来达到破坏脂肪球膜， 结合成脂肪层的目的。 伊尼霍夫氏碱法 所需材料 盖勃乳脂计、恒温水浴锅（也可采用铝锅加水在电炉上加热）、试剂 方法流程 碱试剂：在第１个烧杯中加人３０gＮａＯＨ，用３００ｍｌ蒸馏水溶解； 在第１个烧杯中加入４０gＮａ。Ｃ０３，用３００ｍｌ蒸馏水溶解；在第３个烧杯中用水将７５gＮａＣＬ加热到６５～７０℃使其溶解；然后将①②③溶液混合在一起，注入容积为１０００ｍｌ的容量瓶中，用水加至刻度， 用脱脂棉滤入试剂瓶中，塞紧备用。 异戊醇一乙醇混合液：将１３０ｍｌ的异戊醇于２１０ｍｌ的９６０乙醇混合，加入试剂瓶中，塞紧备用。 将盖勃乳脂计置于试管架上， 用吸管吸取１０ｍｌ碱试剂， 注人乳脂计内， 再用另一只牛奶吸管吸取摇匀的牛乳样品１０ｍｌ，注入碱试剂中，然后再加入异戊醇一乙醇混合液ｌｍｌ，用橡皮塞将乳脂计塞紧，将内容物小心混合（振荡）， 直至出现泡沫使牛乳凝块溶解为止。 江牛乳乳脂计放入７０～７３℃水浴锅内保持１０min，约５分钟振荡一次，水温勿降至７０℃一下。然后将乳脂计倒置，是橡皮塞向下，再置７０～７3℃水浴锅内保持ｌＯ～１５min（时间长短取决于泡沫消失程度），直脂肪柱不含泡沫时取出，读数，即为脂肪的百分率。 盖勃氏法(酸法) 所需材料 盖勃氏乳脂计、硫酸、异戊醇、刻度吸管、乳脂离心机
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分子垂钓技术要点与应用实例
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
就是这么简单！Octet和分子垂钓！ 分子垂钓是生命科学研究中的常用手段，简单来说就是从一个分子库里（比如某个细胞裂解液的粗样品）钓取可以与已知生物分子相结合的配体分子。一般先将这个已知分子偶联在固相上面，然后和细胞裂解液里的物质结合，最终将洗脱下样品交由质谱进行鉴定。 一个成功的垂钓实验会涉及到几个重要因素 1 将已知分子牢固地偶联到固相上，并保持其生物活性； 2 尽量减少混合样品和固相之间的非特异性结合； 3 确保洗脱的物质有足够的量来做质谱（浓度尽可能高，避免浓缩处理导致的损耗）； 4 对垂钓鉴定结果进行验证。应用经纯化的样品，再次通过分子互作技术进行表征鉴定。 目前最常用的垂钓方法是Pull-Down，但是其缺点是非特异性高，操作麻烦。现在基于生物层干涉技术（BLI）的Octet分子互作仪器以及传感器，针对这几个问题进行了积极的优化和改进，成为做分子垂钓的新方法。 今天陈老湿给大家介绍一篇文章，来自于意大利国家研究委员会下属的生物结构和生物成像研究所的。他们在研究中发现了针对某一肿瘤标志物的抗体，并成功应用BLI技术垂钓和鉴定出这个抗体的表位（抗体结合位点）【1】。 来自意大利科学家的BLI垂钓案例经典技术路线 Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME，黑色素瘤特异性抗原) 是重要的肿瘤标志物和**靶点。科学家通过研究，发现了针对这个抗原的高亲和力抗体。接下来的工作就是希望通过分子垂钓技术，对该抗体的识别表位开展鉴定工作。 下图是做表位垂钓和鉴定的技术路线 1 先用BLI鉴定抗体与抗原结合。用胺基偶联传感器固化抗体，通过与抗原进行结合解离得到的数据，确认该抗体与抗原的结合亲和力较高； 2 将抗原用胰蛋白酶消化成多肽，并用质谱开展鉴定。通过同蛋白序列的分析对比，发现这些多肽序列的覆盖率很高，从而确认抗原预处理是成功的； 3 应用Octet AR2G（胺基偶联传感器）固化抗体，抓取
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对医疗器械进行手动目视检查的挑战与解决方案（下）
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
如何借助数字化增强解决方案克服这一挑战（下） 使用数字化增强检查解决方案，克服这些挑战 尽管医疗器械的手动目视检查存在许多严峻的挑战，但我们可以采取另一种解决方案帮助客户解决这些困难，即借助Exalta设备建立的数字化增强检查解决方案。该解决方案可为质量经理和操作员带来以下优势。 通过进行数字化增强检查，可以减少由于长时间使用目镜进行手动检查而产生的疲劳和压力。这是由于数字化增强检查使用了配备有数码相机的显微镜以及监视显示器，还可使用具有分析功能的软件。 Exalta智能设备，配备S APO Greenough立体显微镜和FLEXACAM C1显微镜摄像头，用于追溯显微镜检查。 经理可以逐步确定数字化作业指导并迅速加以执行，从而使所有显微镜工作站都能按照作业指导进行检查，进而有助于确保检查工作按照既定标准规程进行。即使是在多名操作员检查同一部件或不同部件时，这也有可能实现，从而提高了缺陷检查的一致性。此外，该设备还为缺陷分析过程提供指导，包括缺陷识别、测量和计数，从而可对缺陷进行更准确的评估。基于以上优势，可以为客户大幅节约在新操作员培训方面投入的时间和精力。 同时，该设备使用易于显示的缺陷参考图像并进行叠加，以便快速进行比较。通过将检查结果与既定规格进行自动比较，有助于操作员快速做出通过/未通过决定，提高缺陷检查和评估的一致性。该数字化增强解决方案可实现检查数据的自动储存，例如从缺陷评估到数据自动传输至数据库。该功能有助于减少诸如记录检查结果和传输数据等手动任务，可提高检查结果的直接可追溯性以及报告的生成和批准。 数字化增强检查解决方案工作流程 总结及结论 对医疗器械进行手动目视检查效率低下，并且检查结果可能不一致。由于既定标准操作规程可能不会得到严格遵循，不同操作员得出的结果就会有所不同。此外，还存在许多耗时的手动步骤，例如记录检查结果和将数据传输至数据库。我们可借助Leica Microsystems制造的用于可追溯显
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实验室纯水系统维护很重要，定期“体检”是关键
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
实验室的工作人员面临的危险无处不在，一个不小心就可能会引发严重的实验室安全事故，往往带来的损失都不小。实验室安全工作必须遵循“安全第一、预防为主”的原则，防微杜渐。尤其是无情的水火，一般在仪器设备的使用过程中应多加注意，便可防患于未然。 这里，我们来谈谈实验室用水的安全小常识。 实验室用水安全，除了常规的用水输送管路外，另一个需要关注的对象就是实验室纯水机。用户对纯水机安装，性能安全系数给予的关注较多，但往往会忽略一点 —— 纯水机管路的老化问题！服务年限超过5年的纯水机，由于管路及一些塑料件的老化，更容易带来漏水风险。这些看似非核心的“小细节”，在纯水机系统里，占比还不少。一旦出现问题，会带来很严重的损失！ 例如： · 房屋损毁：房间墙面、屋顶大面积渗水、发霉，甚至变形脱落。 · 仪器设备故障：仪器设备进水损毁，也可能导致电源短路。 · 影响实验：正在进行的实验可能得不到实验结果，而且短期内可能无法正常开展实验。 现实工作中的很多麻烦，其实就是这种容易被忽略的小细节引起的。所以，实验室纯水机的供应商会建议用户定期给自己使用的纯水机做体检，尤其是查看纯水机内、外的管路和接头等配件。随着时间的推移，这些塑料材质的管接件逐渐老化，失去原有的韧性，出现裂纹裂缝在所难免，是漏水问题的元凶。 如何避免实验室纯水机漏水现象的发生？ 1. 水机定期维护。特别要关注使用超过5年以上的纯水机，其管路、接头应及时更换。 管路、接头老化导致漏水的原因： ① 纯水机进水管与水龙头连接，其内部一直承受水压，时间久了管路容易老化后出现裂痕； ② 放置在实验室的纯水机，环境中挥发的酸碱、氧化试剂也会加速进水管的老化； ③ 阳光照射也是加速水管老化的一个因素。 定期检查纯水机并及时更换老化的管接件，可以有效避免实验室水灾的发生。 乐枫为自己的水机提供专门的维护套件，需要的话可以随时联系客服人员（纯水热线：400-
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阳离子纳米脂质体介导基因转移的机理推测及实际应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
截至目前为止关于纳米脂质体-基因复合物被细胞摄取的机理及复合物在细胞内的转运过程尚未完全阐明。自1987年应用阳离子纳米脂质体转移基因取得成功以来已经过去了34年，有关于阳离子纳米脂质体介导基因转移的研究虽然取得了一系列的进展，但还未完全阐明，但其可能的机理是： 其可能的机理是： 首先，阳离子纳米脂质体与带负电的基因通过静电作用形成纳米脂质体-基因复合物，此复合物因阳离子纳米脂质体的过剩而带正电；带正电的纳米脂质体-DNA复合物由于静电作用吸附于带负电的细胞表面，然后通过与细胞膜融合或细胞的内吞作用进入靶细胞。在细胞内，阳离子纳米脂质体-基因复合物发生分离，基因进一步被转运到细胞核内，并在细胞核内转录和翻译，产生目的基因编码的蛋白质。 阳离子脂质体可用于介导许多组织细胞的基因转移，既可转染体外培养细胞，也可转染体内组织细胞。DC-Chol/DOPE脂质体和DMRIE/DOPE脂质体在美国和英国已用于基因**的临床试验。 目前阳离子纳米脂质体-DNA复合物的实际应用课题主要有肿瘤、神经系统疾病、肺部和呼吸道疾病、炎症等方面。 1、肿瘤方面的应用 阳离子纳米脂质体已用于介导肿瘤的基因**，动物实验或临床实验都取得了一定的效果。 2、肺部和呼吸道疾病中的应用 肺有一个很大的上皮表面，在阳离子纳米脂质体体内基因转移过程中，肺是目的基因表达水平较高的靶器官。气管内滴注或气雾剂给药可绕过内皮屏障，使基因与呼吸道上皮细胞直接接触，转移给靶细胞。以肺与呼吸道为目标的基因**逐步引起了人们的重视。 | 中文名称：DLin-MC3-DMA | 商品名：DLin-MC3-DMA | 化学名称：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯(6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraene-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate | 分子式：C43H79NO2 | 生产商/manufacturer艾伟拓（上海）医药科技有限公司/ AVT (Shanghai) Pharmaceutical Tech Co,. Ltd. | CAS号：1224606-06-7 | 用途：阳离子脂
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在细胞疗法CAR-T靶点同质化激烈竞争中突围的NK细胞免疫疗法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
6月22日，NMPA公示，复兴凯特CD19靶点自体CAR-T细胞**产品阿基仑赛注射液正式获批，这意味着我国迎来首款获批上市的CAR-T细胞**产品。 Insight数据库显示，目前有20多家企业布局“重押”CAR-T疗法，包括药明巨诺、科济制药、传奇生物、上海优卡迪生物、恒润达生生物、驯鹿医疗等，已进入临床阶段的项目36个，但CAR-T疗法布局的靶点主要聚焦在CD19、BCMA，CAR-T靶点同质化程度较为严重，如何在细胞疗法CAR-T靶点同质化激烈竞争的格局中突围呢？ 今天，我们就来聊聊CAR-T细胞疗法的“姊妹“—NK细胞免疫疗法。 NK细胞可非特异性直接杀伤肿瘤细胞，这种天然杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，也不需要抗原致敏，NK细胞还具有很强的免疫调节功能，与机体其他多种免疫细胞相互作用，调节机体的免疫状态和免疫功能。NK细胞疗法作为一种可行的**策略，逐渐成为仅次于T细胞疗法的免疫新星。 NK细胞的抗肿瘤途径 NK细胞与T细胞、B细胞不同，NK细胞不需要特异性的抗原致敏刺激就可识别并杀伤靶细胞。可通过多种途径抑制肿瘤细胞的生长和扩散： 1）在肿瘤微环境趋化因子和黏附因子的引导下，NK细胞募集到肿瘤发生的部位，促使肿瘤组织中NK细胞浸润程度增加，使得NK细胞表面活化受体识别肿瘤细胞表面相应配体，释放穿孔素、颗粒酶等杀伤介质，直接杀伤肿瘤细胞； 2）活化的NK细胞可表达死亡诱导配体-Fas配体（FASLG，又称 TNFSF6），可与肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）结合，诱导肿瘤细胞凋亡； 3）通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC），NK细胞通过细胞表面的FcγRIII（CD16）和肿瘤抗原特异性抗体Fc段结合，识别并杀伤肿瘤细胞； 4）NK细胞通过产生细胞因子（IFNγ、TNFα、IL1、IL10、GM-CSF等）和趋化因子（CCL3、CCL4）将其他免疫细胞募集到炎症部位，诱导其活化，并增殖产生固有和适应性免疫应答。 图1|NK 细胞
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MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
MDCK细胞属于动物细胞一般采用Cytodex 作为微载体Cytodex 主要有两个系列 即：Cytodex 和 Cytopore ，其中 Cytodex 1适合大多数的贴壁细胞。 采用Cytodex 微载体的优势主要有以下几点： 1. Cytodex 微载体的表面比较适宜细胞的粘附和延展。 2. 优化后的大小和密度对于细胞悬浮较为有利，适宜细胞的生长和高产。 3. 这类细胞的细胞基质具有一定的生物惰性，可以减少搅拌培养过程中的剪切力损害。 4. Cytodex 微载体具有较好的可放大性。试验证明，良好的培养环境下采用搏旅悬浮细胞培养生物反应器可达 15,000 L产量规模，而采用贴壁细胞微载体培养生物反应器可达 6,000 L 左右的规模。 MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法主要有以下几个步骤： 一、微载体的前处理： 用pH为7.4的PBS缓冲液将Cytodex系列微载体浸泡3~24H;反复清洗后用高压进行灭菌，冷却。并用含牛血清的培养基清洗后并加入同体积的培养基备用。2） 二、MDCK种子细胞的解冻复苏： 取出冻存中MDCK细胞，置于37℃-39℃的恒温水浴振荡器中进行解冻复苏，再植入细胞培养瓶中进行细胞培养。 三、细胞的转瓶扩培 当细胞培养瓶中的细胞生长到90%密度时用细胞消化液处理细胞，并接入摇瓶进行分瓶培养，当细胞生长到同样密度时，用培养基稀释接入生物反应器进行扩培。 四、生物反应器微载体培养： MDCK细胞接种可以依照 比例为2-25g微载体/L（培养基）、5-50个细胞/载体的比例接入生物反应器中进行扩大培养。具体详尽参数可以根据相关的《胞培养操作说明》进行设定调整。 五、病毒的感染接种： 当生物反应器内培养的MDCK细胞90%在微载体表面形成致密层后，应当停止搅拌，当微载体沉淀于生物反应器的地步是，更新培养基，按照TPCK胰酶1-20μg/ml、病毒感染复数0.01-1接种病毒培养2h后，补充培养基与原来的量相一致； 六、病毒收获 当病毒接种10H后，需要每小时取样观察细胞的病变效应及CPE值，当CPE值大达80%以上时，即可进行病毒收获、分析测定等操作环节，结合分
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化学发光免疫分析诊断技术（CLIA）的浅析及前景
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
化学发光免疫诊断技术的实质是利用免疫反应中的化学试剂和酶激发出可见光并由配套设备采集处理其反应过程中所释放的可见光，来进行免疫诊断测定的技术。 化学发光免疫分析技术由于其灵敏度较高，特异性较强，准确率高等特点在临床应用中广泛推广，作为酶联免疫的有效替代技术逐渐成为免疫分析领域的主流技术。市场占有率达61%以上。 化学发光免疫诊断技术（CLIA）主要分为两大类： 根据抗原与抗体包埋方法的不同可以分为微孔板式和微粒式两种。 1. 微孔板式技术是ELISA 酶联免疫与和化学发光免疫诊断技术间的一个过渡产品，这种技术由于检测灵敏度低，特异性较低、实验成本低廉，配套试剂成本低的特点在我国发光技术初期备广泛使用，直到现在许多生命科学实验室仍采用是微孔板式技术进行实验。 2.微粒式化学发光根据技术等级可以分为磁微粒式发光和非磁微粒式发光。 磁微粒化学发光是利用快速自动化的磁性分离技术的、高灵敏度的化学发光技术和特异性免疫分析技术相结合的电化学发光免疫诊断技术。微粒式化学发光是当今免疫诊断的主流技术。根据标记物的不同可以将化学发光分为直接化学发光、化学发光酶发光技术和电化学发光三种。 直接化学发光 直接化学发光是利用化学发光剂来标记抗体或抗原，加入特定的发光试剂的进行发光检测的一种免疫测定方法，这种发光体系相对简便、快捷，实验成本也较低。 间接化学发光 以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记来标定抗体/抗原加入氧化还原剂、化学发光增强剂等是化学试剂来进行免疫诊断的技术。 化学发光免疫诊断技术（CLIA）目前已基本取代酶联免疫诊断成为当代主流免疫诊断技术，检测范围包括肿瘤、传染病、甲状腺功能、肾功能、产育、产前筛查、内分泌激素等各个方面。微粒式化学发光（管式发光技术）则主要用于传染病、肿瘤、甲状腺功能检测、体内激素检测等，这些检测项目占测试总量的75-80%以上，占市场总额的60%左右。从临床检测量来看，肿瘤诊断和甲状腺
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几种基因敲除细胞株构建方法的介绍与比较
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
众所周知，CRISPR-Cas9作为一项基因编辑技术，目前已经是生命科学领域家喻户晓的技术了。但虽说这项技术非常火爆，仍有许多同学对基因编辑技术存在理解偏差，比如最常见的，在应用CRISPR-Cas9构建基因敲除（KO）细胞系，到底采用质粒法、病毒法还是有其他更好的方法呢？ 说到这个问题，就不得不提当初CRISPR-Cas9技术刚兴起时，所展现的切割效率和敲除成功率极大的吸引了科研界的关注，但是科研人员进行相关实验时经常会遇到：“一学就会，一做就废”的问题。他们发现，完全按照文献的方法进行基因敲除，成功率并没有想象的高，且还存在对细胞转染效率低的问题。因此有一些课题组就尝试通过慢病毒转染的方式进行敲除，提高转染效率的同时，将Cas9蛋白基因整合到基因组中，通过提高增加Cas9蛋白和sgRNA的作用时间来提高细胞敲除效率。 ★ 慢病毒法 ★ 但是，慢病毒感染存在着两个比较关键的问题： 1. 利用慢病毒法转染Cas9会在敲除靶基因的同时引入新的基因，而且慢病毒转染的外源基因是随机整合，存在影响其他基因表达的风险。 2. CRISPR-Cas9编辑过程存在脱靶效应，慢病毒法会持续表达Cas9蛋白，长期存在的Cas9蛋白会对这种脱靶效应有累积效应，最终影响实验的严谨性。 图1. 慢病毒感染进行基因敲除 ★ 质粒法 ★ 为了降低这种脱靶效应，采用的策略是减少Cas9蛋白与sgRNA复合物在细胞中的存留时间，因此我们还可以采用质粒法进行KO细胞的构建。即通过将Cas9和sgRNA表达载体瞬时转染到目的细胞中，从而在细胞内表达Cas9蛋白和gRNA，由于质粒整合到基因组的概率极低，随着细胞传代质粒载体的逐渐消失，再经过PCR验证和测序筛选出纯合的敲除细胞。但质粒法也存在一个较大的问题，即感染效率较低。 ★ RNP法 ★ 与质粒法不同的是，RNP法是通过电刺激转染的方法直接将Cas9蛋白和sgRNA复合物转染到细胞中。由于Cas9蛋白是不带电荷的，而sgRNA是带电荷的，因此只有当Cas9与sgRNA结合后，才能更高效的将两者转染到
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Hoxb8基因及拔毛癖简介与模式小鼠的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
“秃”如其来是不少人的烦恼。然而，令大部分人没想到的是，我们惜“发”如命，有人却薅头发上瘾。这其实是一种由遗传及心理因素共同作用下引起的疾病——拔毛癖。小鼠敲除Hoxb8基因变得过分的爱梳理自己,并形成毛发秃斑以及皮肤创伤。这种行为类似于患有拔毛癖的人类的行为。今天我们就一起来了解拔毛癖和研究其的Hoxb8基因编辑小鼠。 拔毛癖 拔毛癖最早由法国医生Hallopeau于1889年报道，是一种人为导致的外伤性脱发。我国的发病率不详，美国的发病率约１％。据估计，女性一生中发生拔毛癖的机率为0.6％～3.4%，而男性为0.6％～1.5%。 拔毛癖 (TTM) 的特征是从不同部位反复拔毛，导致明显的脱发。TTM 在 DSM-IV 中被归类为冲动控制障碍，但现在被归类到 DSM-5 的强迫症相关障碍部分。[2] 其中个体无法抵抗拔掉自己头发的冲动，已证实, 拔毛癖患者更容易罹患强迫症(OCD), 且可能同时患有进食障碍和躯体变形障碍。尽管尚未进行全面、大规模的流行病学研究，但据较小规模的研究估计，TTM 会影响 1-3.5% 的晚期青少年和年轻成人；不幸的是，年幼儿童的发病率仍然未知。在整个发育范围内，患者可能会出现医疗并发症，例如牵拉部位的皮肤刺激、感染和重复使用手部受伤。[3] Hoxb8基因编辑小鼠表型 家系研究提示拔毛癖具有家族遗传性，拔毛癖患者一级亲属的终生患病率可达5%。基因敲除的动物模型提示，HoxB8、SAPAP3及SliTrk5基因与模拟拔毛行为相关，但拔毛癖的致病基因或易感基因尚需深入研究。 Hoxb8基因是Antp homeobox家庭的成员，编码具有homeobox DNA 结合域的核蛋白。编码的蛋白质作为参与发育的序列特异性转录因子起作用。该基因的表达增加与结直肠癌有关。 Vol.1 Hoxb8基因敲除小鼠 1. 打靶策略 通过在2号外显子内插入loxP-Neo-loxP导致Hoxb8基因被破坏（Hoxb8-Neo)，从而丧失基因功能，也可通过Cre重组酶去除Neo盒，只残留loxP位点在基因座中(Hoxb8-lox)。[1] 图1. Hoxb8基因敲除小鼠打靶策略[1] 2. 表型 敲
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文献解读：脑瘫的复杂分子病因学研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
脑性瘫痪（脑瘫，CP）是由于控制肌肉运动的脑部区域（运动区）畸形或损伤而引起的一组症状。主要表现为中枢性运动障碍和姿势异常，还伴有智力障碍、癫痫、视力和听力问题、语言障碍等。全球有2000多万名脑瘫患者，给家庭和社会带来沉重负担。 脑瘫的病因有很多种，包括分娩期间缺氧、新生儿感染等。然而，三分之二的脑瘫患者是足月出生的，分娩期间缺氧仅能解释不到10%的脑瘫病例。近八成的病例还无法确定病因。近年来，越来越多的证据表明遗传因素与CP相关。不过，人们对脑瘫的遗传和分子机制知之甚少，这阻碍了脑瘫的预防、诊断和**。 对此，广州市妇女儿童医疗中心的研究团队历时五年，对120个特发性脑瘫家庭开展深入的临床和分子分析，鉴定出潜在的有害的遗传变异。这项研究成果于6月初发表在Brain杂志上。通讯作者为儿科研究所胡昊研究员和韩丁丁副研究员、康复科徐开寿主任，以及南通大学刘东教授。 国际权威神经病学期刊Brain创刊于1878年，是久负盛名的神经病学权威期刊，一个半世纪以来报道过很多神经病学发展的里程碑工作，在国际医学界和学术界有很高的声望。此次研究得到Brain主编和审稿人的高度评价，称赞其为“an impressive piece of work, with major scientific merits and important clinical implications”。 120个脑瘫家庭的遗传分析 研究人员总共招募了120个脑瘫家庭。大多数患者属于痉挛型脑瘫，其次是运动障碍和共济失调型脑瘫。他们通过多个平台对患者进行了全面的遗传评估，包括靶向PCR分析、线粒体基因组测序（6000X）、细胞遗传学芯片分析、全外显子组测序（600X）和全基因组测序（36X）（图1）。 图1. 脑瘫队列研究信息 他们发现，45%的脑瘫患者携带了相关的致病变异。其中，生殖系错义点变异（germline missense SNVs）最为常见，其他类型生殖系变异如插入缺失型变异（indels）、无义点变异（nonsense SNVs）和大片段拷贝数变异（CNVs）均有检出。研究首次发现脑瘫患者中
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