-
利用Simoa平台开发血浆p217+tau的高灵敏度检测方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
专题一: 利用Simoa平台开发血浆p217+tau的高灵敏度检测方法 Simoa单分子免疫阵列分析技术是目前市面上最灵敏的蛋白分子检测技术，其可以检测单个蛋白分子，灵敏度达到飞克级别。在肿瘤、神经、感染免疫、心血管、炎症、生殖、眼科等领域都有着广泛应用。Simoa平台是一个开放的研究平台，除现有的商品化试剂盒之外，各领域的研究人员都可自行进行方法开发及分析。 来自美国加利福尼亚和比利时比尔塞的科学家通过自行方法开发对p217+tau进行了研究，并将该检测方法应用于阿尔兹海默症（AD）的临床应用评价。 Development and validation of a high-sensitivity assay for measuring p217+tau in plasma Alzheimers Dement (Amst). 2021 May 27;13(1): e12204（IF=14.48） 淀粉样蛋白β（A）、微管相关蛋白tau蛋白（T）和神经退行性病变（N）为AD的临床诊断标志。本文利用Simoa平台开发了p217+tau的检测方法，对227名受试者的血浆p217+tau蛋白进行了定量检测，并对其做出临床应用评价。 结果显示：p217+tau血浆检测方法准确、精密、稀释线性好、灵敏度高。所有检测的样本浓度均在线性范围内，AD组的浓度高于健康对照组，血浆和脑脊液水平相关。血浆p217+tau结果可预测中枢T和A状态。 两步法与三步法检测的比较 对96例脑脊液（CSF）标本进行检测，两步法和三步法的检测结果紧密相关（r2 = 0.939）。对10个血清样本进行检测时，在两步分析法中至少有4个样本显示异常高信号，而三步分析法比较稳定。 样品稀释液的选择和优化 使用不同的样品稀释液，用三步法检测四个样品（3个AD患者的血清样品和标准品）的p217+tau浓度。结果可知，含HBR9的Tris稀释液可减少磁珠聚集和假阳性信号。 样本适用性 本研究检测了10名健康对照者和16名轻中度痴呆患者的血清和血浆样本。结果显示，轻度至中度痴呆患者的平均浓度明显高于健康对照组。然而，血浆样本中的p217+tau的浓度约为血清样本的2倍。 检测稳定性
-
益生菌L.casei Zhang减缓急性和慢性肾脏疾病的发病进程
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
文章标题：The probiotic L. casei Zhang slows the progression of acute and chronic kidney disease 发表期刊：Cell Metabolism 发表时间：2021年6月 影响因子：27.287 合作客户：华中科技大学同济医学院附属同济医院 百趣提供服务：短链脂肪酸靶标检测 200MRM靶标检测 1.研究背景 肠道菌群失衡会改变宿主代谢，并对各种肾脏疾病，尤其是慢性肾脏疾病（CKD）产生负面影响。益生菌广泛存在于人体胃肠道中，调节着器官的平衡，对维持健康的微生态环境起着重要作用，这些益生菌的代谢产物是肠道中SCFA的主要来源。 本文利用口服益生菌Lactobacillus casei Zhang (Lac.z)或L. acidophilus (Lact)处理小鼠，再进行肾缺血再灌注（I/R）处理。检测肾脏相关指标，利用GC-MS和UHPLC-MRM-MS/MS技术对肠道菌群代谢产物进行分析。结果表明，口服Lac.z可以改变SCFA和烟酰胺代谢，这些结果为慢性肾脏疾病提供了潜在的**方法。 2.研究结果 1. 口服L. casei Zhang减轻I/R损伤后AKI和随后发生的慢性肾纤维化 首先使小鼠进行口服益生菌（Lac.z或Lact）后进行I/R处理，5d后观察其肾脏的损伤程度。发现口服Lac.z小鼠肾脏损伤减弱，血清尿素氮（BUN）和肌酐、病理损伤等都降低。将观察期延长至28 d，发现口服Lac.z后肾间质中的胶原沉积较低。这些结果表明预防性服用益生菌Lac.z可以减少I/R后的急性肾损伤(AKI)发生及随后的慢性肾纤维化。 图1.益生菌预处理对I/R 处理小鼠肾脏的影响 2. L.casei Zhang预处理可改善I/R诱导的肠道菌群失调 通过粪便16S rRNA基因测序分析检测I/R诱导损伤后5d（作为AKI模型）和28d（作为CKD模型）的小鼠肠道菌群情况。发现Lac.z导致I/R后α多样性指数显著升高（图2A），Lac.z组与没有任何处理的sham组的β多样性更加接近（图2B），且Lac.z组保留了更高水平的拟杆菌群（图2C）。在I/R后28d，Lac.z组β多样性也与sham组相似（图2E），其它门水平菌群的变化趋势与I/R后5d小鼠的变化趋势一致（图2
-
非靶标代谢组学质控体系过程介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
近期，BIOTREE推出了发现代谢组学-MIX版，实现了非靶标代谢组学物质鉴定数量的大幅度提升，物质定性数量高达2000+。同时，物质鉴定数量的提升必须以可靠性为前提。BIOTREE非靶标代谢组学一直以严格的质控体系来保障数据质量，在这基础上联合全球顶-尖仪器公司进行了室间质评来验证数据的准确性。 质控体系 关键词：6D，综合性，严格 BIOTREE非靶标代谢组学提供从代谢物提取到代谢物检测分析一站式服务。为了不断提高实验数据质量，BIOTREE在非靶标代谢组学检测平台上创建了基于QC和IS两大核心的6D质控体系，可综合考量实验各个环节。 Quality Control样本：是将所有实验样本混合而成的一例额外样本。理论上来说该样本含有所有样本中的所有种类物质，因此该样本可以作为全部样本的“代表”，可以在不影响实验样本检测的情况下，通过对QC样本的检测，来判断整个实验检测是否稳定。Internal standard（内标）：是在实验样本中额外添加的一个或几个已知物质。在非靶标代谢组学中，由于并不知道会测到什么物质，因此需要在样本中添加一定的已知物，通过对该已知物检测结果的分析进而判断整个实验检测的稳定性。 过程质控 空白样本无明显内标检出由于空白样本仅是空的流动相其中并不含有IS或者被测代谢物，所以若是实验中有各种原因的残留，就会导致原本干净的空白样本中有IS被检测出。因此可以通过检测穿插在整个实验过程中的空白样本中是否有IS信号，从而及时判断实验中是否有残留现象。 当所有空白中所有IS均无明显峰被检出才认为该项目合格。 内标峰高差在30%内 每个电离模式BIOTREE会分别采用3种同位素内标，用以全面表征不同类型代谢物的检测状态。理论上来说由于QC样本是反复进样的重复样本，因此可以通过每个QC间IS的响应峰面积差异来判断检测是否稳定。当所有QC中所有IS的峰高差小于30%才认为该项目合格。 数据质控 2D PCA：QC样本聚集程度通常来说过程质控多用于在实验中及时发现问题，以及针对发现问
-
新型癌基因染色体外环状DNA及检测技术详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
自从2019年11月，国际学术期刊《Nature》和《Cell》相继发表了关于染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA)的重要研究，提出了这种游离于染色体基因组之外的DNA分子携带癌基因并具有转录活性，可能是某些癌症的一大帮凶，染色体外环状DNA顿时成为科研界尤其是生物医学界的关注焦点。今天我们就为大家详尽介绍染色体外环状DNA的功能及研究方法。 内容提纲： 一、什么是染色体外环状DNA 二、染色体外环状DNA在肿瘤中的功能作用 1.促进癌基因扩增 2.促进肿瘤异质性和耐药性 3.促进癌细胞基因重组 4.作为潜在分子标志物 三、云序生物提供的环状DNA研究服务 1.组织细胞环状DNA测序 2.血清血浆环状DNA测序 3.血清血浆环状DNA甲基化测序 4.环状DNAsanger测序 5.环状DNA纯化柱 一、什么是染色体外环状DNA？ 游离于染色体基因组之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被发现常常以环状的形式存在，这种形式的DNA被称为eccDNA (extrachromosomal circular DNA）。目前也习惯将巨大的环状DNA(>1Mb)称为ecDNA而将相对较小的环状DNA称为eccDNA。染色体外环状DNA最早是1965年在电子显微镜下被观察到，但由于技术手段的限制，对其研究难以深入，一直以来只是偶有报道，并且对它们的种类、分布以及功能没有全面的研究。随着技术的发展，Paul Mischel团队在2014年发现染色体外环状DNA携带致癌基因EGFRvIII并且影响肿瘤的耐药性，2017年发现染色体外环状DNA在肿瘤中普遍存在。而2019年Mischel团队和Scacheri团队相继在《Nature》和《Cell》上发表文章展示染色体外环状DNA上携带的致癌基因可以高度表达，《Nature Communication》也报道了染色体外环状DNA驱动神经母细胞瘤致癌基因重塑，接连发表的重磅文章使染色体外环状DNA顿时成为热门话题和科研焦点。现有研究表明，染色体外环状DNA广泛存在于各种物种、组织中，具有环状结构，可以滚环扩增，细胞有丝分裂时由于无着丝粒因而会不均匀地分配到子细胞中，这些特点我们在往期文
-
PCR实验室污染原因与解决方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
有实验室的地方，就不可避免的会出现实验室污染。实验室的污染，不仅会影响实验与科研的质量和效果,还对实验室工作人员的身体健康有损害，现在来一起了解下PCR实验室的污染原因及解决方法。 1、PCR实验室污染分类： 标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。 PCR扩增产物污染：这是PCR反应中主要-常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 还有一种容易忽视，可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。 实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。 2、 污染监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。 对照试验： 1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细
-
文献解读：用于mRNA递送的脂质纳米颗粒
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
分享一篇有关LNP-mRNA递送的文章，文章来源：www.nature.com/articles/s41578-021-00358-0 mRNA从开创性发现研究到现今为止已经过去了七十多年，mRNA分子的不稳定性和免疫原性已经被大大改善，同时在一系列的应用中都展现出了**潜力。为了达到**效果，mRNA分子必须达到特定的靶细胞，因此对于mRNA递送材料是有一定要求的。 用于mRNA传递的脂质的发展 脂质是一种两亲性分子，包含三个结构域：一个极性头基，一个疏水尾部区域和一个连接体。已被研究用于mRNA递送的脂质包括阳离子脂质、可电离脂质及其他一些类型的脂质。 用于mRNA传递的脂质的发展 阳离子脂质 阳离子脂质是被研究探索商业化较多的脂质，例如基于epc的脂质纳米颗粒已被应用于mRNA的肿瘤免疫**；基于DOTAP的阳离子纳米乳剂可以递送抗病毒、细菌和寄生虫感染药物；DOTAP-聚合物混合纳米颗粒可以传递mRNA分子用于**肿瘤疾病，传染病和遗传疾病。另外在DOTAP脂质纳米颗粒中加入碳酸盐脂灰石，通过将纤维连接蛋白结合到脂质纳米颗粒上，可以进一步提高传递效率，这种细胞粘附蛋白的方式可以加速细胞内吞速率。 LNP-mRNA疫苗抗感染和癌症的代表性临床试验 LNP-mRNA**感染、癌症和遗传性疾病的代表性临床试验 可电离脂质 另一种应用较多的脂质是可电离脂质。在低pH值下会被质子化，这使它们带正电荷，但它们在生理pH值上保持中性。可电离脂质的pH值敏感性有利于体内mRNA的传递，因为中性脂质与血细胞阴离子膜的相互作用较少，从而提高了脂质纳米颗粒的生物相容性，携带正电荷利于纳米颗粒从内体中逃逸。 其他脂质 除了阳离子或可电离的脂质外，LNP-mRNA配方还包含其他脂质成分，如磷脂（如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺）、胆固醇或聚乙二醇(PEG)功能化的脂质(PEG-脂质)。这些脂质可以提高纳米颗粒的性质，如颗粒的稳定性、传递效率、耐受性和生物分布。 用于mRNA传递的脂质和脂质衍生物的化学结构 需要克服的内部问题 LNP-mRNA配方需
-
新冠病毒在体内的传播机制和疫苗最新进展
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
冠状病毒，其表面有突出的棒状尖峰，在电镜下可以观察到像王冠一样的放射状凸起而得名。冠状病毒的基本结构如图 1 所示，包括刺突糖蛋白 (S)、包膜 (E)、膜 (M) 和核衣壳 (N)。 图 1. 冠状病毒结构 2020 年石正丽教授在 Nature 发表的论文 A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin 就揭示了 2019-nCoV 与 SARS-CoV 两个冠状病毒的相似性。文中表明，2019-nCoV 与 SARS-CoV 基因组同源性高达 79.5%。 国际委员会冠状病毒科研究组 (CSG) 认为2019-nCoV与 SARS-CoV 形成了姐妹分支， 后将其命名为 SARS-CoV-2。 Delta 毒株突变 Delta 毒株目前是全球流行的主要新冠病毒变异株。SARS-CoV-2 表面布满凸起的 S 蛋白可分为三部分，顶部的受体结合域 (RBD)、S1 亚基和 S2 亚基。S1 亚基与 RBD 相连，负责与宿主细胞膜上的受体 ACE2 结合，S2 亚基帮助 S 蛋白与受体的结合。Delta 变种仅在 RBD 中就发生 3 处突变：L452R、P681R 和 T478K 突变，这使 S 蛋白与细胞膜上 ACE 受体的结合能力明显提高。 Lambda 毒株突变 除了德尔塔，拉姆达也开始“发力”了，据全球共享流感数据倡议组织 (GISAID) 的数据显示，美国有 1000+ 例由“拉姆达”毒株引起的新冠肺炎病例。Lambda 变异株是 S 蛋白上发生了 6 个单氨基酸突变 (G75V、T76I、L452Q、F490S、D614G 和 T859N)，N 端结构域 (NTD) 存在一段由连续的 7 个氨基酸缺失形成的突变 (RSYLTPGD246-253N)。F490S 突变缺失会帮助病毒获得体液免疫抗性，L452Q 突变会对疫苗诱导血清中和抗体产生抗性。 新冠病毒是怎样在宿主中肆意横行的呢？简单点说，就是入侵 (病毒受体结合) → 进攻 (释放自己基因组) → 发扬壮大 (不断合成并排除异己) → 再进攻。 图 2. 新冠病毒在体内的传播机制[2] ■ 病毒入侵 如果说 S 蛋白是新冠病毒打开宿主细胞“城门”的钥匙，那么 ACE2 受体就是那把锁。S 蛋白一旦
-
实验室细胞培养常见解答
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
千盼万盼，终于收到了实验需要的细胞 细胞到货后应该如何处理呢？ 跟着本期问答来寻找答案吧~ Q 刚收到细胞未开封，疑似污染，应当如何处理？ 收到细胞后，请先观察外观是否存在漏液、破损等情况，并拍照（40X、100X、200X）。发现任何问题，都请及时联系我们的销售，并提供您细胞不同倍数的照片。如询问后确定无明显污染，请取出10ml培养基空培养，细胞按照说明书正常操作处理即可。 Q 刚收到细胞，显微镜观察细胞成片漂浮，该如何处理？ 除293系列、LNCAP、SH-SY5Y、MSTO-211H、INS-1、HT-22这些易漂浮的细胞外，大部分细胞在温度低时细胞回缩变圆，漂浮的可能性也会增大。建议延长稳定时间，约4小时后观察。若细胞仍不贴壁，取出所有灌装培养基，离心收集细胞，去上清将细胞弹散，在离心管中加入1ml胰酶轻轻混匀，将离心管平放（注意胰酶细胞悬液不要沾到瓶盖以免损失细胞），消化约3分钟后加入2~3ml终止液，1000rmp，5min离心，去上清将管底细胞团尽量弹散，加入完全培养基重悬（轻轻吹吸1~2次），均匀转入2个T25瓶中，摇匀后放入培养箱中培养。 Q 贴壁细胞传代2~3次后增殖变慢，有黑点，如何操作？ 可能是消化过度导致了部分细胞的细胞膜受损、凋亡，部分细胞膜受到破坏，导致细胞生长缓慢。若细胞形态有明显变化，且细胞表面有明显黑点，间隙间也有较多黑点，可能是支原体污染，建议空培养细胞培养基，观察黑点是否会增殖。 若还有保种细胞，请复苏靠前代次，并注意观察拍照，有任何问题可以及时联系我司销售处理售后（需提供细胞图片）。 Q 收到冻管复苏24小时，细胞不增殖，该如何处理？ 冻管到货时的剩余干冰情况、收货后的保存情况、使用的血清、培养基以及复苏操作不当等原因都可能影响细胞复苏情况。 贴壁细胞： 若复苏时离心，建议48h后换液，如密度达到10%，则继续按说明书正常操作培养；若复苏时没有离心，建议收集悬浮细胞后重新接种。若细胞依然无贴壁增殖，请及时反馈销售处。
-
FXR激活可降低脂质吸收从而预防NAFLD
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
由肝脏脂质代谢失调导致的非酒精性脂肪肝（NAFLD）已成为全球最常见的肝病。目前，NALFD/NASH患者的**方案非常有限，不过核受体法尼醇X受体 (FXR) 激动剂已显示出较好的应用前景。已有研究表明，FXR激活与肝脏和血浆甘油三酯（TAG）水平降低、炎症减轻、胰岛素敏感性增加等多种临床变化相关。美国加州大学Thomas Q.de Aguiar Vallim研究小组发现，FXR激活可通过胆汁酸依赖的方式降低脂质吸收从而预防NAFLD。相关成果发表于《Cell Metabolism》。 FXR激活剂选择性地降低人和小鼠中MUFAs和PUFAs水平 为研究FXR激活如何改变肝脏TAG水平，将11名等待胆结石手术的患者随机分组，并用安慰剂（n = 6）或FXR激动剂OCA（n = 5）**3周，收集肝脏活检组织。FXR靶基因BSEP诱导和胆汁酸合成酶CYP7A1降低证实 OCA组患者肝脏FXR激活。对肝脏组织进行脂质组分析，显示FXR激活特异性地降低了肝脏中TAG，但不影响其他脂类。TAG种类具体分析表明，OCA处理造成大部分TAG种类水平降低，主要是含有一个双键脂肪酸的TAG（MUFA），以及含有不同程度的两个或多个双键 (PUFA)的TAG。 为探究FXR介导肝脏TAG降低的机制，采用合成的、水溶性的、特定FXR激动剂GSK2324处理野生型和Fxr-/-小鼠。与Fxr-/-小鼠相比，野生型小鼠FXR靶基因Shp和MafG表达显著增加。与临床结果一致，FXR激活显著降低了野生型小鼠肝脏TAG水平，并且主要降低含有MUFA和PUFA 的TAG水平。这些结果表明 FXR 激活选择性地改变了特定的脂质种类，主要是含有一个或多个双键脂肪酸的TAG。 图1 FXR激动剂选择性降低人和小鼠肝脏中MUFA和PUFA的TAG GSK2324选择性降低脂肪酸和甘油三酯合成基因的表达 为确定参与TAG或脂肪酸合成的基因是否受到FXR激活的调节，对野生型和Fxr-/-小鼠中参与肝脏脂肪从头生成途径中编码24种酶基因的mRNA进行检测，结果显示编码饱和脂肪酸合成或脂肪酸延伸的酶相关mRNAs在FXR激活后没有显著减少，而Fasn mRNA水平增加，与早期研究一致，Fasn是FXR
-
食用油炸肉类或会增加肠道内毒素和机体炎症水平
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
研究背景 油炸是将食物置于较高温度的食用油中，使其加热并快速熟化的过程。但由于在油炸高温过程中容易发生美拉德反应，易于生成晚期糖基化终末产物（AGEs），并产生杂环胺类化合物等致癌物。因此，油炸食品的摄入与机体健康之间的关联越来越受到学界关注，这其中包括大量有关油炸食品与2型糖尿病风险的研究。油炸相关混杂因素如油炸过程中其他营养素和有害物质的产生，如果这些混杂因素得到严格控制，那么油炸食物的摄入是否以及如何影响2型糖尿病的发展，目前尚不清楚。有报道表明，较高的油炸肉摄入量与人类肠道菌群的多样性较低相关，且会影响肠道菌群的组成和扰动。 近期，哈尔滨医科大学营养与食品卫生学专业的孙长颢和李颖研究团队在《Diabetes Care》上发表一项随机对照实验，117 名超重成年人随机分为两组：食用4次/周炸肉组（n=59）和限制食用炸肉组（对照组，n=58），干预4周，保持食物组成和营养成分在两组之间一致。膳食干预过程中，经专业培训的工作人员依据膳食指南，向受试者们提供了满足其膳食推荐摄入量的食物，并详细记录每餐实际摄入量。通过严格控制油炸烹饪过程的时间和油温，受试者尿液中杂环胺类化合物的水平显著降低，食用炸肉组与对照组的含量间无统计学差异，并且均显著低于国家标准的限制生成量。 口服葡萄糖耐量试验中葡萄糖和胰岛素测试结果显示，与对照组相比，食用炸肉组的胰岛素生成指数(IGI)降低，胰岛素和脂多糖（LPS）的肌肉胰岛素抵抗指数(MIRI)、胰岛素曲线下面积、炎症因子TNF-α、IL-10和IL-1β水平均升高。 同时，16S rRNA测序分析结果显示，食用炸肉组菌群多样性降低，两组厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)比值均呈下降趋势，且食用炸肉组的比值显著高于对照组。KEGG功能注释分析显示，两组间LPS生物合成蛋白、胰岛素抵抗、脂肪细胞因子和AMPK等信号通路存在显著差异。经过单因素及多因素分析得到5个差异显著的菌属：毛螺菌属和Flavonifractor丰度降低，Di
-
在免疫系统人源化小鼠中探究过继性NK细胞疗法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
过继性细胞疗法是一种非常有前景的免疫**手段。与T细胞疗法相比，过继性NK疗法具有许多独特的优点，包括更高的安全性、多种激活机制、同种异体细胞的使用等。尽管具有巨大的**潜力，也存在有效的体外扩增方法[1]，但这些体外扩增出来的NK细胞在体内环境中的生存和增殖仍有待研究。上次我们讲了在荷瘤的重度免疫缺陷小鼠中移植人脐带血来源的NK细胞进行**（回顾请戳这里），这次，我们来看看过继性NK疗法在免疫系统人源化小鼠中的表现。 Fatemeh等人将人脐带血来源的NK细胞（cord blood-derived NK, CB-NK）进行体外扩增。同时，他们使用同一供体CB来源的CD34+造血干细胞移植到NRG小鼠中，构建自体（autologous）免疫系统人源化小鼠。他们发现体外扩增后的人NK细胞能在这种人源化小鼠中存活增殖，但在没有人源免疫细胞的对照组NRG小鼠中则不行。这些数据说明体外扩增的人NK 细胞在体内的存活需要人自体免疫细胞的存在。该研究结果发表在了Scientific Reports上[2]。 构建免疫系统人源化小鼠 NOD-Rag1-/-IL2rg-/-（NRG）小鼠由于缺失有功效的T、B、NK细胞，且其Sirpa能与人CD47分子结合，因此对人源异种移植物高度兼容。Fatemeh等人将与CB-NK同一供体来源的CB-CD34+造血干细胞移植入辐照后的新生NRG小鼠肝脏中，构建自体（autologous）免疫系统人源化小鼠。移植后第12周检测人源化NRG小鼠外周血和脾脏中的人免疫细胞比例（图1）。统计结果表明，人源化NRG小鼠具有较高水平的人源免疫细胞，重建效果好（表1）。 图1. 人源化NRG小鼠的构建与检测（图来源于Ref.2的Supplementary Information) 表1. 移植后第12周人源化NRG小鼠体内人源免疫细胞重建比例。（表格来源于Ref.2) 体外扩增NK细胞 研究者们将同一供体来源的CB-NK细胞进行体外扩增，加入外源性IL-2进行处理，同时使用基因修饰后表达膜结合IL-21的K562人髓性白血病细胞（K562-mb-IL-21）作为饲养细胞。当人源化NRG小鼠构建成功后，将这些体外扩增
-
IL-10基因敲除小鼠与结肠炎的介绍与研究应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是与结肠炎密切相关的IL-10基因。 IL-10基因简介 白介素10（IL-10）又被称为细胞因子合成抑制因子（CSIF)，由CD4+ Th2亚群产生，并抑制Thl克隆产生的细胞因子。IL-10可以抑制巨噬细胞分泌细胞因子，除CSIF活性外，IL-10还表现出多效性，作用于不同类型的细胞，包括胸腺细胞、细胞毒性T细胞、肥大细胞、B细胞和巨噬细胞。该基因位于人类的1号染色体上，共有7个外显子，氨基酸数量为178个（表1）。 表1. IL-10的基本信息 备注：标有√的意为赛业红鼠资源库有该种保存状态的小鼠 IL-10与结肠炎（Colitis） 结肠炎（Colitis）是指各种原因引起的结肠炎症性病变。可由细菌、真菌、病毒、寄生虫、原虫等生物引起。根据病因不同，可分为感染性结肠炎、缺血性结肠炎和伪膜性结肠炎、溃疡性结肠炎（UC）及结肠Crohn病。其中UC在结肠炎中备受关注。肠粘膜局部免疫反应的异常是造成UC炎症和组织损伤重要的内在因素，NF-kB炎症通路及细胞因子在介导异常的免疫反应中有着重要作用。IL-10基因敲除小鼠出现了自发性肠炎，其肠黏膜炎性区和非炎性区IL-10的表达均明显增加[1]。 有研究自2013年至2018年间的征集了27名志愿者，分别为17名UC患者和10名未患UC者。与对照组相比，UC患者发炎的直肠粘膜中IL-10表达有增加的趋势。在横结肠发炎患者及肠远端UC病变且横结肠未发炎的患者中，横结肠活检与直肠活检IL-10的表达没有显著差异。然而，横结肠发炎患者IL-10的表达水平高于对照组和肠远端UC病变且横结肠未发炎的患者[2]（图1）。 图1. 结肠IL-10表达模式（A)对照组和UC患者直肠IL-10表达的比较（B)对照
-
构建基因敲入细胞系的原理和需要注意的细节
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
CRISPR-Cas9基因敲入（KI, Knock in）是指将外源性基因通过同源重组（HDR）的方式插入到基因组中，使其在细胞内稳定表达的一种基因编辑技术。KI的外源基因可以是具有蛋白表达功能的编码基因，可以是参与基因调控的DNA元件，也可以是一段没有功能的DNA序列等。 基因敲入技术在基因功能研究和疾病**等众多方面发挥着重要的作用，但是在实际的操作过程中，想获得一个纯合的KI细胞系并不是一件容易的事。因为KI细胞系构建是否成功是受到多方面因素影响的，如敲入基因片段的长短、同源重组效率、细胞系类型等均能影响编辑效率，所以这也使得KI的技术难度很高。今天让我们了解一下构建KI细胞系的原理和需要注意的细节。 CRISPR-Cas9基因敲入原理 在sgRNA引导下，Cas9内切酶定点切割DNA双链而产生DNA缺口，然后生物体启动同源重组修复途径，当存在一段高度同源的DNA模板（Donor DNA）时，会以Donor DNA为模板进行修复，从而达到将目的片段定点引入基因组的目的（图1）。 图1. CRISPR-Cas9基因敲入原理 在这个过程中，Cas9的切割效率、细胞双链DNA断裂后以同源重组方式进行修复的概率、以Donor模板重组的概率一同影响最终的基因编辑效率。这也是阳性克隆获得率低的原因。 构建KI细胞系需要注意的细节 KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版，然后通过核糖核蛋白法（Ribonucleoprotein, RNP）或质粒法等方法将sgRNA、Cas9蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例，将合成的sgRNA、纯化后的Cas9蛋白和Donor模板电转进目标细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过程中，sgRNA的设计、Donor模板的设计等均会影响最终的编辑结果，下面我们总结了会影响基因编辑效率的部分原因： 1. sgRNA的设计 sgRNA-Cas9在KI基因编辑系统中如“剪刀”一般精准切开双链DNA，这把“剪刀”锋利与否和精确度能直接影响KI基因编辑系统的编辑效率。而sgRNA的设计就是重要的一步，它能影响目的片段能否精准插入和
-
细胞培养过程中的常见问题及解决方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
细胞培养是生命科学实验中的基础实验，在细胞生长过程中，很多因素都会造成细胞生长不良。下面简单归纳一下细胞生长不良的原因及对应的解决方案。 常见问题一：为什么细胞解冻后缺少活力，活细胞占比较低？ 这种现象可能主要由以下几种原因所导致： 1.培养物冻存液等质量欠缺。 解决方案： a.确保用来制备储存物（冻存液）的起始培养物需要保证其健康、无微生物污染、处于生长对数期后期状态。 b.收获细胞时需要小心翼翼，避免细胞损伤。 2.储存物冻存方法不当 解决方案： a.在液氮冷冻细胞时，确保细胞、培养基和其他试剂的浓度，以及冻存实验步骤依照供应商的建议。一般来说，冻存应该缓慢，大约1-3° C/min以减少冰晶形成。 b.使用电子可编程或机械冷冻装置以确保一致的、适当速率的冷冻。 c.选择最合适的细胞冷冻保护剂。如果使用甘油，不要将其存储在光照下，因为曝光会使甘油转化为有对细胞毒性的丙烯醛。 3.储存物保存不当 解决方案： a.储存物应时刻保持在-130℃，理想情况是置于液氮中，以确保较大的细胞活性。 b.如果将细胞直接浸入液氮中，容易造成液氮泄露到冻存管内，解冻时会有冻存管爆炸的风险。所以一般储存在液氮上方的气相环境中。 4.细胞解冻方法不当 解决方案： a.一般来说，细胞应该快速解冻、使用预热的培养基、尽快移除含有冷冻保护剂的培养基防止细胞活力下降。 b.确保小心操作细胞。不要涡旋或高速离心，因为低温保存后的特别容易受到损伤。 常见问题二：细胞进行解冻或传代后细胞的附着力偏低? 这种情况主要是因为湿度过低致使培养容器上集聚静电所致。 可以通过适当增加房间湿度，使用防静电装置或者用消毒过的湿毛巾擦拭培养容器外侧，来减低静电产生。另外试剂混合不均匀，培养瓶转速等因素也可导致此现象发生。所以在进行细胞培养时，要确保细胞和所有试剂的溶液混合充分。在使用振荡培养箱进行细胞培养时，注意设置适宜的转速。 常见问题三：为什么细胞生长速度
-
CHO细胞培养中乳酸产物的产生机理及影响
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
CHO细胞培养广泛应用于细胞工程，基因制药等领域。主要用于基因改造、重组蛋白等规模化放大生产工艺中。 在细胞培养过程中，有些产物对细胞有一定的毒害作用。比如：常见的副产物乳酸以及NH4+这两种物质，是CHO 细胞培养过程中常见的有害产物。只有掌握其产生机理才能在细胞培养过程中避免或减少这些物质的产生。 细胞生长过程中乳酸的产生机理 CHO细胞生长过程中的产生的乳酸主要有两种即：D-CH3和 L-CH3。在CHO细胞的对数生长期， 随着细胞的快速增殖，CHO细胞产物也会不断地积累，其中CH3和 NH4+ 会有明显的变化。乳酸产物的多少与丙酮酸浓度、乳酸代谢速度以及NADH/NAD+的含量所决定。 从乳酸生成的角度来看，丙酮酸是产生乳酸的主要来源。那么丙酮酸又是怎么来的呢？ CHO细胞培养过程中，丙酮酸的主要来源有三个： 1. 来源于培养基中。CHO培养基中的营养成分可以达到50-100种，其中丙酮酸成分虽然可以 作为细胞培养中的替代碳源，但容易形成L-CH3。所对于CHO培养一般不建议使用含丙酮酸钠的培养基。 2. 来源于糖酵解。培养基中的葡萄糖经过糖酵解过程形成丙酮酸再通过NADH/NAD+途径代谢产生L-型乳酸，这样高浓度乳酸不利于CHO 细胞的生长。所以，部分培养基生产商使用半乳糖来替葡萄糖或者通过限制葡萄糖 浓度 或补充其他碳水化合物来控制乳酸的形成。 3. 来源于丙氨酸等营养成分。丙氨酸在脱氨基的作用 也会生成丙酮酸和NH4+等产物。这些成分也会参与进一步的酶化反应产生乳酸，并伴随细胞的生长而累积。 丙酮酸的代谢途径 CHO细胞培养过程中丙酮酸进入TCA循环的量 一般很少，多数会通过NADH/NAD+的方式进入丙酮酸--乳酸--丙酮酸的循环。当乳酸产物浓度增高就造成乳酸累积，今儿影响到CHO 细胞的生长状态。 更多技术相关资料请访问http://www.bioalpha2008.com/获取解答。
咨询热线
18133906270
德尔塔官方微信