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MeCP2基因敲除小鼠助力神经系统发育障碍疾病的研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是神经系统发育障碍疾病致病基因之一MeCP2。 1 基因基本信息 2 MeCP2基因研究概况 MeCP2对哺乳动物的学习记忆能力有着重要的影响，同时也是Rett综合症和MeCP2重复综合症的致病基因。MeCP2通过多种机制对基因的转录有显著影响，而且有明确表型的学习和记忆动物模型，使MeCP2成为学习和记忆中基因转录研究的理想对象。MECP基因主要发挥的就是转录调节功能。在人类和小鼠中，该基因位于X染色体上，最终编码一个500左右氨基酸残基的蛋白质。该蛋白与DNA甲基化的位点结合，解除转录抑制。Rett综合症是由MeCP2发生突变导致其失活所致，属于X染色体隐性疾病；而MeCP2重复则是由MeCP2的过表达所致，属于X染色体显性疾病。 MeCP2同时具备转录抑制和转录激活两种功能。一方面MeCP2结合甲基化位点后会与mSin3A/HDAC共抑制因子结合，进一步稳定甲基化结构，从而对基因的转录产生抑制作用；另一方面，该蛋白磷酸化后也会招募CREB等转录激活蛋白促进基因的转录。 图1. MeCP2功能的分子机理。 信息来源：10.1101/lm.048876.118. MeCP2基因位于X染色体上，其左右相邻的基因分别为RCP和IRAK基因。在人类和大小鼠中，对该基因功能有显著影响的是第1-4号外显子和其中的3个内含子。MeCP2蛋白主要由5个部分组成，首先是位于两端的末端序列NTD（N-terminal Domain）和CTD（C-terminal Domain）；中间则依次是是甲基化位点结合结构域，中间区域（interdomian）和转录抑制结构域。该蛋白理论上为53kd大小，不过由于其在翻译后经历过一系列的修饰作用，其分子量在免疫印迹中大多为75kd。MeCP2在大多数组
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细胞培养中常见的生物污染及解决方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
细胞培养中常见的生物污染包括细菌污染、霉菌污染、支原体污染、黑点污染、真菌污染和原生动物污染。这些污染在细胞培养中的特点及相应的解决办法如下： 1.细菌污染 细菌在普通倒置显微镜下呈黑色和细砂状。根据感染菌的种类不同，可能会呈现不同的形状，培养液一般会变得浑浊、黄色，对细胞生长有明显影响。 解决方法：仔细检查器具的灭菌情况，确保通风时间和高压灭菌器的压力是否足够。最重要的是，与培养基接触的移液管等物品如果被污染两次，则可能会导致储存溶液也受到污染。所以一定要注意！下次使用前要检查培养基的浑浊度。此外，建议在培养基中添加抗生素。 2.霉菌污染 正常情况下，培养基在 37℃ 培养箱中培养两三天，在倒置显微镜下仍保持透明，无杂质。一旦出现絮状杂质，显微镜下可见丝状和团块状漂浮物，菌丝明显。此时，虽然细胞仍在生长，但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。 解决方法：用硫酸铜溶液擦拭 CO2 培养箱，向托盘中加入饱和硫酸铜或消毒后加入饱和磷酸氢二钠高盐溶液，避免霉菌污染。 如果霉菌污染，暂时转移所有细胞，并立即彻底使用 guo 氧乙酸溶液擦拭培养箱，包括层板和内壁。将 guo 氧乙酸放在培养箱中一小时，使蒸汽扩散，待 guo 氧乙酸气味消散后，将细胞转移到培养箱中。值得注意的是，培养箱需要每两个月定期清洗一次，尤其是在梅雨季节。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精连续擦拭培养箱，用紫外线照射也是一种有效的方法。 为防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 两性霉素、霉素抑制素、fang 线菌素 D 或青霉素链霉素。一旦被污染，就不可能恢复，即使使用上述抗生素，也没有什么区别。对于支原体污染的细胞培养，**选择是丢弃污染的培养物，并用使用新鲜的无支原体的储存液，彻底消毒环境。如果所有的细胞都被污染了，那可能是整个培养系统污染了。因此，必须对培养基和实验设备进行检查。如果只是个别污染，可能是操作问题，有必要注意实验操作步骤的规范。 3
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工业应用中倒置显微镜相较于正置显微镜的五大优势
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
使用倒置显微镜时，您需要从下方观察样本，因为倒置显微镜的光学元件位于样本下方，而使用正置显微镜时，您需要从上方观察样本。一直以来，倒置显微镜主要用于生命科学研究，因为重力将样本沉入含有水性溶液的托座底部，从上方则无法观察到太多内容。但近段时间以来，倒置显微镜在工业应用中也变得越来越流行。我们现在一起来了解倒置显微镜在工业应用中的优势。 1) 与正置显微镜相比，倒置显微镜让您获得更大的自由 对于正置显微镜，样本的尺寸限制为80 mm的平均高度和3 kg的重量，这也取决于所使用的物镜。而这一限制并不适用于倒置显微镜。由于光学元件都安装在载物台下方，所以样本放在物镜上方。这意味着使用者获得了更佳的工作距离，可以处理重达30 kg的大型厚重样本。所以如果要处理较大且较重的样本，或者使用的样本在尺寸和重量方面存在着很大的差异变化，则倒置显微镜能够提供您所需的自由。 图1: 倒置显微镜的光通道 图2：含有大样本的倒置显微镜 2) 倒置显微镜能够让您在更短时间内观察更多的样本 使用倒置显微镜时，您只需要将样本摆放于载物台上，对焦表面进行成像即可。样本在所有放大倍数下都能保持对焦而且同类型的样本都能进一步保持同样的对焦。 使用正置显微镜时，其工作流程包含更多需要操作员完成的任务：您需要降低载物台，将其移出，取下样品架并安装新的样品架，将样本摆放到位并实施保护，再使用样本压块将样本表面调平，之后才能转换至更低的放大倍数进行定位。操作员需要练习全部这些步骤，但不同的步骤在每次操作当中依然存在着失败的风险。 对于未经培训的操作员来说，样本的放置可能是一项艰巨的任务；而使用倒置显微镜时，将样品放在载物台上可谓‘小菜一碟’，整个操作所需的步骤也更少。 还有一点：正置显微镜的所有步骤加起来会非常耗时，尤其是当您需要对样本逐一进行观察而且样本量较大时。假设经验丰富的使用者在操作正置显微镜。即便每个步骤只需要5秒的时间，
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免疫系统人源化小鼠的分类及其在抗HIV细胞免疫疗法中的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
BRGSF小鼠背景回顾 BRGSF（BALB/c Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Cgn SirpαNOD Flk2tm1lrl）小鼠是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一：Rag2和Il2rg基因的敲除使BRGSF小鼠T、B、NK细胞缺失；SirpαNOD抑制了小鼠巨噬细胞对人源细胞的吞噬作用；Flk2基因的敲除使小鼠髓系细胞组分（特别是树突状细胞，DC）大幅减少（图1）。这种免疫系统上的高度缺陷使BRGSF小鼠对各类人源移植物高度兼容，同时也是构建免疫系统人源化小鼠的优秀模型。 因此，通过在BRGSF小鼠身上进行人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）移植，我们可以得到以人源T细胞重建为主的PBMC免疫系统人源化小鼠。这种小鼠可用于需要成熟T细胞的短期研究，例如HIV/AIDS相关研究。 图1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠。 免疫系统人源化小鼠 人源化小鼠是指携带功能性人类基因、细胞、组织、器官或免疫系统，甚至是微生物的小鼠，可用于生物医学研究和临床**方案的开发。其中，免疫系统人源化小鼠，也称为人免疫系统重建小鼠，是指通过将人的造血干细胞、免疫细胞或组织移植到免疫缺陷小鼠体内，使其能重建人类免疫系统的小鼠模型。这类小鼠可以更有效地模拟人体免疫系统的反应，为人类肿瘤免疫、自身免疫性疾病，以及人特异性传染疾病（例如由人类免疫缺陷病毒HIV引起的获得性免疫缺陷综合征AIDS）的转化研究提供优秀模型。 不同类型免疫系统人源化小鼠的对比 根据重建方法，免疫系统人源化小鼠可大致被分为以下三类。 1 Hu-PBL小鼠，也称为Hu-PBMC小鼠 构建方法：经尾静脉（i.v.）、腹腔（i.p.）或脾内（intrasplenic）注射人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）到成年免疫缺陷小鼠体内。 人源免疫系统重建时间：约2周。 优点： ①操作简单，成本低； ②T细胞移植效率高。 缺点： ①重建以人源T细胞为主，B细胞和髓系细胞数量较低（可能是因为缺乏与它们生存相关的人源细胞因子）； ②产生致死
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1,3-βDglucosidase ELISA试剂盒使用说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
1,3-βDglucosidase ELISA试剂盒说明书 本产品是即用型PCR试剂盒的改良产品， 含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等所有PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行PCR 反应，具有广泛的用途。 1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR 实验。 2. 快捷，操作步骤已经限度地简化，能减少污染，降低实验误差。 3. 本产品A 型含电泳染料，PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。 4. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能扩增各种常见的DNA 样品。 5. 产物可直接用于T 载体克隆，不需要额外的加A 反应。 使用及效果：将本产品15 μL 与用户自备的模板，引物和水共15 μL 混合后，直接进行PCR反应（PCR 参数由用户自己确定），反应结束后直接取10 μL 电泳检查扩增结果。 技术特点： 1、准确可靠，临床双盲对照试验＞1000例，结果与金标准测序法比对，结果一致性大于99%。 2、高灵敏：可检测低至10ng的人基因组DNA。 3、快速：整个检测流程只需3小时。 4、简便：试剂盒提供预混好的试剂，使体系配置操作简便。 5、防污染 6、高特异性：双重特异性组成，保证检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必需完全配对，才能延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产物配对，在延伸中产生荧光。 组成及试剂配制: 1、 酶标板：一块（96孔） 2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3、 样品稀释液：1×20ml。 4
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鸽疱疹病毒型PCR检测试剂盒使用说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
鸽疱疹病毒型PCR检测试剂盒说明书 本产品是即用型PCR试剂盒的改良产品， 含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等所有PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行PCR 反应，具有广泛的用途。 . 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR 实验。 2. 快捷，操作步骤已经限度地简化，能减少污染，降低实验误差。 3. 本产品A 型含电泳染料，PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。 4. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能扩增各种常见的DNA 样品。 5. 产物可直接用于T 载体克隆，不需要额外的加A 反应。 使用及效果：将本产品5 μL 与用户自备的模板，引物和水共5 μL 混合后，直接进行PCR反应（PCR 参数由用户自己确定），反应结束后直接取0 μL 电泳检查扩增结果。 技术特点： 、准确可靠，临床双盲对照试验＞000例，结果与金标准测序法比对，结果一致性大于99%。 2、高灵敏：可检测低至0ng的人基因组DNA。 3、快速：整个检测流程只需3小时。 4、简便：试剂盒提供预混好的试剂，使体系配置操作简便。 5、防污染 6、高特异性：双重特异性组成，保证检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必需完全配对，才能延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产物配对，在延伸中产生荧光。 组成及试剂配制: 、 酶标板：一块（96孔） 2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前5分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约0分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，00 U/L，50 U/L，25 U/L，2.5 U/L，6.25 U/L，3.2 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制00 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3、 样品稀释液：×20ml。 4、 检测稀释液A：×0ml
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Analytical Chemistry文献 -Q300全定量方法应用案例
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
随着代谢组学的发展与研究认识的不断深入，越来越多的代谢组学专家学者逐步深刻认识到代谢组学方法必须从早期兴起的非靶向定性分析过度到靶向绝对定量检测分析，绝对定量获得代谢物的准确浓度才能更快的实现临床转化，并精准匹配大量临床队列样本的检测需求。但由于代谢物的化学多样性及浓度范围差异性巨大等原因，想要在一个方法下实现成百甚至上千种代谢物的绝对定量检测困难重重。近日，上海市第六人民医院转化医学中心主任&麦特绘谱创始人贾伟教授研究团队基于化学衍生法开发的UPLC-TQMS代谢组学检测方案，可以对324种不同类别代谢物实现同时绝对定量检测分析，并经过多个临床队列样本的验证，相关方法学成果于2021年4月2日成功发表分析方法学类顶刊《Analytical Chemistry》。麦特绘谱已将该方法成功生产为质谱试剂盒产品，可在Waters、Sciex、Agilent、Thermo、Shimadzu等各大厂商质谱平台应用，同时配置TMBQ数据处理软件。此外，麦特绘谱拥有自主研发的数据分析云平台（iMAP），更有最专业的技术支持团队加持，可以为科研及临床研究工作者提供标准化、一站式代谢组学整体解决方案。 一、Q300全定量检测方法学考察 图1 Q300代谢芯片的分析流程 线性和定量限：根据代谢物和内标的峰面积比与代谢物浓度作图，获得校正曲线。根据代谢物标准品一系列不同浓度，通过线性回归模型确定响应线性。大多数代谢物的线性相关系数（R2）均大于0.9900，且具有较宽线性浓度范围的检测能力，通过自主开发的TMBQ软件提供相应的信噪比（S/N），可以快速确定每种化合物的定量限。 重现性：通过标准混合物和生物样本（人血清、尿液、粪便、细胞和小鼠肝脏等）考察了自动衍生化技术和UPLC-TQMS的方法重现性。六种独立制备的标准混合物和样品分别进行连续重复测量分析。在人血清、尿液、粪便样品、HepG2细胞和小鼠肝脏样品中鉴定出的大多数测试化合物和代谢物均具有优异的重现性，相对标准偏差（RSD）小于15％。 回收率：分别采用
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饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
疾病动物模型是研究人类疾病发生发展机制、药物筛选及疗效评价必不可少的工具，好的疾病动物模型可以加快新药的研发速度。你还在为不知道选择什么小鼠模型发愁吗？你还在为造模发愁吗？赛业生物新栏目《每周一鼠》，每周更新，为大家讲解一个疾病小鼠模型的故事，希望对大家了解不同的疾病小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型。 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和蓄积为特征的临床病理综合症，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬变。可从单纯性脂肪肝经非酒精性脂肪性肝炎（NASH）发展为肝纤维化，甚至导致肝硬化、肝细胞癌（HCC）或肝功能衰竭等终末期肝病。动物模型在阐明非酒精性脂肪肝的病理生理机制以及新药的开发中起着重要的作用。临床前研究需要根据研究的特定NAFLD表型使用不同的动物模型。NAFLD和NASH的临床前动物模型可分为四类：饮食诱导模型、化学物质诱导模型、基因编辑模型、复合模型。今天我们要讲的是饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型。 发病机制 其主要发病机制是营养过剩，食物中脂类、胆固醇和（或）糖类过量，无法完全吸收利用，脂类堆积于肝而引发脂肪肝，进一步出现肝炎性改变及纤维化。 模型特点 ☑ 独有的多种免疫缺陷为人类造血细胞的重建提供了一个极好的系统，是HIV-1研究和基因**的重要模型。 ☑ 肿瘤研究的重要工具，可增加肿瘤的发生率，尤其是淋巴瘤和胸腺瘤。 ☑ 移植致死性胸腺淋巴瘤的情况下寿命短。 造模方法 选用SPF级健康雄性 C57BL/6 小鼠 ，对照组采用普通饲料喂养，模型组采用高脂饲料喂养，在第 4、8、12 周进行体重及肝指数检测，先采血后处死，采血用于生化指标检测，肝组织用甲醛水溶液固定标本，制成石蜡切片，采用苏木精-伊红染色（HE染色）、油红O染色，进行病理检测。 模型评价 光学显微镜下，肝细胞脂肪变性占1/3以上者视为脂肪肝。 01 外观及体
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技术干货，三血管阻塞模型的制作
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
//三血管阻塞模型 急性脑缺血动物模型是研究脑血管病病理机制和防治措施不可缺少的工具。由于临床上缺血性卒中大多是由于大脑中动脉区域梗死造成，因此人们普通采用血管内线栓法模型，但是由于该模型制作变异性大，而且动物长期存活率低，致使实验重复性差。 后来经过学者们不断的摸索优化，发明了开颅后夹闭大脑中动脉(而非电凝)联合双侧颈总动脉夹闭的大鼠三血管阻塞模型(3-vessel occlusion， 3-VO) ，由于该方法可同时导致大鼠皮质和基底节缺血，被认为是最接近人类卒中的标准动物模型，适用于脑缺血后长期神经功能缺失的康复及介入**研究中。另外，该模型因其缺血较为迅速、缺血效果好、再灌注血流恢复迅速而更加适用于急性缺血性疾病的研究。 //动物选择 •小鼠：C57BL6J CD-1等小鼠，常用雄性小鼠，体重25-35g •大鼠：Sprague-Dawley(SD)、Wistar等多种小鼠，常用雄性大鼠，体重250~350g //制作步骤 1.大鼠手术操作步骤 •将大鼠置于手术台上,取仰卧位,用10m注射器大小的管子放置在大鼠颈后,以加强双侧颈总动脉的显露。 (1)剃掉颈部和腹侧的毛,用75%的乙醇棉球或聚维酮碘进行局部皮肤消毒,颈部中线做一个切口,分离双侧颈总动脉,双动脉下穿线;分离颈总动脉时小心分离伴行的迷走神经纤维,以免受损伤。 (3)将大鼠体位改为左侧卧位。 (4)在大鼠右眼滴加1~2滴人工泪液,闭上眼睑,避免手术中对眼睛造成损伤;剃掉右侧外耳道和右眼外之间的皮毛,使用聚维酮碘局部皮肤消毒,75%乙醇脱碘,在两个位置连线中点做一切口,长度约2cm。 (5)用止血钳拉开切口,切断颞肌,分离肌肉,暴露颧弓。操作工程中要注意保护腮腺和面神经。 (6)用咬骨钳移除颧弓,用牵张器撑开下颌骨与颧弓,暴露前庭窗;用1.4mm钻头的骨钻在前庭窗的前3mm、下1mm处钻孔,钻头浸在室温的盐水中,以免在钻洞过程中造成皮质热或物理损伤。在显微镜下透过硬脑膜即可看见大脑中动脉,垂直于嗅束向上走行。 (7)用针头挑破硬脑膜,分离大脑中动脉周围的蛛网膜,暴露
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Il2rg敲除的重度免疫缺陷小鼠助力免疫学研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是免疫研究热门靶点IL2Rg。 IL2Rg简介 白介素2受体γ链（interleukin 2 receptor subunit gamma chain, IL2Rg，或CD132），是多种重要免疫因子的共同受体亚基，包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，因此，也被称为受体共同γ链（common gamma chain，γc）。IL2Rg是一种表达于大部分淋巴细胞表面的糖蛋白，在哺乳动物中，IL2Rg基因位于X染色体上。 图1. IL2Rg是多种重要免疫因子的共同受体亚基[1] IL2Rg家族细胞因子 IL2Rg家族中的细胞因子（IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21）有着不同的生物学作用，在机体免疫系统中扮演了重要角色。 IL-2 表达细胞：T细胞、DC 作用： ■ 促进Th1、Th2和Th9的分化；抑制Th17和Tfh的分化 ■ 诱导T细胞和NK细胞增殖 ■ 增强Treg的分化和功能 ■ 在免疫疗法中起到抗癌作用 IL-4 表达细胞：T细胞、NKT细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞 作用： ■ 促进B细胞分化和免疫球蛋白同种型转换（Ig isotype switching） ■ 促进Th2和Th9分化 ■ 促进组织驻留型巨噬细胞的增殖 ■ 抗蠕虫感染 IL-7 表达细胞：基质细胞、上皮细胞、成纤维细胞 作用： ■ T细胞发育和稳态所必需 ■ 促进记忆CD8+ T细胞发育 ■ 对小鼠B细胞发育至关重要，但对人B细胞发育非必需 IL-9 表达细胞：基质细胞、上皮细胞、成纤维细胞 作用： ■ 促进肥大细胞增殖 ■ 促进杯状细胞（goblet cell）产生黏液（mucus） ■ 抗肿瘤 IL-15 表达细胞：单核细胞、DC、上皮细胞 作用： ■ 对NK细胞发育、增殖和生存至关重要 ■ 促进记忆CD8+ T细胞发育 ■ 在免疫
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原代细胞注意事项及技术步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
原代细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养过夜，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及时和我们，信息确认后我们为您再免费寄送一次。 4. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件。 5. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和公司技术部沟通交流。 6. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 原代细胞操作步骤： 1）贴壁细胞传代：提前将培养基、PBS放入37℃水浴锅内预热，用75%酒精擦拭后再放入超净台内，吸除或倒掉细胞瓶内旧培养液，加少量PBS润洗细胞，加入适量胰酶，使胰酶的量能盖住细胞，37℃孵育，每隔2~3min显微镜下观察，待贴壁细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起时弃去胰酶，加入新鲜培养基，晃动细胞瓶，终止胰酶作用，用吸管小心吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液。控制吹打的力度，避免产生大量的气泡，将细胞悬液分别接种到另外的2~3个细胞瓶内，加入新鲜培养基，置37℃温箱培养，隔天观察贴壁生长情况。 2）悬浮细胞传代：将细胞悬液转移到无菌离心管内，1000rpm离心5min，弃去上清，加入新鲜的培养基，用吸管小心吹散沉淀，制成细胞悬液，将细胞悬液分别接种到另外的2~3个细胞瓶内，加入新鲜培养基，置37℃温箱培养。
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CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi干扰表达，哪种调控方式更好？
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
刚进实验室的小萌新，总有一种天下风云出我辈的风范，两耳不闻窗外事，一心只想发CNS。 想要实验快速上手，首先要掌握的就是研究策略。 在基因功能研究中常用两种基础策略，功能减弱或缺失，功能增强或获得。 实现基因功能减弱，可以采用RNA干扰（RNAi）技术下调目的基因表达。在RNAi使用中，siRNA或shRNA的设计是关键。长度约为21bp的siRNA与蛋白形成RISC复合物，结合目的基因的mRNA，从而使其降解，达到降低基因表达水平的目的（注意RNAi是作用于mRNA水平）。但需要引起注意的是，如果目的基因在细胞中本体表达就较低的情况下（一般ΔCT＞16），就不适合用RNAi了。 随着CRISPR/Cas9技术的成熟，越来越多的科研人员采用基因敲除的方式实现基因彻底缺失的目的。与RNAi不同的是，基因敲除理论上可作用于基因组上所有的基因片段，并使目的基因的蛋白完全不表达，从而更有利于观察细胞表型的变化，简单来说，就是更容易做出实验结果。 CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi干扰表达，哪种调控方式更好？ 没有更好，只有最适合！ 1. 两种方法没有绝对的好坏，通常RNAi技术由于操作简便，使用广泛，但CRISPR/Cas9可使基因功能丧失更彻底，因此近些年受到广泛追捧。 2. 某些情况下不适合用RNAi，例如需要改变无法转录的DNA区域，只能用基因敲除。 3. 某些特殊情况，敲除该基因会导致细胞生长缓慢，停滞甚至死亡，这样获得基因敲除细胞株比较困难，因此就需要选择通过RNA干扰的手段实现功能减弱。 对于基因功能增强或获得来说，常用的就是过表达和基因敲入了。 过表达和基因敲入，如何选择？ 上调表达使得功能增强通常采用的方法是将目的基因的编码区（CDS）构建到载体中，导入细胞内使目的基因的表达量显著增加。但基因在细胞内本体表达已经很高时，此时再进行过表达的调控，细胞的表型很可能不会发生变化，此外，外源高表达对细胞也是个刺激压力，会产生假阳性和假阴性的结果。 而对于功能
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1,5-AG ELISA试剂盒使用说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
1,5-AG ELISA试剂盒说明书 本产品是即用型PCR试剂盒的改良产品， 含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等所有PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行PCR 反应，具有广泛的用途。 1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR 实验。 2. 快捷，操作步骤已经限度地简化，能减少污染，降低实验误差。 3. 本产品A 型含电泳染料，PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。 4. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能扩增各种常见的DNA 样品。 5. 产物可直接用于T 载体克隆，不需要额外的加A 反应。 使用及效果：将本产品15 μL 与用户自备的模板，引物和水共15 μL 混合后，直接进行PCR反应（PCR 参数由用户自己确定），反应结束后直接取10 μL 电泳检查扩增结果。 技术特点： 1、准确可靠，临床双盲对照试验＞1000例，结果与金标准测序法比对，结果一致性大于99%。 2、高灵敏：可检测低至10ng的人基因组DNA。 3、快速：整个检测流程只需3小时。 4、简便：试剂盒提供预混好的试剂，使体系配置操作简便。 5、防污染 6、高特异性：双重特异性组成，保证检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必需完全配对，才能延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产物配对，在延伸中产生荧光。 组成及试剂配制: 1、 酶标板：一块（96孔） 2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3、 样品稀释液：1×20ml。 4、 检测稀释
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浅述生物学中的机器学习算法——随机森林篇
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
01.随机森林概述 随机森林=决策树+bagging，随机森林是一种比较新的机器学习算法，是集成算法的一种。上世纪八十年代Breiman等人发明分类树算法，通过反复二分数据进行分类或回归，计算量大大降低，2001年Breiman把分类树组合成随机森林，即在样本和特征的使用上进行随机化，生成很多分类树，再汇总分类树结果。随机森林在运算量没有显著提高前提下提高了预测精度，随机森林对多元共线性不敏感，结果对缺失数据和非平衡数据比较稳健，可以很好地预测多达几千个解释变量的作用，被誉为当前**算法之一。 随机森林是集成分类算法的一种，随机森林是用随机的方式建立一个森林，森林由很多的决策树组成，且每一棵决策树之间是没有关联的。得到随机森林模型后，当对新的样本进行预测时，随机森林中的每一棵决策树分别进行判断，bagging集成策略比较简单，对于分类问题通常采用简单的投票法，得到最多票数的类别为最终模型输出。对于回归问题通常使用平均法，T个弱分类器得到的回归结果进行算术平均即为最终模型输出。 02.相关基础知识 1. 集成学习概述集成学习集合多个机器学习算法来完成学习任务。即“博采众长”，集成学习可用于分类问题集成、回归问题集成、特征选取集成、异常点检测集成等。从下图可以看出集成学习通过训练集训练出若干个个体学习器，通过一定的结合策略，可以最终形成一个强学习器，达到博采众长的目的。 据此可以看出，集成学习要解决的主要问题有两个，第一如何得到个体学习器；第二如何选择一种结合策略。 2. 集成学习中的个体学习器得到若干个个体学习器，有两种方式。第一种是所有的个体学习器都是同一类的，或者说是同质的，即所有的个体学习器都是同一种机器学习算法，比如都是决策树或者神经网络个体学习器。第二种是所有的个体学习器不全是同一类学习器，如里面包含支持向量机、逻辑回归、朴素贝叶斯等个体学习器，再通过某种策略来确定最终的分类强学习器。目前来看，同质个体学习器应用广泛。一
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Cell Metabolism 综述解析 | 肝星状细胞的可塑性代谢调节能力
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
肝星状细胞（HSCs）是一种非实质肝周细胞，因其是肝损伤的原发性纤维化细胞类型备受关注。HSCs被认为是一种可塑的细胞类型，可以调节肝脏生长、免疫和炎症，以及能量和营养稳态，这些功能依赖于代谢的多样性和能量消耗的严格调控。然而HSCs通过其可塑性调节多种生理和病理反应的机制仍不清楚。HSCs是一个被忽视的决定免疫代谢的因素，在支持肝功能和免疫应答损失中，细胞从静止状态激活或转分化为增殖的、运动的肌成纤维细胞，分泌细胞外基质，需要快速适应以满足更高的能量需求，这些适应包括中心碳代谢的编程、线粒体数量和活性的增强、内质网应激，以及通过储存在细胞质液滴中的视黄酯自噬依赖性水解而释放游离脂肪酸。本文揭示了HSCs的代谢调节如何在健康和疾病中发挥其功能。 背景 星状细胞（以前称为脂肪细胞、脂肪储存细胞、窦周细胞或Ito细胞）来源于隔膜横隔间充质，间充质来源的间皮和间皮细胞从胚胎肝脏表面向内迁移，产生HSCs和其他血管周围间充质细胞。正常的肝脏中，HSCs在核周液滴中储存维生素A作为视黄酯，这些细胞是人体维甲酸储存的主要仓库。 单细胞转录方法在表征HSCs方面有非常广泛的应用。在肝损伤期间，HSCs转分化，或“激活”成增殖的、纤维化的肌成纤维细胞(MFBs)，这些细胞获得一系列共同维持损伤和纤维化的特征（Figure 1），由于肝损伤通过凋亡或逆转为“失活”表型来减少HSC衍生的MFBs数量。这些失活细胞具有独特的表观遗传特征，并且在未来HSCs再损伤时更容易重新激活。 Figure 1. Features of HSC Activation and Resolution 慢性肝损伤可促进HSCs的持续激活，导致细胞外基质（ECM）蛋白的积累，从而破坏肝脏的结构及其功能。HSC的激活是由许多信号触发的，这些信号是细胞损伤的标志，包括浸润免疫细胞产生的促炎细胞因子、肝细胞凋亡小体、内皮细胞介导的生长因子激活和活性氧负担增加。细胞对损伤的反应通过一系列旁分泌和自分泌环增强，包括转化生长因子β1（TGF-β1）和结缔组织生
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