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“新四大碱基”的确定，对于生物学研究者的几点启示
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
21世纪最有生命力的行业之一，不得不说有生物行业。生物行业的发展速度已经超过了以往任何的时代，而且越来越加深入的研究着生命这个永恒不变的主题。目前随着对于表观遗传学的研究逐步深入，越来越多新的发现被生物界人士所震掠。其中新“四大碱基”的发现，对于生物行业的研究者来说，是又惊又喜。惊的是我们对于生命的认识，还有很长的路要走；喜的是我们对于生命的认识又向前迈进了一大步。相信表观遗传学研究的更加深入会给生物科学的发展，注入更多的活力；坚信越来越多的研究人员，会关注并研究这一课题。 下面我司经过整理相关的文献，简要介绍“新四大碱基”： 新四大碱基是什么? 几十年来，科学家们一直认为DNA中只包含有4种碱基：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(T)，这4种碱基已成为我们对基因代码如何形成生命的认识的基础。此处对于“新四大碱基”的说法主要是针对传统研究的四种碱基而言的。具体如下： 第5种碱基：5-甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine) 第6种碱基：5-羟甲基胞嘧啶 (5-hydroxymethylcytosine) 第7种碱基：5-甲酰基胞嘧啶 (5-formylcytosine) 第8种碱基：5-羧基胞嘧啶 (5-carboxlcytosine) 对于研究者的几点启示： 第8种碱基的意义： 中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所徐国良研究组近日在《科学》杂志发表论文，初步阐明了DNA去甲基化的机制与过程，宣告人类发现了这个生命编码过程中的“新单词”。这意味着人类对自身受精卵变为胚胎细胞的内在机制有了更深理解。 甲基化是核酸的一种重要修饰，调节基因的表达和关闭，与动植物生长发育、疾病发生发展有密切关系。以往研究已知，DNA四大碱基还有两种修饰形式，即第5种碱基5mC、第6种碱基5hmC，它们均包含甲基（m）这个“词缀”，是甲基化的碱基。DNA甲基化会关闭某些基因的活性；而反之，DNA去甲基化则会诱导基因的重新活化
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Isolation of human prostatic smooth muscle cells
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
Isolation of human prostatic smooth muscle cells Human prostate tissues 1.Human hyperplastic prostates were obtained during surgery from four men through transurethral resection of the prostate. 2.All these patients had histories of prostatism and were diagnosed as having benign prostatic hyperplasia on the basis of the combination of rectal digital examinations, transrectal sonography of the prostate, and urodynamic studies (including uroflowmetry, urethral pressure profile, and cystometry). Tissue explants and subcultures 1.Tissue specimens were immediately placed into a sterile Petri dish and minced into small pieces of ~2 × 2 × 2 mm under a laminar flow hood. 2.The minced tissue pieces then were transferred into a 15-ml polypropylene centrifuge tube containing 3 ml of 0.1% collagenase type 1 in HBSS, pH 7.4, and bubbled with a mixture of 5% CO2/95% O2 at 37° for 40 min. 3.The tube was subjected to a rotator at a speed of 300 rpm for 3 min. After a brief settlement, the supernatant fraction was discarded, and the tube was filled with 3 ml of 0.1% trypsin in PBS in the above condition for 10 min. 4.The tissue pieces were centrifuged at a speed of 1000 rpm for 3 min, and then the pieces were washed twice with HBSS and transferred to sterile flasks, which were precoated with 10 μg/ml collagen type 1, containing RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS (v/v), penicillin (100 units/ml)/streptomycin (100 μg/ml), amphotericin B (2.5 mg/ml), and testosterone (10 nM). 5.Cultures were maintained in a humidified incubator at 37° in 5% CO2/air. 6.Usually with 5–7 days, succe
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乳化机的转速问题分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
乳化机在工业设备搅拌系统中据有主要的效果，特殊是在固液夹杂、液液夹杂、油水乳化、涣散均质、剪切研磨方面有着极端主要的使用。之所以称其为乳化机是应为可以完成乳化的效果。油水两相介 质的彻底夹杂后构成乳液，分为油包水或水包油两种系统，要完成乳化，有至少两方面的要求：一是激烈的机械切割涣散效果，将水相与油相的流体介质还切割打散 为小颗粒，然后再汇拢兼并时就有相互浸透掺混，构成乳液。二是适宜的乳化剂，在油水分子间充任序言桥梁的效果，经过其电荷及分子间力的效果，使油水夹杂乳 液可以依照我们所需望的工夫不变寄存。 目前乳化机的使用不单单局限于"乳化"，因为其共同的剪切效果，对粉粒体在液体中的破碎摧毁撞击最终细化到幻想的粒径，然后使固体质充沛掺混到液体中并构成相对不变的悬浮液。 当然与乳化剂一样，添加了涣散剂后，悬浮液的不变性就能获得加强。当某种固体物质经过必然工夫与液体的接触可以被液体彻底消融，那么经剪切撞击而构成的小颗料将更快地被液体所消融，由于其比外表积增大了很多倍了。当人们习气了经过高压均质机来获得微细颗粒后，细化就与均质划上了等号，因此乳化机对物料的细化及充沛掺混的效果也就是均质的进程了。所以我们也可以把乳化机称为均质机，为便于区分，普通可冠于高速或许高剪切均质机，以致于对乳化机有良多种叫法：真空均质机、高剪切均质机、高剪切均质机、高剪切均质机、无菌均质机、高剪切均质机、真空均质机、管线式均质机等。 乳化机的剪切效果的强弱直接影响到最终细度，经由剖析，首要与刀刃尖利水平，硬度，转定子间隙，切割的两刀口的相对活动速度及答应经过的粒径等有关，凡间状况下，刀刃尖利水平、硬度、转定子间隙及答应经过的粒径根本已定型或不想改动了，那么乳化机刀口的相对活动速度就是最有影响的要素，显示为转子的圆周线速度，该线速度高，则对径向活动的流体的切割或撞击的密度就高，因此乳化机的细化效果就强，反之亦然。 但
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气相色谱仪气路故障与排除
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
气相色谱仪气路故障与排除 （1）流量调节故障； （2）气路泄漏故障； （3）气路堵塞与污染故障。 在气相色谱仪出现的各种故障中，有相当大的一部分都与气路有关，因此，了解和熟悉气路故障是十分必要的。 一、 流量的调节 1、流量调不上去 （1） 直观检查：首先检查仪器系统是否有明显的漏气声。在仪器系统气路有较大的泄漏发生时，很可能导致流量调不上去。如果听不到漏气声则转入（3）进行。 （2）查漏：听到有漏气声之后，可依照声音发出的方向而逐步定位。此时可利用皂液的涂抹进一步确定漏气的发生处。找到原因后及时堵漏。 （3）柱前压观察：观察柱前压指示表的数值大小，可迅速判断是气源引起的故障，还是仪器内部气路堵塞及损伤造成的。如果是柱前压太低（精确地说是比正常流量操作时的预定压力值低），则说明气源需要检查；如果柱前压正常则需要检查仪器的内部气路。 （4）钢瓶高压检查：打开钢瓶阀后，观察高压表指示，压力应在1~15MPa之间。如果压力在1MPa以下，停用该钢瓶，换气；如压力值在合适的范围内，说明钢瓶压力正常。 （5）减压阀上低压输出检查：调节减压阀看钢瓶上低压表指示能否调到0.25~0.6MPa之间。如果正常，可怀疑气路过滤接头有堵塞或者是仪器上的稳定阀有问题，此时应按照（6）来进行；如低压值不正常，则说明减压阀有问题，需进行（7）的修理。 （6）过滤器堵塞及稳压阀检查：将过滤器出口到仪器气源入口处的接头缓缓旋开，观察是否有较强的气流从接头处跑出。如有，则说明过滤器不堵塞，稳压阀可能有问题。在确定稳压阀不出气后，可进行阀拆卸与清洗，这可能是稳压阀内阀针与阀座间堵塞所致。如清洗后阀仍不能正常工作，**换一个新阀；在上面试验中若无较强气流从旋开的接头中流出，需要检查过滤器入口前后可能堵塞之处；当然中间管线的堵塞也是可能的，但发生率甚小。 （7）减压阀修理：在明了减压阀的结构之后，可拆卸修理减压阀。由于该减压阀入口一侧有高压，
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Isolation and Culture of human vascular smooth muscle cells
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
Isolation and Culture of human vascular smooth muscle cells 1. Human vascular smooth muscle cells (SMCs) were isolated from human saphenous vein. 2. Small moistened pieces of tissue (6 mm2) were placed intima side down in a tissue-culture flask and left to adhere for 2 hours, and then the base of the flask was carefully flooded with culture medium consisting of Dulbecco's modified Eagle's medium containing 15% HI-FBS, penicillin (10 U/mL), streptomycin (10 µg/mL), and fungizone (0.5 µg/mL) and left undisturbed for 2 to 3 weeks. 3. Primary isolates were grown to confluence in culture medium and passaged using trypsin/EDTA. 4. Cells were fixed for 10 minutes in ice-cold methanol and immunocytochemical analysis showed them to be positive for the smooth muscle cell–specific marker α-actin. 5. Cells were used from five different patients between passages 2 and 9. 6. To render cells quiescent, FBS was removed from the culture medium for 24 hours before all experiments. Measurement of Cell Growth 1. Cell Outgrowth From Explants To avoid individual variations, outgrowth of cells from explants was analyzed in IMAs and SVs from the same patients (n=5; four men and one woman; age, 61±8 years), and the explant culture was performed as described above. At 20 days after culture, total explants and explants with cell outgrowth were counted. Cell outgrowth rate was calculated as follows: Cell Outgrowth Rate=N(+)/N(t)x100%, where N(+) is the number of explants with cell outgrowth (regardless of cell number) and N(t) is the total number of explants seeded. 2. DNA Synthesis and Cell Divis
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Culture of human venous smooth muscle cells
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
Culture of human venous smooth muscle cells 1. Explants of the 2 groups of skins (control subjects and patients with varicose veins) were prepared according to the method described for smooth muscle cells by carefully putting the epidermis at the top. 2. Cells were grown into collagen-precoated Petri dishes in Dulbecco’s modified Eagle medium supplemented with 10% fetal calf serum, 10% horse serum, 2 mmol/L L-glutamine, 105 U/L penicillin, and 100 μg/mL streptomycin at 37°C in a 95% air, 5% CO2 atmosphere. 3. Cell growth began within 3 to 5 days, and cells reached confluence after 2 weeks. 4. Cells were then trypsinized, seeded at a density of 10 000 cells/cm2 (first passage), and subcultured to be used at passage 3 or 4 after 8 to 10 population doublings in the same culture medium described above without horse serum. 5. For determination of cell proliferation, both cell types were subcultured at passage 3 at a density of 8000 cells/cm2 and counted at different times with an automatic cell counter. Reference 1. Sansilvestri-Morel P, Nonotte I, Fournet-Bourguignon MP, et al. Abnormal deposition of extracellular matrix proteins by cultured smooth muscle cells from human varicose veins. J Vasc Res. 1998; 35: 115–123. 2. Sansilvestri-Morel P, Rupin A, Kern P, et al. Imbalance in the synthesis of collagen type I and collagen type III in smooth muscle cells derived from human varicose veins. J Vasc Res. 2001; 38: 560–568.
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气相色谱仪的基本构造
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
气相色谱仪的基本构造 气相色谱仪的基本构造有两部分，即分析单元和显示单元。前者主要包括气源及控制计量装置﹑进样装置﹑恒温器和色谱柱。后者主要包括检定器和自动记录仪。色谱柱（包括固定相）和检定器是气相色谱仪的核心部件。 （1）载气系统 气相色谱仪中的气路是一个载气连续运行的密闭管路系统。整个载气系统要求载气纯净、密闭性好、流速稳定及流速测量准确。 （2）进样系统 进样就是把气体或液体样品速而定量地加到色谱柱上端。 （3）分离系统分离系统的核心是色谱柱，它的作用是将多组分样品分离为单个组分。色谱柱分为填充柱和毛细管柱两类。 （4）检测系统检测器的作用是把被色谱柱分离的样品组分根据其特性和含量转化成电信号，经放大后，由记录仪记录成色谱图。 （5）信号记录或微机数据处理系统 近年来气相色谱仪主要采用色 谱数据处理机。色谱数据处理机可打印记录色谱图，并能在同一张记录纸上打印出处理后的结果，如保留时间、被测组分质量分数等。 （6）温度控制系统 用于控制和测量色谱柱、检测器、气化室温度，是气相色谱仪的重要组成部分。 气相色谱仪分为两类：一类是气固色谱仪，另一类是气液分配色谱仪。这两类色谱仪所分离的固定相不同，但仪器的结构是通用的。
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各种常见缓冲液的配制方法(在线计算)
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液和柠檬酸缓冲液等是生物学实验中常用的缓冲液，也是PeproTech重组细胞因子和蛋白溶解所需的常用缓冲液。然而，这些缓冲液的配制比较麻烦，尤其当要获得特定pH值的缓冲液时，调节pH值是费力、费时的事情。对于Tris等缓冲液等，pH计是无法准确测量其pH值的。 那么，有没有简便的方法来配制特定浓度和pH值的上述缓冲液呢？ 美国PeproTech公司为此精心设计开发出一个网上实用工具--。只要将你所需配置的浓度，pH值，以及配制的体积在网站上相应的位置输入或选定，即可计算出配制该溶液所需各组分的重量或体积，然后称取相应重量或体积的组分即可配制出您所需的缓冲液。 该网上工具包括以下内容： 1) 配制磷酸盐缓冲液 由一定量的Na2HPO4和NaH2PO4混合而得。 2) 配制柠檬酸(盐)缓冲液 由Citric Acid(柠檬酸)和Trisodium Citrate(柠檬酸钠)混合而得。 3) 配制醋酸溶液 在水中加入一定体积的醋酸而得。 4) 配制Tris缓冲液 由一定量的Tris HCl(Tris酸)和Tris Base(Tris碱)混合而得。 5) 重量与摩尔数转换工具 已知一蛋白的分子量(kDa)，可由重量推算出摩尔数和分子数，以及在一定体积内摩尔浓度。相反，也可由一个蛋白的摩尔数推算出重量和分子数，以及由摩尔浓度推算出所含的蛋白质量。 附：这些缓冲液在溶解PeproTech公司重组细胞因子和蛋白中的应用举例 1) 磷酸盐缓冲液 1 x PBS用于溶解100-19 Human KGF 和100-52 Human FGF-23等。 2) 柠檬酸(盐)缓冲液 5mM柠檬酸钠(pH 8.0)用于溶解100-17A Human FGF-acidic, 10mM柠檬酸(pH 3.0)用于溶解100-21 Human TGF-b1等。 3) 醋酸溶液 10mM醋酸用于溶解120-10 Human Noggin和120-20 Human WISP-3等。 4) Tris缓冲液 5mM Tris(
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切向流超滤（TFF）的原理、特点及其应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
颇尔公司提供业界领先的切向流过滤(TFF)技术，以满足日益增加的生物技术和生物工艺过程中的多样性需求并应对各种挑战。这些产品的设计目的是在保证过滤效果一致以及获得最高过滤量的前提下，简化处理过程并使处理过程呈流水线化。 切向流超滤（TFF）能快捷、高效地进行生物分子的分离与纯化处理；可用于低至10毫升、高达数千升样品溶液的浓缩和脱盐处理；也可以用于不同大小生物分子的分离、细胞悬液收集、以及发酵液和细胞裂解液的澄清。 为什么要使用切向流超滤 ● 易于装配，操作简单-用管路和少许管路配件，简单地连接切向流超滤装置、泵以及压力表，向储槽中加入样品，即可开始工作。 ● 快捷高效-对比透析，装配更轻松，处理速度快；对比离心浓缩装置或搅拌式超滤装置，可在更短的时间内获得更高浓度。 ● 仅需在同一系统中执行两步操作-在同一系统中完成样品的浓缩和渗滤处理，节约时间并避免损失产物。 ● 工艺和缩放-由于结构材料与平板式超滤器流体通路，实验室规模下的条件可以应用于生产规模的应用中。处理低至10mL、或高达千升体积的样品，均可提供对应的切向流超滤装置。成本低廉-切向流超滤装置与平板式超滤器经清洗后可再次使用，也可在单次应用后废弃。可执行简单的完整性测试，检验滤膜和密封的完整性。 切向流超滤的原理？如何分离生物分子 切向流（也称为“错流”）超滤中，泵推动流体通过滤膜表面，冲刷去除其上截留的分子，从而使滤膜表面的积垢程度降至最低。在渗余物流体中产生紧靠滤膜的压力，使溶质和小分子通过滤膜。如此方能完成过滤。利用细分筛网分离沙子与鹅卵石的模拟实验，有助于理解切向流超滤的机理：筛网眼象征滤膜上的孔隙，而沙子与鹅卵石象征待分离的分子，在直流过滤中，沙子-鹅卵石混合物被迫向着筛网眼方向移动，随着一些较小的砂粒通过筛网眼落下，在筛网表面形成以个鹅卵石层，阻碍顶部砂粒向筛网方向移动并通过筛网眼（图1），在直流过滤中，增加压力，仅能对混合物施加压
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抗体保存知多少
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
通常情况下，抗体经恰当保存和处理，大多数应能保持活性数月乃至数年。当然，不同类型抗体，其保存的方法也可能不一样，以下就抗体的保存，提供一些参考！ 一、保存温度和条件 对于很多抗体而言，保存在-20℃是完全足够了，没有任何证据显示保存在-80℃会有更多的好处！分装成小等份可最大程度减少由冻融造成的损伤，以及从单个试剂瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需冻融一次，如有剩余，可将剩余物保存于 4oC. 在收到抗体时，在 10,000 × g 下离心 20 秒以沉积截留于试剂瓶螺纹的溶液，并以小等份转移至低蛋白结合微量离心管中。小等份的量取决于实验人员在实验中通常采用的量。小等份应不小于10 µl; 等份越小，储液浓度因抗体蒸发及吸附于保存瓶表面而受到的影响越大。 在大多数情况下，收到抗体时在 4oC 下保存一至两周，然后再冷冻进行长期保存是可接受的，但也许腹水液是例外，它可能包含蛋白酶，因而应该尽快冻存。同样，遵照说明书上的建议是重要的。 大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在4℃的条件下来完成的。 对于特殊的抗体，如酶、荧光素等偶联抗体、IgG3同型抗体等抗体的保存有其注意事项： 1、偶联抗体 酶偶联抗体不应冻存，而应保存于 4oC. 冻融不仅影响抗体结合能力，还会降低酶活性。无论偶联至荧光染料、酶还是生物素，偶联抗体都应保存于深色试剂瓶中或用金属箔包裹. 暴露于光线中将损害偶联物的活性。特别是荧光偶联物易受到光漂白影响，在实验的所有阶段都应避光。 2、IgG3的同型对照 保存在4℃，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体 二、用叠氮化钠防止污染 为了防止微生物污染，可将叠氮化钠加入抗体制备品中达到0.02% (w/v). 的终浓度。但是有时不能使用叠氮化钠，有以下两中情形： (1)、如果用抗体染色或处理活细胞，或如果用抗体进行体内研究，一定要使用不包含叠氮化钠的制备品。该抗菌剂也对大多数其它生物具有毒
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选择合适的二抗，不再纠结！
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
当你徘徊在如何选择二抗，或不知怎样选择最合适的二抗时，你的眼神告诉我，你纠结了，但是这不是你的错。而当看完以下内容，你将不会再纠结，否则，那将是我的错。 1. 弄清一抗的宿主物种是什么 二抗指向一抗的物种。如果使用来源于兔的一抗，则需要来源于除兔以外的其它物种的抗兔二抗。例如山羊多克隆抗兔IgG 二抗可以检测兔多克隆抗 Ki67 一抗。换言之，二抗的宿主物种要求与一抗的宿主物种不同，而且种属亲缘关系越远越好。 2.了解一抗蛋白类型 二抗必须指向一抗同型。 多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴，并且是IgG 同型。二抗通常为抗 IgG 重链和轻链的抗体。单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠。例如，如果单克隆一抗为小鼠 IgG1，则 需要抗小鼠 IgG 或特异性较低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG。 人免疫球蛋白类、亚类、型和亚型： · 类或同型：IgG (γ heavy chains), IgM (μ), IgA (α), IgE (ε), IgD (δ) · 亚类： IgG1 (γ1 heavy chains), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4); IgA1 (α1), IgA2 (α2) · 型：κ light chain, λ light chain · 亚型： λ1, λ2, λ3, λ4 其它类型的反应： · 多价抗体与所有免疫球蛋白类反应 · 抗 Fc 或重链 (α, δ, ε, γ, and μ) 抗体仅与重链反应 · 抗 F(ab) 或完整分子抗体与重链和轻链反应，而与免疫球蛋白类无关 · 由于所有免疫球蛋白类均使用相同的 κ 和 λ 轻链，因此抗轻链（κ 和 λ）抗体 与所有免疫球蛋白类反应 3. 需要酶学或荧光检测吗？ 偶联类型是依赖于应用的。 对于酶学和生物素检测，例如，在 WB 或 ELISA 中，建议将二抗偶联于 HRP, AP 或 生物素。不论抗体宿主物种是什么，抗生物素蛋白和链霉亲和素与生物素的结合作用均很强，并且均能使信号放大。 如果使用了激光，例如，在流式细胞术、ICC/IF 或 IHC 中使用时，则建议将二抗偶联于荧光染料进行荧光检测。 4.有必要使用 F(ab) 或 F(ab')2片段抗体吗？ F(ab) ) 和 F(ab')2片段抗体消除了抗体 Fc 部分与细胞（如巨
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抗原和抗体浓度的优化-免疫斑点实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
对于一个给定的抗原，最佳的抗体浓度依赖的抗原和抗体本身。抗原和抗体的亲和力，以及一抗与二抗的特异反应都是不同的。最优抗原和抗体浓度可通过免疫印迹实验中使用不同浓度的抗原和抗体作用确定。另外，更快和更简单的方法是进行斑点印迹实验。 以下是使用超敏感信号底物进行的斑点印迹的操作方法： 1、 用TBS和PBS稀释的蛋白样品，好的稀释方法是由样品中的抗原稀释浓度决定的，但是由于抗原的浓度是未知的，所以有必要进行宽范围的稀释度的检测。SuperSignal West Pic化学发光底物的检测灵敏度可达皮g水平，所以样品的稀释范围可以从微克水平到皮克水平。如果要使用过多的抗原，结果会出现以下情况：非特异性条带、模糊条带和信号降低。 2、准备转印膜。所需膜的数量依赖于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少种不同稀释浓度。通常，一种或两种一抗的稀释度是用两种或三种不同的二抗稀释度进行测定的。例如：1/1000的一抗和1/50000的二抗；1/1000的一抗和1/100000的二抗；1/5000的一抗和1/50000的二抗；以及1/5000和1/100000的二抗。 3、将膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。用尽可能小量的稀释液点在膜上（2-5 ul为宜），因为用的体积越大，信号越弥散。抗原溶液在膜上干10-30分钟或直至无可见的水分。 4、用含0.05%的Tween-20封闭液封闭膜上的非特异性点，室温震荡孵育1 h。 5、将一抗稀释到封闭液/Tween-20去污剂中，并加到膜上，室温震荡孵育1h。 6、用TBS或PBS洗膜4-6次，用尽可能大体积的洗脱液，在洗脱液中加入0.05%的吐温，用以减少非特异背景。每次洗脱过程中，使膜悬浮在洗脱液中震荡大约5分钟，倒出洗脱液并重复。孵育前，在洗脱液中短时间的漂洗可能会增加洗脱效率。 7、制备二抗/HRP结合的封闭试剂/Tween-20去垢剂稀释液，将二抗稀释液加到膜上震荡孵育1 h。 8、按第6步方法再次清洗膜。 9、准备底物工作缓冲液，混合等体积的鲁米诺/增强剂和稳定的过氧化物溶液。制备足够体积确保印迹点完全湿润，保证印
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流式实验即将开始，“分析样品”你准备好了？
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
一、细胞的准备 试验一：组织培养细胞的细胞准备 材料 完全培养基 流式细胞仪染色液 15或50ml尖底离心管 实验过程 1． 对于悬浮培养的细胞，把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，然后进入步骤3； 2． 对于贴壁培养的细胞，用完全培养基从培养皿上吹起并吹散细胞凝聚物，然后把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，进入步骤3； 3． 离心细胞然后用流式细胞仪染色液重悬细胞使其终浓度为2×107个细胞/ml。 试验二：淋巴组织的细胞准备 材料 60×15 mm 组织培养皿 3 ml注射器 细胞滤网（血液尼龙滤网） 流式细胞仪染色液 15或50ml尖底离心管 实验过程 1． 采集组织（采集组织（脾，淋巴结，胸腺）放进一个细胞培养皿中，用3 ml注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液，此过程用10ml的染色缓冲液； 2． 加入10ml染色液收集细胞，使细胞悬液通过尼龙滤网以除去成团的细胞和细胞碎片，收集细胞悬液于尖底离心管中； 3． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液； 4． 重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析； 5． 按照步骤3离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。 试验三：非淋巴组织的细胞制备 材料 剪刀或者手术刀片 PBS 60×15 mm 组织培养皿 3 ml注射器 细胞滤网（血液尼龙滤网） 流式细胞仪染色液 15或50ml尖底离心管 实验过程 1． 采集组织，用剪刀或手术刀切成2-4mm的小块； 2． 按照酶的使用说明书，加入适量用PBS稀释的酶，孵育。 3． 用移液管轻轻吹散细胞，并用滤网过滤除去成团的细胞和细胞碎片； 4． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液； 5． 用PBS重悬细胞沉淀以移除剩余的酶溶液； 6． 重复步骤4； 7． 重复步骤5和6； 8． 用流式染色液重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析； 9． 按照步骤4离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×
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检测凋亡四妙招，一招还比一招“狠”
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
第一招：雾里看花——形态学观察方法 （一）HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （二）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （三）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （四）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 第二招：原形毕露——DNA凝胶电泳 （一）检测原理：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 （二）结果判断：正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 第三招：水落石出——酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 （一）检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体； 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合； 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合； 5、加酶的底物，测光吸收制。 （二）用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的
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荧光抗体染色三大方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
1.直接染色法 将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。直接染色法的优点是：特异性高，操作简便，比较快速。缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。 2.间接染色法 如果检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体（第二抗体）与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清为第一抗体，基他步骤和检查抗原相同。 由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。 间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查求知抗体；用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照（即中间层加阴性血清代替阳性血清）。 3.抗补体染色法 抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体（待检血清）。染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如
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