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以丙肝病毒血清样本为例介绍如何提高RNA病毒核酸检测灵敏度
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
这段时间普通民众都是谈新冠病毒色变，无非印证了一句话「人们对不了解的事物才会感到恐惧」。为了减少我们的恐惧感，让我们来深入了解新闻发布会上不断提及的「新冠病毒核酸检测」吧。 首先分享中国疾控中心发布的检测新冠病毒的引物、探针序列： 推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框 1ab（open reading frame,ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针。 Target 1（ORF1ab）: 正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA 荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3' Target 2（N）： 正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' 这是个好消息，比较专业的同学一看就明白，根据上述疾控中心提供的资料合成引物探针后，再买个类似 Simgen 的 2×One Step Probe RT-PCR Mix（Cat. No. 406100）预混 RT-PCR 试剂，就可以自制新冠病毒核酸检测试剂盒了。不过问题来了，核酸检测由两块内容组成：核酸提取+PCR 检测，仅有 RT-PCR 试剂是不够的，对于病毒 RNA 检测来说，病毒 RNA 提取反而是核酸检测的重头戏：因为样本中病毒 RNA 的数量通常很低（pg 级别）且容易降解，提取过程费时费力，以至于病毒 RNA 的回收效率直接就决定了检测的灵敏度，所以才会有一些不负责任的核酸诊断试剂厂家采用了逃避手法：只提供荧光 PCR 检测试剂，让用户自己去找核酸提取方法……好吧，假如你运气不好，需要自己选择病毒核酸提取方法，此文章应该挺有价值，我们以实验室最常见的 Trizol 试剂来进行病毒 RNA 的提取。 需要说明的一点是：我们实验室不是 P3 实验室，不敢玩非冠病毒，我们还是以同样是 RNA 病毒的丙肝病毒血清样本进行测试的，请大家谅解。 一、样本、试剂与仪器 丙肝病毒阳性血清，**** 医院检验科提供，经达安基因公司丙型肝炎病毒 (HCV) 核酸检测试剂盒（P
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三级淋巴组织构筑的肿瘤免疫微环境
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
基因突变导致不受控制的细胞生长，增殖，死亡，是癌症的一个重要表现。 基因突变产生了大量的新生抗原，触发抗肿瘤的先天免疫和适应性免疫。经典理论认为针对肿瘤新生抗原的适应性免疫发生在次级淋巴器官（secondary lymphoid organs，SLOs）。 现在越来越多的研究显示，除了SLOs之外，抗肿瘤适应性免疫也发生在肿瘤内部形成的类淋巴组织中，称之为三级淋巴组织（tertiary lymphoid structures ，TLSs)，也成为异位淋巴样组织（ectopic lymphoid-like structure ，ELS)。 癌症局部的三级淋巴组织染色（文献1） 01 三级淋巴组织形成 三级淋巴组织形成（文献1） 早期浸润到肿瘤局部的淋巴细胞，以及局部的基质细胞释放趋化因子CXCL13以及促进淋巴细胞发育及功能的IL-7，招募淋巴组织诱导细胞（lymphoid tissue inducer，LTi）到肿瘤局部，LTi细胞是淋巴组织形成的关键细胞。而Th17，B细胞和M1巨噬细胞在有些情况下也可以代替LTi细胞，启动淋巴组织的形成。 LTi细胞的LTβR和基质细胞的LTα1β2相互结合，触发基质细胞分泌血管内皮细胞生长因子（VEGFC），从而促进高内皮静脉（high endothelial venule ，HEV)的发育。此外基质细胞分泌黏附分子：血管细胞粘附分子1（VCAM1），细胞间粘附分子1（ICAM1），粘膜地址素细胞黏附分子1（MADCAM1）。 LTβ–LTβR结合，以及LTi细胞分泌IL-17激活基质细胞的IL-17R，在此两重作用之下， 基质细胞分泌一些列趋化因子（CXCL12, CXCL13, CCL19，CCL21），这些趋化因子诱导淋巴细胞表达LTα1β2，且从附近的高内皮静脉招募淋巴细胞，并控制他们进入B细胞区和T细胞区。一部分Th细胞分化为Tfh细胞，协助三级淋巴组织的形成。 02 肿瘤三级淋巴组织的细胞构成和功能 三级淋巴组织的构成（文献1） 类似于次级淋巴器官，三级淋巴组织包含T细胞区和B细胞区 T细胞区：由T细胞，DC细胞和成纤维网状细胞组成 B细胞区：包含生发中心，浆细胞，抗体和肿瘤抗原形成的免疫复合
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详解动物行为学之学习记忆研究方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
学习记忆是人和动物与生俱来的能力，记忆是学习的认知侧面，二者不可分割，学习产生新的记忆，记忆承载学习过程。 学习记忆功能异常是绝大多数神经系统疾病的临床特征，如阿尔茨海默症，帕金森病，癫痫，精神分裂，脑瘫，脑卒中等。 我们一般把记忆分为短期记忆和长期记忆。而根据记忆机能系统不同，可分为参考记忆、工作记忆、恐惧记忆等；根据内容不同，可分为情景记忆、情绪记忆、动作记忆、逻辑记忆等，相关行为学就是由此为原理而产生。 1948年，心理学家爱德华·托尔曼第一个尝试研究空间内老鼠的行为。他把饥饿的老鼠放在迷宫的入口处，迷宫出口处提供食物。托尔曼观察到动物的错误率随着训练次数增加而降低。随着神经科学的快速发展，行为学已经是必不可少的研究手段，常见的学习记忆动物行为学方法如下： 1.T/Y迷宫 依据动物天生的探索习性（倾向于每次探索未探索方向），检测动物在T型/Y型迷宫中不同臂的探索情况，结合行为学记录分析软件，可以分析运动速度，穿梭次数，绘制运动轨迹等。相关的实验范式很多，有加入食物奖励的，也有加入气味/声音作为cue， 也有加入delay延迟期的，适用于工作记忆，参考记忆检测。 Y迷宫/Y-maze T迷宫/T-maze SMART3.0行为学分析系统/Panlab SMART 3.0 2.八臂迷宫/Barnes迷宫 放射性八臂迷宫，不同臂的方向可粘贴不同形状的图案提示，每个臂的尽头有食物装置，食物随机放置，或者将食物与相应图案对应起来，根据动物本能探索和取食的策略，记录动物进入每个臂的次数、时间、正确次数、错误次数、路线等参数可以反应空间记忆能力。 Barnes迷宫由周边布满孔洞的圆形平台构成，在其中一个洞的底部放置盒子作为动物的躲避场所，可使用光，噪音，风等刺激作为动物找到躲避洞口的动机。实验时将动物放在平台中央，记录动物找到目标洞口的时间，进入错误洞口的次数反应参考记忆，也可以记录重复进入错误洞口的次数反应工作记忆。 3.水迷宫 水迷宫由恒
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点突变小鼠助力红白血病发病机制研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
急性红白血病（AEL）通常涉及到髓系和红系的双谱系转化，但导致AEL的突变及维持双谱系白血病表型的细胞仍然未知。英国牛津大学Claus Nerlov教授领导的研究团队通过协同转录和表观遗传重编程，发现了白血病早期的祖细胞。中性粒细胞-单核细胞祖细胞（NMP）中CEBPA和GATA2突变分别通过增加红系转录因子（TF）的表达和产生红细胞染色质开放状态，成为红细胞白血病的启动细胞（leukemia-initiating cell,LIC）。该研究不仅揭示了AEL产生的细胞和分子机制，而且为研究AEL提供了临床前模型。这一研究成果发表在Cancer Cell杂志（IF:26.602）上。 之前的研究发现，对于急性红白血病，双等位基因CEBPA突变和GATA2 ZnF1突变存在有统计学意义的关联。这种白血病的最常见形式是双谱系，其特征是髓系母细胞和红系母细胞的存在。然而，人们目前还没有确定双谱系急性红白血病的致病突变。 在这项研究中，研究人员构建了三种小鼠模型，它们分别是携带双等位基因Cebpa和Gata2 ZnF1突变的KLG基因型、携带Cebpa突变的KL基因型以及携带Gata2突变的G基因型（表达Gata2 G320D突变的基因敲入小鼠由赛业生物构建）。他们观察到，KLG小鼠比KL小鼠更快发展成白血病（平均潜伏期8个月vs.10个月）。 濒死的小鼠出现白细胞增多、红细胞减少、血小板减少以及脾脏肿大的特征（图1）。研究人员在检查小鼠的血液涂片后发现，部分KLG小鼠（5/13）的外周血中同时存在髓系和红系母细胞（KLG-E小鼠），而其余的小鼠只存在髓系母细胞（KLG-M小鼠）。对比这两种小鼠的生存率，他们发现KLG-E小鼠的白血病进展更快。 流式细胞分析显示，白血病KLG-E小鼠骨髓和脾脏中的未成熟CD71hiTer119lo红细胞增多。这与形态学上观察到的结果一致，未成熟的白血病红系祖细胞在KLG-E小鼠的骨髓、脾脏和血液中积累。这些结果表明，双等位基因Cebpa和Gata2 ZnF1突变的组合能够诱导高度侵袭性的双谱系急性红白血病。 图1. Cebpa和Gata2 ZnF1突变协同诱导红白血病
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南京林业大学宋君龙教授：借助QCM-D联用技术探究纤维素酶生物传感器
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
一些实时、原位检测工具，如石英晶体微天平和表面等离子共振技术等能够检测在不同介质里面的信号，但由于不同介质的密度、粘度、折光率的差异，信号解析却是个难题。因此，一般都应用在介质差异可以忽略的情形，比如都是水性介质，但pH或者离子强度有差异。 近期，南京林业大学宋君龙教授课题组在Sensors and Actuators B: Chemical在线发表了题为“In-situ and real-time probing cellulase biosensor formation and its interaction with lignosulfonate in varied media”的研究论文，第一作者为博士研究生王沛沛。该论文演示了一种通用的实时和原位监测不同介质中（从乙醇到水型介质）的物质在金芯片表面形成薄膜的方法，为在变溶剂的体系中研究不同物质的相互作用提供了一种新的方法。本工作得到国家自然基金重点项目和面上项目的资助。 文章表明，石英晶体微量天平的技术结合耗散监测(QCM-D)和多参数表面等离子共振仪（MP-SPR）在相应的软件（QTools和WinSpall）和模型的辅助下，对介质差异非常大的变溶剂的吸附过程的信号也能够很好的解析。而且，结合二者技术，可以是我们对薄膜的行程过程以及后面的相互作用过程，包括吸附所需的时间、每一层薄膜的厚度、粘性和剪切弹性模量，以及每层中的结合水或溶剂含量等等，都可以很好的表征。 文献链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.129114. QCM-D技术简介： 具有耗散因子检测功能的石英晶体微天平（QCM-D）是瑞典百欧林科技有限公司的QSense产品系列的专利技术，可提供多个频率和耗散因子数据，用于测定非常薄层的吸附层的质量，并同步提供粘弹性等结构信息。耗散型石英微晶体天平技术(QCM-D)作为一种实时界面多维跟踪技术，可以对多种不同类型的界面进行实时在线无需标记的表征。 该仪器应用范围包括：食品、蛋白质、核酸，多糖等生物分子和细胞/细菌、自组装材料、生物传感器、高分子聚合物、环境膜处理、纳米颗粒、石墨烯等，从纳米到微米尺度的物质
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使用电生理光纤技术在**疼痛的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
头痛牙疼三日卧，妻看煎药婢来扶。今朝似校抬头语，先问南邻有酒无。 ——白居易《病中赠南邻觅酒》 疼痛(pain)是人一生中常遇到的不愉快感觉。它是躯体受到威胁的警报信号，是生命不可缺少的一种特殊保护功能。另一方面，它是各种疾病常见的症状表现，是当今困扰人类健康的严重问题之一。从诗中也可看出一人疼痛，需全家关照。 那除了“关照”，还有其他方法止痛吗？疼痛具体和哪些环路机制相关？疼痛研究又有哪些新的进展？ 疼痛环路研究 在近几年的研究中，科研人员逐步发现激活皮质生长抑制素中间神经元，可防止神经性疼痛发展；BLA–mPFC–PAG–脊髓通路失调、疼痛感觉与情感成分之间，存在直接因果关系；中腹丘脑核（MD），中央外侧核（CL）和束旁核（PF）参与疼痛的调控研究更加明确；GABA能神经元的γ波振荡在痛觉和情感相关的皮层区域调节其他神经元的活动，并通过PAG-RVM-脊髓轴调整伤害性感受强度。 应用新兴技术阐明疼痛的发生机制，其帮助巨大 电生理/光纤记录方法，可以证实疼痛相关离子通道的变化。单细胞测序技术可以阐述疼痛发生后相关基因表达的变化。同时基于微创精准，光遗传学技术在疼痛研究中已成为必备技术。 在前扣带皮层中，光照激活GABA能抑制性神经元大大降低了急性疼痛，使用ChR2激活兴奋性锥体神经元则显著增加了机械敏感性，而不影响炎症诱导的机械痛觉。相反，用eNpHR3.0沉默这些神经元则显示了相反的效果，即在不影响基础机械敏感性的情况下，逆转了炎症诱导的机械痛觉。同时使用类似手段激活中枢杏仁核神经元可以导致内脏疼痛的增加。 脑边缘前GABA能回路在感觉 和神经性疼痛上的调控作用 中缝背核的5 -羟色胺能神经元，是许多大脑区域的5 -羟色胺输入的主要来源，而ChR2激活此处5-HA神经元可以导致小鼠机械敏感性降低，从而支持光遗传学调节急性疼痛的有效性。 在神经病理条件下，选择性光照激活内侧前额叶皮层(mPFC)的V层神经元，在热和机械超敏性刺激模型
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肠道菌群的检测与筛选
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
最近，在Nature上有一篇题为“The gutmicrobiota is associated with immune cell dynamics in humans”的研究报告中，科学家们通过研究揭示了机体微生物菌群与免疫系统之间的关联，研究人员首次发现，血液中不同类型免疫细胞浓度的改变或与肠道中不同菌群的存在直接相关。 近些年来，研究人员也发现，肠道菌群能够直接塑造人类机体免疫系统的组成，免疫系统和微生物菌群的平行恢复也给我们提供一个机会来分析这两个系统之间的关联；这些年，研究人员一直在定期收集并分析接受BMT患者的血液和粪便样本，结果表明，科学家们能从粪便中发现很多信息，并且通过样本观察其体内菌群在不断变化。Science, Nature等也相继报道肠道菌群的重要功能：肠道菌群为人体提供营养，调节代谢，调控肠道上皮发育和诱导先天性免疫，其功能相当于人体的一个重要的“器官”，破坏肠道菌群的平衡就是损害人的健康。 据统计，每个成人身上有约1.5公斤的细菌，它们分布在口腔、皮肤、呼吸道和肠道，其中肠道有约1公斤的细菌。肠道是人体与外界沟通的桥梁，又被称“第二大脑”，是最大的免疫器官，而肠道菌群又被称为“第八大器官”、“第二基因组”，种类有1000多种，总数达3×1014个，约为人体细胞数，编码的基因约为人体基因数的150倍。婴幼儿至老年肠道菌群呈稳态变化，肠道菌群多样性和数量也日趋成熟；需氧菌逐渐减少厌氧菌逐渐增多；因此，研究肠道菌群也就成为了人类健康问题研究中不可或缺的课题。 而在众多肠道菌中如何进行筛选培养有益菌便成为了研究的关键； 分离提取 在肠道微生物实验中，样品的分离提取是首要流程；INLABTEC均质袋能够轻松、便捷和高效的分离提取样品，其巧妙地设计使称样过程简单快速，有效降低称样与均质过程中的污染风险；侧口取液方式只需移液器无菌Tip嘴接触液面取样，避免了移液器过深插入均质袋引起污染；采用侧口内置滤膜技术，有效滤过均质液中的固态颗粒，显著减少菌落计数中的杂质误判。
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动物手术中如何避免长时麻醉导致的意外
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
在动物长时麻醉中，你是否遇到过： 手术进行中，动物醒了…… 造模后，放进成像设备中，动物动了…… 一切准备妥当，准备手术时，动物体征异常或死了…… 动物手术中，麻醉维持时间长，对动物影响大，术后存活的可能性也低。虽然目前对于“长时麻醉”的界限还没有确切的定义，但一般认为长时麻醉的麻醉维持时间在60min以上。那长时麻醉到底该如何进行？ 长时麻醉常见的有静脉麻醉和吸入式麻醉两种方式，其中吸入式麻醉采用更多。 一、静脉麻醉 短效静脉麻醉药 此类药物通过持续输注，便可延长麻醉时间，维持一定的血药浓度。但有些药物，由于在体内重新分布，延长麻醉时间的同时，也会延长麻醉苏醒时间。 长效静脉麻醉药 注射长效麻醉剂可延长麻醉时间，但会带来一定的毒副作用或麻醉效能不强。 二、吸入式麻醉 可迅速麻醉和苏醒，麻醉过程易控。维持麻醉期间，只要调节合适的浓度，即可进行安全平稳的长时间麻醉。 常见的吸入式麻醉剂如异氟烷/七氟烷，几乎不参与动物肝肾代谢，可保护脏器，且易于抑制应激反应。 已有研究证明，异氟烷可充当消炎药和器官保护剂，能有效防止小鼠在长时麻醉过程中，机械通气引起的严重肺部炎症和器官损伤。 小鼠的功能磁共振成像，需保持小鼠稳定的生理状态（体温，呼吸和心率，血液pH值），防止影响功能扫描结果，即血氧水平依赖（BOLD）和脑血流量（CBF）。 使用异氟烷、或α-氯醛糖麻醉、或镇静小鼠长达两个小时，并监测其生理参数和动脉血气后，发现在保持正常体温的情况下，两种药物的呼吸速率在两个小时内下降。此外，α-氯醛糖会导致心率和血液pH值显着下降，并伴有严重的高碳酸血症。在异氟烷处理的动物中未见，异氟烷可以维持长达两个小时的生理稳定性，不会干扰某些影响BOLD和CBF结果的生理指标。 在长时间的显微神经外科手术中，理想的麻醉药物应该具备以下特点：诱导快，镇痛作用强，术中无知觉，不增加中颅内压（ICP）和脑代谢率（CMR），不影响脑
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如何理解绝对真空度和相对真空度
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
在初次接触真空产品的时候，小伙伴你们是不是有很多的问号？今天小编给大家讲解一些真空方面的知识，希望下面的内容能为您带来答案。 1、为什么真空度有的是正数，有的是负数？ 实际应用中真空度通常有绝对真空和相对真空两种说法。 绝对真空标出的数值都是正值，这个数字越小，越接近真空，也就是真空度越高。 1000mbar=1bar=100kpa=0.1MPA=750tor=750mmHg≈1atm（标准大气压） 相对真空用负值表示，这个数字的绝对值越大，则真空度越高。因为测量“相对真空”的方法简单，一般的真空表都是采用相对真空 * 0kpa=0.1Mpa≈1atm（标准大气压） * -760mmHg=0p=0atm（近似理解为压强为0，但这是无法达到的，指针转到这里时只能说明真空度超出了表的量程） 问：那么绝对真空和相对真空如何换算呢？ 答：绝对真空=相对真空+标准大气压 所以当在文献中看到需要真空度为-0.09MPa，那么它的绝对真空=-0.09+0.1=0.01Mpa 如：Rocker410 真空度-735mmHg，指的是相对真空度值，那么它的绝对真空度值=-735+760=25mmHg（30mbar、3kpa） 2、要如何选合适的抽气速度和真空度？ 极限真空度是指容器在经过充分抽气后，所能稳定达到的真空度； 真空度：真空泵的极限真空度要满足实验的压力要求，选型时应高出实验参数半个或一个数量级。如实验要求10kPa，那么泵的极限真空度至少为1~5kPa。 抽气速度是指在一定压强和温度下，单位时间内进入泵进气口的气体的量。抽气速度体现的是真空泵排出气体的能力。 可以参考下述公式： S=（V/t）×In（P1/P2） S：抽气速度 V：容器体积 t：达到真空度所需的时间 P1：初始压强 P2：需要的压强 在不同的情况下，我们需要考量的参数也是不一样的。当需要做抽滤时，如果极限压力过高，则会导致滤纸或滤膜抽破。 台湾洛科Rocker主要产品： 1、无油真空泵 2、耐腐蚀真空泵 3、培养基废液抽吸泵 4、真空过滤装置 5、三六联过滤系统 6、菌落计数器 7、COD检测仪/消解炉 8、便携式水质检测仪 更多详细www.rocan17.c
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磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
相关专题 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 磁珠法 纯化DNA原理 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。 离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子 物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性：排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子 物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子 量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～ > 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。 (2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核
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考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理、步骤及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。 实验原理 考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是： (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性**。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝
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A549（人非小细胞肺癌细胞）细胞培养的优点
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
A549（人非小细胞肺癌细胞）细胞培养的优点： 1.研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。 2.研究条件可以人为控制 pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，可以根据实际需要进行人为的控制，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。 3.研究的样本可以达到比较均一性 通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。 4.研究内容便于观察、检测和记录 采用各种研究技术：如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备 细胞特性： 1)】EB病毒转化的人B淋巴细胞；KMY0906价格组织来源于实验动物的正常眼组织。 2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。 3)经鉴定细胞纯度高于90%。 4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。 5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。 注意事项： （1）冻存前细胞状态，细胞**在对数生长期，细胞密度适合，刚刚发生细胞融合，过密或连成片的细胞状态不好，而且消化时不容易分散； （2）冻存的密度不宜过低，10的6次方-7次方的数量级比较好，我冻存的细胞一般T25培养瓶（5*107），一瓶冻一管（1.5ml冻存管），10cm培养皿（大概10的8次方个细胞）分成两管。 （3）消化和吹打，切忌胰酶消化过度，吹打不可太用力，**不要吹出好多泡泡。消化后立即加入完全培养基吹打哦，不是加入冻存液再吹打。 （4）离心后加入冻存液。冻存液中FBS的用量对于肿瘤细胞株而言要求不是很严格，我从10%-90%都用过，问题不大，个人认为10%-20%可以了，能节约处就节约点嘛！另外，冻存液可以在处理细胞前配置，放在4度冰箱
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Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书 Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒AlamaBlue 细胞活力检测试剂盒提供了一种可靠、灵敏、安全和低成本的快速有效检测细胞活力与毒性的方法。AlamaBlue 通过在细胞生长的培养基中所产生的化学还原反应，将非荧光信号的染料转换成为一红色荧光物质，试卤灵（9-羟基-3-异吩恶嗪酮7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮），从而检测细胞的存活率。维持细胞生产需要还原性环境而抑制生长则表现为氧化型环境。细胞生长率相关的降低可表现为氧化还原指示剂从氧化型（非荧光素、紫色）转为还原型（荧光素、红色）。该荧光信号可以用530~560nm 的激发波激发，在590nm 处可以获发射波，检测570 和600nm 的的吸光度值，校正监测值，可以减去相应的570nm 和600nm 的背景吸光度值。检测所产生的荧光信号是与样品中的活细胞数成正比的。 AlamaBlue 细胞活性检测试剂盒的灵敏度相似于[3H]胸苷法检测细胞增殖法。根据不同类型的细胞，AlamaBlue 可以检测到至少40个细胞，同时保证很好的重现性和灵敏度。作为试卤灵（紫红、红色荧光）可以进一步被还原为水解化的试卤灵（无色、无荧光），当细胞数量增多，所有的刃天青（7-羟基-3-羰基-0-氧化-三氢吩恶嗪）被转换为试卤灵（9-羟基-3-异吩恶嗪酮7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮），试剂盒的信号反而会发生衰减。因此，对于您所用的试剂盒来说，针对不同的细胞类型，应该调整您的细胞数，做相应的优化，才能得到更好的结果。 操作说明 以下操作可用作通用指导建议。考虑不同细胞类型与培养条件的差异性，有必要根据实际情况优化您的操作步骤。 . 96 孔细胞培养板每孔00μL 培养基饲养细胞，控制细胞数目在40~0000 个/贴壁细胞，2000~500000 个/悬浮细胞。设置空培养基做对照。 2. 加入0μL AlamaBlue 溶液至培养基中，37 度孵育：24 小时（比色法读数）；5-6 小时（荧光读数）。 3. 检测570nm 和600nm 的吸光度，或者用荧光微孔板读数530nm 激发，590nm 发射波
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大小鼠气管插管的常用方式与指导
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
气管插管常用方法介绍 气管插管法是指将特制的气管内导管经声门置入气管，进而打开呼吸道，通气供氧，保持气道通畅，防止误吸，为肺部疾病造模及给药等提供最佳条件。 大鼠气管插管常用胸部透光插管法、盲插法以及气管切开法（小鼠气管插管方法与大鼠类似）。 胸部透光插管法操作繁琐，对经验不足的操作者不够友好，插管成功率低； 盲插法成功率不高，且容易造成气道损伤，气道分泌物多，甚至会让大鼠窒息死亡； 气管切开，虽插管准确，但容易损伤颈部神经血管，造成术后局部感染和并发症，影响数据稳定，不能进行延续性研究。 常用气管插管方法误进度，耗时间，何以解忧？ 用光纤引导下的可视化气管插管法 应用于大小鼠人工气道通路建立，无创操作，便捷高效。 即插即用式体位固定，光源精准引导，一人即可操作，节约手术时长； 无创式气管插管，术后感染风险更低，动物福利更具保障。 RWD气管插管套RE20：解锁高效插管新姿势 一、大小鼠气管插管固定台 45°、60°、90°三种倾斜角度可选，多方位满足手术操作习惯； 具有角度标识，便于直观快捷不同角度选择。 二、大小鼠插管 插管采用PU材质，软硬度适中，保证手感的同时保证不伤害动物气管。 三、气管插管光纤照明系统 具有专利技术； 无线可携带； 光源可精准引导且对动物不产生热源灼伤和视觉刺激应激反应，对人视觉观察不产生干扰； 放大镜配套，助力插管精准定位。 四、气管检查镜 金属手柄气管检查镜更具质感，人性化辅助判断气管插管手术结果。 结尾 RWD气管插管套装RE20，可触达多重应用领域：细菌性肺炎模型建立、肺功能测量、肺部疾病模型、开胸类手术、动物**、动物急救，贵重动物手术保护、动物PET体内成像、心肌梗死动物手术等。
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彗星试验原理及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
体内碱性彗星试验原理及注意事项 体内碱性彗星试验在化合物遗传毒性评价中的应用日益广泛。ICH S2(R1)已将肝脏彗星试验列为第2个组织/终点的体内试验；体内哺乳动物碱性彗星试验的指导原则（TG489）也已颁布。体内碱性彗星实验能够检测DNA链断裂、碱性不稳定位点、不完整切除修复引起的DNA链的断裂，能够制成合适细胞悬液的组织DNA损伤。与其他试验相比其检测的是单细胞水平的DNA损伤，因此该试验敏感性较高，操作简单，经济省时。 实验原理 彗星实验（comet assay）也称单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一种有效评估DNA损伤的方法。其原理是器官或组织经处理（如辐射、重金属等）后，细胞中的DNA发生单链或双链断裂，经细胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在电场作用下，DNA 断片迁移出细胞核，形成彗星状的电泳图谱。正常细胞的大分子DNA在电场作用下迁移距离较短，DNA仍保留在细胞核的范围，形成圆形或轻微拖尾的图谱。根据电泳缓冲液的pH值不同，可分为中性彗星实验（pH=8.4）和碱性彗星实验（pH＞13）。中性彗星实验主要用于检测DNA双链的断裂损伤，碱性彗星实验具有更高的灵敏性，可用于检测更少量的单链和双链断裂损伤。 需要注意的是，试验过程中的个方面，包括样品准备、电泳条件、视觉分析参数(如染色强度、显微镜光强度以及使用显微镜滤镜和相机动态和环境条件(如背景照明)已经被研究，可能影响DNA迁移。 碱性彗星实验指导原则 TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals 试验能力验证 每个实验室都应证明能够为所使用的目标组织获得足够质量的单细胞或细胞悬浮液，从而在彗星试验（comet assay）中建立实验能力。汇智泰康拥有多年毒理学服务与产品研发经验，针对不同遗传毒性试验开发针对试剂盒，包括彗星试验试剂盒。首先通过%尾DNA的评价，对照处理组动物%尾DNA在低范围内。目前的数据表明,尾部DNA百分比(基于
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