-
还原糖和总糖的测定（3,5-二硝基水杨酸比色实验）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一，还原糖和总糖的测定简单介绍： 还原糖和总糖的测定原理主要是利用糖的不同溶解度，可以分别提取植物样品中的单糖，二糖和多糖，并通过酸水解将未还原的二糖和多糖降解为还原的一糖，掌握确定还原糖和总糖的基本原理，并学习如何通过比色法和分光光度计测量还原糖。 二，还原糖和总糖的测定比色原理： 还原糖的测量是定量测定糖的基本方法：还原糖是指含有游离醛或酮基的糖，单糖是还原糖，二糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的不同溶解度，可以分别提取植物样品中的单糖，二糖和多糖，并通过酸水解将未还原的二糖和多糖降解为还原的一糖。然后确定样品中还原糖和总糖的含量（就葡萄糖含量而言，为还原糖）。 在碱性条件下降低糖含量加热它被氧化成糖酸和其他产物，而3,5-二硝基水杨酸被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕色和红色物质的颜色深度成比例。使用分光光度计测量540 nm波长的光密度。检查标准曲线并计算。总糖含量。由于多糖被水解成单糖，因此分子水会加入每个断裂的糖苷键中，因此在计算多糖含量时，应乘以0.9。 三、还原糖和总糖的测定实验材料，主要仪器和试剂： 序号 名称 货号 CAS 备注 1 蔗糖 SS1498 57-50-1 2 水杨酸 SY0007 69-72-7 1.实验材料 面粉;精密pH试卷. 2.主要仪器 （1）带塞玻璃秤试管：20毫升×11 （2）大型离心管：50mL×2 (3)烧杯：100毫升×1 （4）三角瓶：100ml×1 （5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度移液器：1mL×1; 2mL×2; 10毫升×1 （7）恒温水浴 （8）开水浴 （9）离心机 （10）扭矩平衡 （11）分光光度计。
-
基因克隆实验（实验操作流程,实验方法）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、基因克隆实验操作流程： 基因克隆实验操作流程如下：首先收集基因信息——引物设计——PCR——回收目的片段——载体连接，并取得连接产物 —— 采用感受态细胞做转化 ——接菌——阳性克隆鉴定(酶切法或采用PCR)——质粒抽提——质粒测序——测序的结果分析——>克隆信息输入数据库中——质粒实物保存。 序列 产品名 货号 CAS号 备注 1 CaCl2 JT0418 10043-52-4 2 MgCl2 JT2113 7786-30-3 3 Agarose SF0014 9012-36-6 4 EB buffer HC1644 5 LB培养基 HC1007 6 1000ul蓝吸头 FT-1000 7 200ul黄吸头 FT-200 8 2ml圆底连盖离心 F-EP020 9 1.5ml尖底连盖离心管 F-EP015 二、基因克隆实验方法： 2.1 j基因克隆实验设计引物 引物设计要求：引物长度为25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm，为70℃(±4℃)，且两条引物的Tm 相差不超过4℃。引物之间及引物本身避免形，成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板不能有任何错配。 forward primer 5’加: GGCCAATCCGGCC reverse primer 5’加: GGCCTCTAAGGCC 2.2 PCR 2.2.1 PCR 反应体系 模扳(100ng/ul 质粒) 2.00μl 4dNTP(10mM) 1.00μl 10×PCR Buffer 5.00μl MgCl2(25mM) 5.00μl 5’Primer (10-12uM) 4.00μl 3’Primer (10-12uM) 4.00μl 5M 甜菜碱 10.00μl Pfu (5U/ul) 0.50μl ddH20 18.50μl 总计 50.00μl 2.2.2 PCR 反应过程 1)从cDNA 文库克隆基因 Stage1 Stage 2 Stage3 1 Cycle 30Cycle 1 Cycle 95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 30sec 30 sec Xmin(2min/Kb) 10min 1min 备注：
-
核酸类药物研究的知识分享(核酸类药物类型,核酸类药物介绍,核酸类药物特征)
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
核酸类药物介绍 ※ 核酸是所有已知生命形式必不可少的生物聚合物或大生物分子。 核酸术语是DNA和RNA的总称，它们由核苷酸组成，核苷酸是由三部分组成的单体：5-碳糖，磷酸基、含氮碱基。 如果糖是复合核糖，则聚合物是RNA（核糖核酸）； 如果糖是从核糖中脱氧核糖衍生而来，则聚合物为DNA（脱氧核糖核酸）。 ※“核酸药物”利用“核酸”（指控制遗传信息的DNA和RNA等物质）作为药物。这些可以靶向分子，例如传统的低分子量药物和抗体药物无法靶向的mRNA和miRNA，因此人们对这些药物作为下一代药物抱有很高的期望。由于预计将导致以前难以**的药物的产生，因此正在全球范围内进行积极的研究。 ※ 另一方面，已经指出，核酸药物的开发有待解决的问题，包括“（i）体内核酸分子的不稳定性”，“（ii）对药物不良反应的关注”和“ （iii）药物输送系统（DDS）的困难。”此类药物主要由于欧美公司垄断了核酸的主要专利，国外日本公司在核酸药物的开发方面落后了一步，从而干扰了日本的发展。 核酸药物的特征： “核酸药物”是下一代药物发现技术，其作用机理与传统药物完全不同。 它还具有能够以中等大小的分子轻松制造的能力，并具有超越抗体药物的功效和安全性的潜力。 由于这些特征，期望将核酸药物用于以前难以**的癌症和遗传性疾病以及诸如流感和病毒感染的疾病中。 核酸药物的主要类型： ※ 利用DNA和RNA的核酸药物包括在从基因组DNA合成蛋白质的阶段靶向核酸的药物（例如mRNA和miRNA）和靶向蛋白质的核酸药物。 核酸类药物的类型和特征（预防和**药物）： 根据靶标和作用机理，存在具有不同类型和特征的核酸药物： Type Target Site of action Mechanism of action Summary siRNA mRNA Inside the cell (cytoplasm) mRNA cleavage Double-stranded RNA with cleavage of mRNA homologous to the sequence (siRNA), single-stranded hairpin RNA (shRNA), etc. with effect according to
-
核苷酸知识分享
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
什么是核苷酸？要回答这个问题，我们需要在生物化学方面进行简短的学习。 核苷酸是由核苷和磷酸盐组成的有机分子。 它们是核酸聚合物脱氧核糖核酸和核糖核酸的单体单元，两者都是地球上所有生命形式中必不可少的生物分子。 核苷酸由三个亚基分子组成：含氮碱基，五碳糖和由一到三个磷酸酯组成的磷酸酯基团。DNA中的四个含氮碱基是鸟嘌呤，腺嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶； 在RNA中，使用尿嘧啶代替胸腺嘧啶。 核苷酸是制造新的DNA和RNA所必需的构件。接下来，当我们了解DNA的双螺旋结构时，我们需要回想起高中。还记得带有不同颜色梯级的螺旋形梯子吗？那是构成我们所有人中发现的基因和染色体的DNA模型。 DNA是一个非常大的分子，DNA阶梯的梯级由两个不同核苷酸的组合组成。核苷酸是称为鸟苷和胞嘧啶的分子，它们配对在一起，或者是腺苷和胸苷，也配对。腺苷和鸟苷被称为嘌呤。胞嘧啶，胸苷和尿嘧啶被称为嘧啶。 RNA与DNA相似，不同之处在于，该分子对中的分子尿嘧啶替代了胸腺嘧啶，而RNA是DNA与蛋白质之间的中间产物。基因是DNA核苷酸的离散序列，而基因则构成我们的染色体，因此，基因是由DNA构成是有道理的。 尽管所有这些听起来都是非常技术性的概念，但您需要了解的是核苷酸是创建新的DNA和RNA分子所必需的分子，然后新的DNA和RNA分子将被各种新型细胞使用。这很重要，因为核苷酸本身或与其他分子结合都参与细胞（以及身体）的几乎所有活动。 那么，到底什么使核苷酸如此重要呢？为了人类或其他动物继续生存，生长和发育，它必须一直创造新的细胞，以替代垂死的细胞。每分钟必须制造数百万个细胞，以保持身体的健康。这些细胞都必须使用核苷酸来制造新细胞，依靠DNA和RNA来正确繁殖细胞。核苷酸用于产生细胞，替换细胞，包括发育中的免疫细胞，发育中的精子细胞和支持女性生殖道。 哪些组织和细胞需要最大数量的核苷酸？尽管所有细胞都需要大量核苷酸，但是这些细胞，包括红细胞，白细胞，肠细胞，骨髓细胞和某些脑细胞
-
核苷酸生物化学知识
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
核苷酸的分子结构中包含有连接至糖和磷酸基团的含氮碱基，有磷酸集团和核苷构成。核苷酸对人和动物非常重要，核苷酸是控制人和动物遗传特征的有效物质的核酸的重要组成部分。 在两个核酸家族类化合物中，分为：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA），DNA或RNA中的核苷酸序列编码细胞中合成蛋白质的结构。 核苷酸三磷酸腺苷（ATP）提供了许多代谢过程的驱动力。 几个核苷酸是辅酶，它们与酶一起作用来加速（催化）生化反应。 几乎所有核苷酸的含氮碱基是三种杂环化合物的衍生物：嘧啶，嘌呤和吡啶。 最常见的氮碱基是嘧啶（胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶），嘌呤（腺嘌呤和鸟嘌呤）和吡啶烟酰胺。 核苷与核苷酸相似，不同之处在于核苷缺少磷酸基团，核苷本身很少参与细胞代谢。 单磷酸腺苷（AMP）是RNA的成分之一，也是载能分子ATP的有机成分。 在某些重要的代谢过程中，AMP与无机磷酸盐结合形成ADP（二磷酸腺苷），然后形成ATP。 ATP中磷酸酯键的断裂释放出大量能量，这些能量在驱动化学反应或收缩肌肉纤维中被消耗。 环状AMP，另一个核苷酸，参与调节细胞代谢的许多方面，例如糖原的分解。 二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）与相关化合物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）一起作为电子载体参与许多氧化反应。 这些物质充当某些酶的辅助因子。 按照化学结构式核酸类药物及衍生物分类： ※ 碱基及衍生物； ※ 核苷及衍生物； ※ 核苷酸及衍生物； ※ 多核苷酸。 本文主要介绍的核苷酸及衍生物： ※ 单核苷酸类：腺苷酸（AMP）、尿苷酸（UMP）、肌苷酸（IMP）、环腺苷酸（cAMP）、双丁酰环腺苷酸（DBC）、辅酶A（CoA）等； ※ 二核苷酸类：脲二磷酸葡萄糖(UDPG)；胞二磷胆碱(CDP-Choline)； ※ 核苷三磷酸类：腺三磷(ATP)；胞三磷(CTP)；脲三磷(UPT)；鸟三磷(GTP)； ※ 核苷酸混合物：5-核苷酸；2,3-核苷酸；脱氧核苷酸等等。 核苷酸类三磷酸衍生物-BIOFOUNT已经为各大科研机构、药企研发合成超过几百种核苷酸类化合物：
-
核酸知识分享
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
核酸属于天然存在的化合物，可以分解产生磷酸，糖和有机碱（嘌呤和嘧啶）的混合物。 核酸是细胞的主要信息携带分子，通过指导蛋白质合成过程，核酸决定了每种生物的遗传特征。 核酸的两个主要类别是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 DNA是生命的主要蓝图，是所有自由生物和大多数病毒的遗传物质。 RNA是某些病毒的遗传物质，但也存在于所有活细胞中，RNA在某些过程中（例如蛋白质的制备）起着重要作用。 本文介绍了核酸的化学性质，描述了允许其充当遗传信息传递者的结构和特性： 一、核苷酸：核酸的组成部分： 1.核苷酸的基本结构 ※ 核酸是多核苷酸，即由一系列几乎相同的称为核苷酸的结构单元组成的长链分子。每个核苷酸由连接到戊糖（五碳）糖上的含氮芳香族碱基组成，该糖又连接到磷酸基团上。每个核酸包含五个可能的含氮碱基中的四个：腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C），胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。 A和G归类为嘌呤，C，T和U统称为嘧啶。所有核酸均包含碱基A，C和G；但是，T仅存在于DNA中，而U存在于RNA中。 DNA中的戊糖（2'-脱氧核糖）与RNA中的戊糖（核糖）的不同之处在于，糖环2'碳原子上没有羟基（-OH）。没有附着的磷酸基团，附着在碱基之一上的糖被称为核苷。磷酸基团通过将一个糖上的5'-羟基桥接到链中下一个糖的3'-羟基来连接连续的糖残基。这些核苷键称为磷酸二酯键，在RNA和DNA中相同。 2.生物合成与降解 ※ 从细胞中容易获得的前体合成核苷酸。嘌呤和嘧啶核苷酸的核糖磷酸部分均通过磷酸戊糖途径由葡萄糖合成。首先合成六原子的嘧啶环，然后将其连接到核糖磷酸上。在腺嘌呤或鸟嘌呤核苷的组装过程中，嘌呤中的两个环是在与核糖磷酸相连的同时合成的。在这两种情况下，最终产物都是带有磷酸酯的核苷酸，该磷酸酯附着在糖的5'碳上。最后，一种称为激酶的特殊酶使用三磷酸腺苷（ATP）作为磷酸供体将两个磷酸基团加在一起，形成核糖核苷三磷酸（RNA的直接前体）。对于DNA，从核糖核苷二磷酸中
-
大肠杆菌检测方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、大肠菌检测实验介绍: 大肠菌属细菌是一组革兰氏阴性非细菌细菌，可以发酵乳糖，产生酸和气体，需氧和兼性厌氧菌。该细菌主要来源于人和动物的粪便，因此可将其用作粪便污染的指标，以评估食品卫生质量，推断出食物中肠道致病菌受到污染的可能性。食物中大肠菌的数量表示为100毫升（g）样品中最可能的大肠菌（MPN）数量。 二、实验所需仪器及试剂： 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 90*15mm培养皿 FM-90-X 2 三聚氰胺琼脂 108-78-1 JQ2301 3 标准革兰氏染色液 HC0448 4 结晶紫染色液 548-62-9 SX0037 5 95％乙醇 64-17-5 JT26000 6 1％草酸铵水溶液 6009-70-7 JT12066 7 碘 7553-56-2 JH0093 8 碘化钾 7681-11-0 JT0900 9 皂苷 7518-22-1 YZM013539 2.1恒温培养箱：36±1℃。 2.2 1000ml锥形瓶，1ml，10ml移液器。 2.3接种针。 2.4显微镜。 2.5超干净的工作台。 2.6幻灯片，酒精灯，洗耳灯泡，试管架。 2.7余额：0.01克。 2.8消毒锅。 2.9将培养皿（直径90mm）和试管在121°C灭菌30分钟。 2.10试管夹，酒精灯，秒表，载玻片3。培养基和试剂： 3.1乳糖胆盐发酵管：按照制造商的说明进行准备和消毒。 3.2曙红三聚氰胺琼脂平板：根据制造商的说明进行准备和灭菌。 3.3乳糖发酵管：按照制造商的说明进行准备和消毒。 3.4革兰氏染色液。 3.4.1结晶紫染色液： 水晶紫1g 95％乙醇20ml 1％草酸铵水溶液80ml 三、实验步骤 将结晶紫溶解在乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 3.4.2克氏碘溶液：碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml 首先将碘和碘化钾混合，加入少许蒸馏水，摇匀，完全溶解后，加入蒸馏水至300毫升。 3.4.3沙皇复染溶液：沙黄色0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水90ml、将皂苷溶
-
淀粉酶活性的测定
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、淀粉酶活性的测定实验原则： ※ 淀粉酶（淀粉酶）包括几个具有不同催化特性的成员。其中，α-淀粉酶随机作用在淀粉的非还原端上，产生麦芽糖，麦芽三糖，糊精等还原糖，同时降低淀粉浆的粘度。因此，它也被称为液化酶。每次β-淀粉酶都会从淀粉的非还原端切割出一个麦芽糖分子，也称为糖化酶。葡萄糖淀粉酶每次都从淀粉的非还原末端切出一个葡萄糖。由淀粉酶产生的这些还原糖可以还原3，5-二硝基水杨酸以产生棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活性的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖绘制标准曲线，并且可以通过比色法确定由淀粉产生的还原糖的量。在一定时间内每单位重量样品产生的还原糖量表示酶活性。 ※ 淀粉酶几乎存在于所有植物中，尤其是发芽后谷物种子的淀粉酶活性最强，主要是α-和β-淀粉酶。 α-淀粉酶不耐酸，在pH 3.6以下会迅速失活； β-淀粉酶不耐热，在70°C灭活15分钟。根据它们的特性，当其中一个在测量过程中被停用时，可以测量另一个的生命力。在该实验中，通过加热使β-淀粉酶失活来测量α-淀粉酶的活性，然后通过与在非钝化条件下测得的总活性（α+β）进行比较来确定β-淀粉酶的活性。 二、淀粉酶活性的测定材料，仪器和试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 麦芽糖 6363-53-7 SS1502 2 3,5-二硝基水杨酸 609-99-4 JT16120 3 氢氧化钠 1310-73-2 JT8650 4 酒石酸钾钠 6381-59-5 JT12079 5 柠檬酸 77-92-9 SY0004 6 柠檬酸钠 68-04-2 JSH68496 7 石英砂 14808-60-7 JT0063 8 淀粉酶 9000-92-4 SS2216 （1）材料：发芽的小麦种子（芽长约1cm）。 （2）仪器：1.分光光度计； 2.离心机； 3.恒温水浴（37°C，70°C，100°C）； 4.试管带有塞子刻度； 5.刻度移液器； 6.容
-
PEG沉淀实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、PCR产物纯化方法--PEG沉淀实验简介： PEG沉淀主要是探索一种可大量，廉价且纯度较高地纯化PCR产物的方法，**去除200 bp以下的小DNA片段以进行DNA筛选。 二、PCR产物纯化方法--PEG沉淀实验所需试剂： 96孔PCR板、NaCl、PEG8000、离心管、离心机、EtOH、ddH2O 三、PCR产物纯化方法--PEG沉淀实验步骤 96孔PCR板操作。 1.加入20μLPCR产物5μL5M NaCl（终浓度0.5M）； 2.加入25μL的24％PEG8000溶液（最终浓度为12％）；拌匀 3. 4度放置30分钟； 4. 4500xg，在4度离心30min后，立即将板扣在厚吸收纸上，离心至150xg，除去上清液； 5.加入70μL的75％EtOH，4500xg，在4度下离心15分钟，立即将其快速吸附在厚吸水纸上，离心至150xg，除去上清液；重复一次； 6.在50度或室温下干燥，添加10μLddH2O溶解，这是纯化的PCR产物。站立时以1μL为模板。 四、PCR产物纯化方法--PEG沉淀实验注意事项： 1.该方法可直接用96孔PCR板操作，可大量纯化PCR产物，纯化率更高，可去除300bp以下的PCR产物。但纯化产物会包括不想要的扩增产物、未消耗的引物等，从而引起干扰。 2.用这种方法纯化的成本非常低，PEG8000，NaCl，醇几乎是常规的实验室试剂，比96孔板纯化试剂盒便宜得多，另一个突出的优点是可以除去200bp以下的片段。 3.该方法有点不利于产量的增加，适用于纯化后不需要很多的DNA实验。 五、PEG沉淀实所需试剂清单： 1 1.5ml尖底连盖离心管 F-EP015 2 2ml圆底连盖离心管(灭菌） F-EP020-H 3 96孔无裙边PCR板，透明 F-PCR-96W 4 NaCl JT0001 5 PEG8000溶液(无菌) HC1091
-
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）简介： ※ 染色质免疫沉淀技术（染色质免疫沉淀测试，CHIP）是目前研究体内DNA与蛋白质之间相互作用的唯一方法，其基本原理是将蛋白质-DNA复合物固定在活细胞状态，使其随机截面为一定长度内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀该复合物，以富集靶蛋白的结合，通过纯化和检测目标探针，确定的方式通过DNA片段获得有关蛋白质与DNA相互作用的信息。 二、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）所需材料及试剂： 离心管、离心机、甲醛、甘氨酸、PBS、SDS裂解缓冲液 三、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）步骤 （A）将细胞的甲醛交联并超声处理。 1.取出一个平板电池（10厘米平板），添加243 ul 37％甲醛，以使甲醛的终浓度为1％（培养基为9ml）。 2. 37秒10分钟。 3.终止交联：加入甘氨酸至终浓度0.125M。在培养皿中加入450ul 2.5M甘氨酸。混合后，可以在室温下放置5分钟。 4.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤细胞两次。 5.细胞刮板将细胞收集在15ml离心管中（PBS为5ml，3ml和3ml）。预冷却后，以2000 rpm收集细胞5分钟。 6.倒出上清液。根据细胞数量，添加SDS裂解缓冲液，由于最终细胞浓度为每200ul 2 x 106个细胞，每100ul溶液包含1 x 106个细胞，然后添加蛋白酶抑制剂复合物，假定MCF7杂草丛生的板为5×106个细胞，这次细胞生长到大约80％，即4×106个单元，因此，向每个试管中加入400ul SDS裂解缓冲液。将2管混合在一起，总共800ul。 7.超声波破碎：VCX750，25％功率，冲击4.5S，间隙9S， 14次。 四、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）注意事项： 最重要的一点是抗体的性质，不同的抗体和抗原结合能力也不同，在IP反应中可能不使用无染料结合，一定要仔细检查抗体的使用说明书，尤其是多克隆抗体可能是问题所在；其次，注意溶解抗原的缓冲液的性质，大多数抗原是由细胞组成的蛋白质，尤其是骨架蛋白质，必须溶解缓冲液，否则，必须使用含有强表面活性剂的缓冲液，尽管它可能会影响某些抗原和抗体的结
-
如何使FISH达到最佳效果
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验原理 FISH检测对被测样本没有特殊的要求。可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。 二、样本的老化（目的是为了使FISH达到最佳效果） 1. 将样本片子放入2×SSC 37℃1小时 2. 将片子放入新制的胃蛋白酶工作液中（20ul 10%胃蛋白酶溶液中加入40ml0.01NHCl）37℃13分钟 3. 用磷酸盐平衡液（PBS）室温下清洗5分钟 4. 将片子放入快速固定液（0.95%甲醛：1ml的37%甲醛，0.18gMgCl2和39ml的PBS，4℃保存，一个月内使用）室温5分钟 5. 在室温下用PBS清洗5分钟 6. 晾干片子。为了加速晾干可以用带棉塞的巴氏移液管吹打玻片 7. 将片子浸泡在70%的乙醇中。用乙醇冲洗1分钟 8. 从70%乙醇中取出，依次放入85%、100%乙醇中重复以上步骤 9. 根据需要降解片子 三、实验所需试剂和耗材： 序列 产品名 货号 CAS号 备注 1 胃蛋白酶 HC0767 2 MgCl2 JT2113 7786-30-3 3 乙醇 CCF12679 127852-29-3 4 FT-200 200ul黄吸头 5 F-EP020 2ml圆底连盖离心
-
碱裂解法提取质粒DNA
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验目的 1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法； 2、了解制备原理及各种试剂的作用。 二、实验原理 碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。 质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、实验方法 1）材料 含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架，枪头及盒、卫生纸。 2）设备 微量移液器(20μl，200μl，1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。 3）试剂准备 1、 LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。 2. 氨
-
硝酸银染色
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、硝酸银染色简单介绍 ※ 银染的方法很多，文献报道有一百多种。但是，确切的染色机理仍不清楚。一般原则是在碱性pH值环境中，银离子将还原为金属银，并且蛋白质表面将被着色。 ※ 由于银染的高灵敏度，其在凝胶上的斑点小于1 ug /蛋白质斑点，因此在二维凝胶分析中被广泛使用。找到目标蛋白斑点后，通过测试染色富集目标斑点，然后进行进一步的肽指纹分析（PMF）或序列确定。随着质谱技术的不断改进和发展，银染后直接测量 mol蛋白斑点并不困难。这是一种与质谱兼容的银染方法。 二，实验步骤如下： 实验步骤 溶液(250毫升 每 gel) Gel-Type 1.固定 量取25毫升 acetic acid, 100毫升 甲醇 125毫升 milli-Q 水 1摩 unbacked 2x15 最少 1摩 on film or glass support or 1.5 unbacked 2x60 最少 2.敏化 量取75毫升甲醇, 0.5g Na2SO3, 17g NaAc, milli-Q 水 to 250毫升 30 最少 60 最少 3.漂洗 取250毫升 milli-Q 水 3x5 最少 5x8 最少 4.银染 取0.625g AgNO3, milli-Q water to 250毫升 20 最少 60 最少 5.漂洗 取250毫升 milli-Q 水 2x1 最少 4x1 最少 6.显色 取6.25g Na2CO3 , 100μ formaldehyde, milli-Q 水 to 250毫升 4 最少 6 最少 7.终止 取3.65g EDTA；milli-Q 水 to 250 毫升 10 最少 40 最少 8.漂洗 取250毫升 milli-Q 水 3x5 最少 2x30 最少 三、硝酸银染色液使用注意事项： 1.许多银染程序都使用戊二醛，可以提高银染的敏感性和染色结果的再现性，但是由于戊二醛可以修饰蛋白质，因此会影响质谱鉴定和蛋白质斑点的分析； 2.确保所有的染色容器都绝对干净，可以使用玻璃或塑料作为染色容器。 3.水的纯度对染色结果的质量有很大影响，应至少使用两次蒸馏水（电导率
-
血清脂类测定方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、血清脂类测定方法简单介绍： ※ 目前，仅将脂蛋白中总胆固醇的测定方法作为脂蛋白的定量依据，即确定HDL，LDL或VLDL中的胆固醇，它们被称为高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。 ）和低密度脂蛋白。 胆固醇（LDL-C）或极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）。这种类型的测量方法目前在临床中广泛使用，快速且相对准确。 shielding屏蔽直接测量法使用脂蛋白中的特定抗体和其他物质首先保护血浆中的LDL和VLDL免受胆固醇测量试剂的影响，同时无需离心分离直接测量未封装的HDL中的胆固醇在这种情况下，测定胆固醇含量HDL的速度快而准确。它是近年来发展起来的一项新技术，值得推广和应用。 ※ 测定血清总脂质血清总脂质主要包括FC，CE，PL和TG。除了帮助诊断脂质代谢紊乱和相关疾病外，血清总胆汁淤积还可以用于总脂质增加的原发性胆汁酸肝硬化，肾病综合征或急慢性肝炎以及总脂质降低的严重肝炎，肝硬化以及其他严重的肝脏损害，恶病质，甲状腺功能亢进和吸收不良综合征等疾病。总血脂通常随年龄增长而增加，40岁以上的人血脂显着增加，65-70岁的人血脂降低。不同的测量方法在正常参考值上有一定差异。测量方法有两种：一种是提取方法，通过脂质提取剂将血清脂质引入培养基中，然后进行定量。另一种是直接测量方法，即不需要提取。实验步骤如下： 1.脂质提取方法脂质存在于血清脂蛋白中。使用甲醇或乙醇分离与蛋白质结合的脂质，并使用甲醇或乙醇的非极性有机溶剂溶解脂质。非极性溶剂（例如Bloor溶剂（醚：酒精1：3，V / V）或FovCh溶剂（氯仿：甲醇2：1，v / V），醚氯仿的混合物可以改善脂质和蛋白质的切割结合能力达到提取目的。将血清脂质提取到有机溶液中后，将其蒸发至干，除去有机溶液，并通过加热进行氧化，然后对颜色进行定量。 2.直接脂质测定法，如磺基-磷酸-香兰素法，是在血清中加入浓硫酸加热，冷却后，加入试剂显色（即SPV反应）直接测定血清中总脂质。 三，胆固醇的测定： 血清中的胆固醇包括CE和FC，酯型CE占70
-
HE染色石蜡切片的制作
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、HE染色石蜡切片简介 二、HE染色石蜡切片制作所需材料及试剂设备用具： 切片机、恒温箱、溶蜡箱、玻璃缸、载玻片、盖玻片、手术刀片、镊子、包埋盒。试 剂 ：10％福尔马林、酒精、二甲苯、固体石蜡、苏木精、酸水、氨水、酒精伊红染色剂型、加拿大树胶 三、HE染色石蜡切片制作步骤: 1.取材与固定取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。2.脱水透明 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。3.浸蜡包埋将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。4.切片与贴片： 将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。5.脱蜡 常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。6.染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。②酸水及氨水中分色，各数秒钟。③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。7.脱水透明： 染色后的切片经
咨询热线
18133906270
德尔塔官方微信