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抗体保存知多少
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
通常情况下，抗体经恰当保存和处理，大多数应能保持活性数月乃至数年。当然，不同类型抗体，其保存的方法也可能不一样，以下就抗体的保存，提供一些参考！ 一、保存温度和条件 对于很多抗体而言，保存在-20℃是完全足够了，没有任何证据显示保存在-80℃会有更多的好处！分装成小等份可最大程度减少由冻融造成的损伤，以及从单个试剂瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需冻融一次，如有剩余，可将剩余物保存于 4oC. 在收到抗体时，在 10,000 × g 下离心 20 秒以沉积截留于试剂瓶螺纹的溶液，并以小等份转移至低蛋白结合微量离心管中。小等份的量取决于实验人员在实验中通常采用的量。小等份应不小于10 µl; 等份越小，储液浓度因抗体蒸发及吸附于保存瓶表面而受到的影响越大。 在大多数情况下，收到抗体时在 4oC 下保存一至两周，然后再冷冻进行长期保存是可接受的，但也许腹水液是例外，它可能包含蛋白酶，因而应该尽快冻存。同样，遵照说明书上的建议是重要的。 大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在4℃的条件下来完成的。 对于特殊的抗体，如酶、荧光素等偶联抗体、IgG3同型抗体等抗体的保存有其注意事项： 1、偶联抗体 酶偶联抗体不应冻存，而应保存于 4oC. 冻融不仅影响抗体结合能力，还会降低酶活性。无论偶联至荧光染料、酶还是生物素，偶联抗体都应保存于深色试剂瓶中或用金属箔包裹. 暴露于光线中将损害偶联物的活性。特别是荧光偶联物易受到光漂白影响，在实验的所有阶段都应避光。 2、IgG3的同型对照 保存在4℃，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体 二、用叠氮化钠防止污染 为了防止微生物污染，可将叠氮化钠加入抗体制备品中达到0.02% (w/v). 的终浓度。但是有时不能使用叠氮化钠，有以下两中情形： (1)、如果用抗体染色或处理活细胞，或如果用抗体进行体内研究，一定要使用不包含叠氮化钠的制备品。该抗菌剂也对大多数其它生物具有毒
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选择合适的二抗，不再纠结！
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
当你徘徊在如何选择二抗，或不知怎样选择最合适的二抗时，你的眼神告诉我，你纠结了，但是这不是你的错。而当看完以下内容，你将不会再纠结，否则，那将是我的错。 1. 弄清一抗的宿主物种是什么 二抗指向一抗的物种。如果使用来源于兔的一抗，则需要来源于除兔以外的其它物种的抗兔二抗。例如山羊多克隆抗兔IgG 二抗可以检测兔多克隆抗 Ki67 一抗。换言之，二抗的宿主物种要求与一抗的宿主物种不同，而且种属亲缘关系越远越好。 2.了解一抗蛋白类型 二抗必须指向一抗同型。 多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴，并且是IgG 同型。二抗通常为抗 IgG 重链和轻链的抗体。单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠。例如，如果单克隆一抗为小鼠 IgG1，则 需要抗小鼠 IgG 或特异性较低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG。 人免疫球蛋白类、亚类、型和亚型： · 类或同型：IgG (γ heavy chains), IgM (μ), IgA (α), IgE (ε), IgD (δ) · 亚类： IgG1 (γ1 heavy chains), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4); IgA1 (α1), IgA2 (α2) · 型：κ light chain, λ light chain · 亚型： λ1, λ2, λ3, λ4 其它类型的反应： · 多价抗体与所有免疫球蛋白类反应 · 抗 Fc 或重链 (α, δ, ε, γ, and μ) 抗体仅与重链反应 · 抗 F(ab) 或完整分子抗体与重链和轻链反应，而与免疫球蛋白类无关 · 由于所有免疫球蛋白类均使用相同的 κ 和 λ 轻链，因此抗轻链（κ 和 λ）抗体 与所有免疫球蛋白类反应 3. 需要酶学或荧光检测吗？ 偶联类型是依赖于应用的。 对于酶学和生物素检测，例如，在 WB 或 ELISA 中，建议将二抗偶联于 HRP, AP 或 生物素。不论抗体宿主物种是什么，抗生物素蛋白和链霉亲和素与生物素的结合作用均很强，并且均能使信号放大。 如果使用了激光，例如，在流式细胞术、ICC/IF 或 IHC 中使用时，则建议将二抗偶联于荧光染料进行荧光检测。 4.有必要使用 F(ab) 或 F(ab')2片段抗体吗？ F(ab) ) 和 F(ab')2片段抗体消除了抗体 Fc 部分与细胞（如巨
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抗原和抗体浓度的优化-免疫斑点实验
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
对于一个给定的抗原，最佳的抗体浓度依赖的抗原和抗体本身。抗原和抗体的亲和力，以及一抗与二抗的特异反应都是不同的。最优抗原和抗体浓度可通过免疫印迹实验中使用不同浓度的抗原和抗体作用确定。另外，更快和更简单的方法是进行斑点印迹实验。 以下是使用超敏感信号底物进行的斑点印迹的操作方法： 1、 用TBS和PBS稀释的蛋白样品，好的稀释方法是由样品中的抗原稀释浓度决定的，但是由于抗原的浓度是未知的，所以有必要进行宽范围的稀释度的检测。SuperSignal West Pic化学发光底物的检测灵敏度可达皮g水平，所以样品的稀释范围可以从微克水平到皮克水平。如果要使用过多的抗原，结果会出现以下情况：非特异性条带、模糊条带和信号降低。 2、准备转印膜。所需膜的数量依赖于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少种不同稀释浓度。通常，一种或两种一抗的稀释度是用两种或三种不同的二抗稀释度进行测定的。例如：1/1000的一抗和1/50000的二抗；1/1000的一抗和1/100000的二抗；1/5000的一抗和1/50000的二抗；以及1/5000和1/100000的二抗。 3、将膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。用尽可能小量的稀释液点在膜上（2-5 ul为宜），因为用的体积越大，信号越弥散。抗原溶液在膜上干10-30分钟或直至无可见的水分。 4、用含0.05%的Tween-20封闭液封闭膜上的非特异性点，室温震荡孵育1 h。 5、将一抗稀释到封闭液/Tween-20去污剂中，并加到膜上，室温震荡孵育1h。 6、用TBS或PBS洗膜4-6次，用尽可能大体积的洗脱液，在洗脱液中加入0.05%的吐温，用以减少非特异背景。每次洗脱过程中，使膜悬浮在洗脱液中震荡大约5分钟，倒出洗脱液并重复。孵育前，在洗脱液中短时间的漂洗可能会增加洗脱效率。 7、制备二抗/HRP结合的封闭试剂/Tween-20去垢剂稀释液，将二抗稀释液加到膜上震荡孵育1 h。 8、按第6步方法再次清洗膜。 9、准备底物工作缓冲液，混合等体积的鲁米诺/增强剂和稳定的过氧化物溶液。制备足够体积确保印迹点完全湿润，保证印
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流式实验即将开始，“分析样品”你准备好了？
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
一、细胞的准备 试验一：组织培养细胞的细胞准备 材料 完全培养基 流式细胞仪染色液 15或50ml尖底离心管 实验过程 1． 对于悬浮培养的细胞，把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，然后进入步骤3； 2． 对于贴壁培养的细胞，用完全培养基从培养皿上吹起并吹散细胞凝聚物，然后把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，进入步骤3； 3． 离心细胞然后用流式细胞仪染色液重悬细胞使其终浓度为2×107个细胞/ml。 试验二：淋巴组织的细胞准备 材料 60×15 mm 组织培养皿 3 ml注射器 细胞滤网（血液尼龙滤网） 流式细胞仪染色液 15或50ml尖底离心管 实验过程 1． 采集组织（采集组织（脾，淋巴结，胸腺）放进一个细胞培养皿中，用3 ml注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液，此过程用10ml的染色缓冲液； 2． 加入10ml染色液收集细胞，使细胞悬液通过尼龙滤网以除去成团的细胞和细胞碎片，收集细胞悬液于尖底离心管中； 3． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液； 4． 重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析； 5． 按照步骤3离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。 试验三：非淋巴组织的细胞制备 材料 剪刀或者手术刀片 PBS 60×15 mm 组织培养皿 3 ml注射器 细胞滤网（血液尼龙滤网） 流式细胞仪染色液 15或50ml尖底离心管 实验过程 1． 采集组织，用剪刀或手术刀切成2-4mm的小块； 2． 按照酶的使用说明书，加入适量用PBS稀释的酶，孵育。 3． 用移液管轻轻吹散细胞，并用滤网过滤除去成团的细胞和细胞碎片； 4． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液； 5． 用PBS重悬细胞沉淀以移除剩余的酶溶液； 6． 重复步骤4； 7． 重复步骤5和6； 8． 用流式染色液重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析； 9． 按照步骤4离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×
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检测凋亡四妙招，一招还比一招“狠”
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
第一招：雾里看花——形态学观察方法 （一）HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （二）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （三）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （四）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 第二招：原形毕露——DNA凝胶电泳 （一）检测原理：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 （二）结果判断：正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 第三招：水落石出——酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 （一）检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体； 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合； 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合； 5、加酶的底物，测光吸收制。 （二）用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的
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荧光抗体染色三大方法
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
1.直接染色法 将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。直接染色法的优点是：特异性高，操作简便，比较快速。缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。 2.间接染色法 如果检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体（第二抗体）与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清为第一抗体，基他步骤和检查抗原相同。 由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。 间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查求知抗体；用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照（即中间层加阴性血清代替阳性血清）。 3.抗补体染色法 抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体（待检血清）。染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如
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免疫组化染色中“杂音”染色片的种类及解决办法
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。 1、全片着色 全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有： （1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。 （2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，**随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。 （3）DAB变质和显色时间太长：DAB**现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色**在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。 （4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。 （5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4度冰箱过夜，对结果无
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解析免疫组化染色出现无色片的原因及解决方法
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“ 杂音”染色片（有阳性信号）。以下解析“无色片”。 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能： 1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。 2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。 假阴性结果又可分为两种情况： （1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。 （2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB 滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现
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病毒保存：超低温法
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（ 如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。 超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10％）、二甲亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。 超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。 材料 病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管，液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。 方法 （1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。 （2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。 （3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。 （4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。 （5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。 （6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。 （7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内
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实验动物免疫方案一览
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
1、抗原: 蛋白质、多肽、细胞器、细胞、组织等。 2、免疫方式：皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射等。 3、不同动物免疫所需抗原量（以蛋白免疫为例） >18-20kDa
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浅谈荧光在酶标仪上的应用以及新一代酶标检测系统（Paradigm+Tune）的优势
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
前言 我们知道目前生命科学及现代分子生物学主要集中在对核酸和蛋白质等生物大分子的分析以及进行一些细胞水平的研究。传统的分析方法是采用放射性同位素作为一种示踪剂，标记在各种生物大分子或者细胞中来研究它们之间的相互作用和变化，但是放射性同位素对环境具有一定的破坏性，对人体健康也具有一定的损害，所以各国的科学家都致力于研究和应用高灵敏度的非同位素检测方法，利用荧光探针作为一种标记物，以其自身的一些优势而得到广泛的应用。目前对荧光进行检测的仪器种类很多，例如我们常见的荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、多功能读板仪（酶标仪）等，普通的荧光显微镜只能观察物质形态，不能给出量化指标，而流式细胞仪又因其价格昂贵和操作复杂不能得到广泛的应用。酶标仪作为一种荧光信号检测仪器，具有很多优势，不但价钱便宜、个头小、操作简便，而且还可以根据荧光信号特点和强弱来对物质进行定性和定量的分析。目前市面上支持荧光检测的多功能酶标仪种类很多，例如的系列的，，和，和目前市面上唯一一款可以完成快速动力学实验的等。 荧光产生机理 荧光探针（荧光染料分子）在光的照射下，物质的电子吸收能量后，可由低能级的电子层（内电子层）跳到高能级的电子层。此时，电子由低能态进入高能态。高能态的电子是不稳定的，他会在极短的时间（10-8s）内，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的能态。这时发射出的波长比激发光的波长要长，如果在可见光波长的范围内，为人眼所能看见的光，这种光称之为荧光。荧光是发光体分子中处于激发态的原子核外电子由高能级回到低能级所产生的辐射，因此是冷光。荧光的颜色多为蓝色、绿色、红色和黄色等。 荧光检测技术优势和影响因素 荧光检测技术具有灵敏度高、特异性好、动态范围宽、无放射性污染等优点；但也易受到反应体系中PH值和环境温度的影响，另外如荧光淬灭、光漂白等现象也会对荧光信号的检测产生较大的影响。 我们
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抗体保存注意事项和保存条件
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
抗体保存得当与否，直接决定了抗体的活性和使用效果！如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。以abcam 抗体保存方法为主，同样也可以应用到其他绝大部分的抗体产品！ 1. 收到抗体后请务必在12000rpm 离心1-5min 后再打开管盖进行分装和保存！质优的抗体使用非常特殊的储存管，只有在12000rpm 离心1-5min 才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下来。即使是在10000rpm 离心也会导致离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象！ 2. 对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -20 度 or -80 度对绝大多数抗体来说，保存在-20 度是完全足够了。没有任何证据显示保存在-80度 会有更多的好处！ (1) 分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。 (2) 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul 每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响 (3) 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4 度，避免再冻起来！ (4) 抗体工作液应该当天配制当天用完，在4 度 尽量不要超过1 天。 (5) 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上 3. 大部分抗体收到后4 度短暂保存1-2 周对抗体活性是没有影响的。 如果抗体很快(1-2 周)会使用，推荐在4 度保存，这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。 如果要长期保存则**是在-20 度 or -80 度。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体！但是，腹水形式的产品请在收到后立即冻起来！因为该类产品含有大量的蛋白酶，长期在4 度保存会导致抗体的降解！ 4. 大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2 周的时间，所以是在4 度的条件下来完成的。4 度运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害(如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻。这就多了一次冻融的过程)。所以
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进口内参抗体——在WB实验中为什么需要使用内参抗体？
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，**方法是Western Blot。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用的。 我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。艾美捷向您推荐使用内参抗体来检测您的实验系统，或者校准您的实验结果。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差
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PriCells: Isolation of endothelial progenitor cells (EPCs)
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
PriCells: Isolation of endothelial progenitor cells (EPCs) 1. Twenty-four mL venous blood was collected at each time point into Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tubes. 2. MNCs recovered by density-gradient centrifugation in these tubes were washed twice with PBS and once in EPC growth media consisting of medium199 supplemented with 20% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), and streptomycin (100 μg/mL). 3. Cells were resuspended in media, plated at a density of 5x106 per well on dishes coated with human fibronectin, and incubated at 37°C in humidified 5% CO2. 4. After 48 hours, nonadherent cells suspended in the growth media were replated onto fibronectin-coated 24-well plates at a density of 106 per well. 5. Media was changed every 3 days. EPC colony-forming units after 7 days in culture (Figure A). Cell clusters alone without emerging spindle cells (Figure B). Reference Tiffany M. Powell, Jonathan D. Paul, Jonathan M. Hill, Michael Thompson, Moshe Benjamin, Maria Rodrigo, J. Philip McCoy, Elizabeth J. Read, Hanh M. Khuu, Susan F. Leitman, Toren Finkel, Richard O. Cannon III. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2005; 25: 296-301
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PriCells: Questions
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
PriCells: Questions Questions 1: Isolation of hepatocytes from other species The basic two-step perfusion procedure can be used for obtaining hepatocytes from various rodents, including mouse, rabbits, guinea pig, or woodchuck, by adapting the volume and the flow rate of the perfused solutions to the size of the liver. The technique has been adapted for the human liver by perfusing a portion of the whole liver (usually with 1.5 L HEPES buffer and 1 L collagenase solution at 70 and 30 mL/min, respectively) or by taking biopsies (15-30 mL/min, depending on the size of the tissue sample). A complete isolation into a single-cell suspension can be obtained by an additional collagenase incubation at 37oC under gentle stirring for 10-20 min (especially human liver). Fish hepatocytes can be obtained by cannulating the intestinal vein and incising the heart to avoid excess pressure. Perfusion is performed at room temperature at a flow rate of 12 mL/min Question2: Maintenance and differentiation of liver parenchymal cells 1. Isolation liver parenchymal cells can be maintained in suspension for 4-6 h and used for short-term experiments 2. When seeded in nutrient medium supplemented with 1X106 M dexamethasone on plastic culture dishes (7X105 viable cells/mL), the liver parenchymal cells survive for a few days. 3. Survival for several weeks is obtained by seeding the liver parenchymal cells onto a biomatrix. However, the cells rapidly lose their specific differentiated functions. 4. Higher stability (2 months) can be obtained by co-culturing hepatocytes with liver e
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