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全球2021 HIV DR检测指南解析
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
2021年世界卫生组织（WHO）发布了《艾滋病毒耐药报告》，报告显示，随着艾滋病毒药物使用的不断增加，近年来艾滋病毒耐药性水平平稳上升。越来越多的国家非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)耐药性正在达到10%的阈值，此外接触过抗病毒药物的人，对NNRTI类药物表现出耐药的可能性也增加了三倍。耐药性问题日益突出。世卫组织鼓励各国监测耐药性，并建议进行艾滋病毒耐药性预备处理。 2021年根据WHO提供的30项调查中，有21项调查显示，开始一线抗病毒**的人群中，**前HIV对奈韦拉平(NVP)或依法韦仑(EFV)的耐药性达到10%以上的水平的国家占较大比重。 调查统计2014-2020年开始抗逆转录病毒**（ART）前即前期接受过ART**以及从未接受ART的成人HIV感染者对EFV或NVP耐药的流行数据，结果显示ART**前HIV对EFV或NVP耐药的总体流行率（24%，95% CI 18-29%）是未接受ARV药物的人群的三倍（7%，95% CI 4–10%）。重新开始接受ART的人群，耐药风险明显升高。 2021版WHO指南：《艾滋病毒预防、检测、**、服务提供和监测综合指南》根据各国**前耐药（PDR）流行病学以及**用药情况，指出临床诊疗参考方案入如下： ❖基于DTG的方案是国内推荐的一线抗逆转录病毒疗法的国家需预防HIVDR的出现和传播 ❖未有全国代表性的PDR调查数据，需尽快统计收集；对于NNRTIs（EFV或NVP）的PDR数值＜10%的国家以及PDR＞10%且国民存在经济问题的国家，可根据HIV耐药检测结果指导用药 ❖常规病毒载量监测以及早发现**失败：在ART开始后6个月、ART开始后12个月和此后每年获得HIV-VL(HIV viral load，HIV RNA)并审查结果进行持续检测; 检测结果HIV-VL＞1000 cp/mL或3月后检测出现HIV-VL＞1000 cp/mL，需更改ART方案 2021版DHHS指南：《艾滋病毒感染成人和青少年使用抗逆转录病毒药物指南》中，HIV感染患者的耐药检测建议如下： ❖未经抗逆转录病毒**（ART）的患者：在护理阶段进行基因耐药检测，指导初始ART方案；对急性、早期、孕期或诊断
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调用pyrex核心算法来实现基于数字孪生的发酵工艺优化
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
前言 经过几轮功能开发与技术迭代，我们此前推出的数字孪生模拟器现已支持同时对溶氧、微生物生长和传热过程进行模拟。关于数字孪生这个概念，我们此前介绍过相关的定义，并且开发了针对溶氧过程的应用案例。对于生物工程来说，数字孪生就是基于计算机模拟理论，对生物过程及其配套装备建立模型，并将其嵌入至控制系统或者数据管理系统中，进而实现与物理实体的双向数据通讯。从这个意义来说，仅对单一因素进行模拟显然是远远不够的，需要结合多项传感器数据，并考虑它们对发酵过程的联合影响，才能获得准确的模拟结果。但模型的复杂程度和运算量也会因此而呈指数增加。为此，我们使用C++开发了数字孪生模拟计算方法库-pyrex。相比于脚本类语言，其运算效率可以成倍提升。该库在不久的将来也会以开放使用的形式和大家见面。今天，我们先讨论在多因素情况下，数字孪生动态数学模型的应用案例。这个案例将使用基于Python的网页应用调用pyrex核心算法来实现。 理论基础 图1是补料发酵过程主要操作参数与菌体生长、产物形成之间的相互影响示意图，同时也是生物过程数字孪生模拟器的技术路线图。其中，绿色高亮部分，是pyrex当前版本已经实现的部分，包括搅拌与通气对传质系数，进而对传质速率、摄氧速率以及溶氧浓度的影响，补料流量对底物浓度进而比生长速率和菌体浓度的影响，以及上述所有参数之间的互相作用。 图1 补料发酵过程主要操作参数与菌体生长、产物形成之间的相互影响 关于上述模型的理论基础，可以参考我们之前的公众号文章，如搅拌对传质系数的影响。pyrex还包含了生物反应器产热及温度控制模块。本文中，我们以使用冷却水对反应器进行温度控制为例进行演示。其中过程产热包含了机械能耗散和生化反应放热。由于模拟器中温度控制和溶氧控制使用了PID控制器，本模拟器完全可以用来学习PID控制器参数整定。事实上，下面演示的网页应用中，PID参数并没有优化，欢迎大家尝试自己对控制进行优化，这也是数字孪
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细菌内毒素检测试剂替代法：高效灵敏的可持续基因重组鲎试剂
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
近期，国内阳性病例持续多发，疫情形势严峻复杂，疫情防控依旧至关重要。 据国家卫健委数据显示，截至2022年2月23日，全国新冠疫苗接种超31亿剂次！在这巨大的数字背后，是海洋里无数个鲎铸就了人类安全的防护伞。 鲎（hòu），因其外形酷似马蹄状，故又名“马蹄蟹”，从地质历史时期古生代的泥盆纪起，至今已存活了4亿多年。正因其有着与生俱来的免疫防御系统，才有了鲎如此古老的存在，而这坚不可摧的先天性免疫防御系统又和其体内神奇的蓝色血液息息相关。 正是这种特殊的蓝血提取制成的鲎试剂，变成了新药、疫苗，包括新冠病毒疫苗在内必不可少的检测试剂。 目前，针对变异毒株的疫苗还在紧锣密鼓的研发中，提取鲎血液制成的细菌内毒素检测“鲎试剂”的需求缺口依旧很大。 近几年，鲎种群的数量急剧下降，对鲎种群的保护已经到了刻不容缓的地步。若不及时遏制鲎种群资源下降问题，一旦鲎到了濒临阶段，全世界都将面临严峻的医疗卫生安全问题。 2021年2月，新的《国家重点保护野生动物名录》正式将鲎列为国家二级重点保护野生动物。长期依赖鲎试剂进行细菌内毒素的医疗行业也因此受到了不小的冲击。 为了减少对鲎的使用，同时满足生物制品、医药等行业的研制需求，新的细菌内毒素检测替代方法及试剂至关重要。 基因重组鲎试剂的出现有效解决了这些问题。该试剂不依赖天然鲎血，既保护了鲎资源，又满足可持续发展的目标，其价值不言而喻。 基因重组鲎试剂（PSNG）是一种基因工程技术合成的细菌内毒素定量检测试剂。它完全模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应，包含C因子、B因子、凝固酶原，且剔除了容易引起假阳性的G因子干扰。杜绝了由1,3-β-D-葡聚糖交叉反应造成的假阳性结果。 图1 PSNG（上图右侧）成功去除了 天然鲎试剂（上图左侧）的G因子干扰 相比传统鲎试剂内毒素检测方法，基因重组鲎试剂可以产生级联放大反应，使得内毒素检测更加高效、灵敏，完成实验仅需10-30分钟，灵敏度
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能量代谢测量技术：灵长类能量代谢
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
灵长类动物有许多与人类相似的生物学特性，是人类疾病和基础生物医学研究的理想动物模型。易科泰生态技术公司积十几年动物能量代谢测量技术研究服务经验，与美国Sable等国际一流能量代谢技术公司合作，为灵长类动物能量代谢研究提供精准技术方案： 1.定制动物不同状态（如跑步机上运动、爬杆运动）下的能量消耗、呼吸商监测等 2.定制光源控制、饮食限制、热限制条件下动物全面能量代谢监测等，可用于肥胖、糖尿病、组织再生、药物疗效、炎症评估、烧伤**等生物医学和医学研究 3.提供低氧控制、活动度、核心体温、VISIR动物行为监测以及高精度、高分辨率测量分析主机系统 4.根据客户需求，提供备选便携式、模块式、多通道式、24小时连续式、PUSH模式、PULL模式等不同技术路线方案 5.红外成像技术与微型皮下植入式温度心率监测，全面测量监测体温动态 应用案例1: 眼镜猴的体温调节 异温动物是体温调节机制介乎变温动物和恒温动物之间的一种动物类别。南非纳尔逊-曼德拉大学和马来西亚砂拉越大学研究者以眼镜猴为模型研究其异温潜力和表型，实验中将动物放到4升的呼吸室内（含粪尿收集），采用SSI推气式能量代谢测量技术测量耗氧率VO2、二氧化碳产量VCO2和蒸发失水率EWL，结合动物皮下温度，呼吸室内不同的温度变化监测来评估动物的热调节响应。结果表明，该眼镜猴热中性区为25-30℃，基础代谢率（BMR）为3.52±0.06 W.kg-1（0.65±0.01mlO2.g−1.h−1)。在实验室数据或自由放养数据中都没有适应性异温的证据。相反，动物在最低温度下似乎对寒冷敏感（Tb-31℃）。文中讨论了眼镜猴明显缺乏异温的可能原因，并确认了阔鼻小目中公认的异温调节，论证了对眼镜猴未来与全球变暖相关的温度升高的脆弱性的关注。 应用案例2: 红毛猩猩能量代谢策略 能量是生物生长、恢复和繁殖所必需的基本流通量——但我们对类人猿（我们最接近的进化亲戚）的代谢生理学和进化的能量利用策略知之甚少。华盛顿大学人类学系生物力学专家
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共培养迁移实验-周细胞与肺微血管内皮细胞共培养迁移操作详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
周细胞生长在血管内皮细胞外周，能够辅助血管的成熟。周细胞的缺失能够直接影响血管的形成。但在肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension (PAH)）患者肺组织内的内皮细胞与周细胞之间的关联而导致的血管损伤的机理却尚未清楚。 斯坦福的科研人员在研究周细胞（pericytes）和肺血管内皮细胞（PMVECs）关系时，希望能观测到周细胞和PMVECs共培养时，周细胞收到PMVECs细胞的影响而产生的迁移和极化行为。但在传统的实验中，研究人员只能发现周细胞对PMVEC细胞有一趋化行为。但是无法量化这一趋化行为，也无法研究周细胞的极性变化。 SUMOylation of TARBP2 regulates miRNA/siRNA efficiency. Chen C, Zhu C, Huang J, Zhao X, Deng R, Zhang H, Dou J, Chen Q, Xu M, Yuan H, Wang Y, Yu J. Nat Commun. 2015 Nov 19;6:8899. doi: 10.1038/ncomms9899 在文中，研究人员使用Ibidi开发的伤口愈合插件进行了这一共培养“伤口愈合”实验。这是一种双孔的硅胶插件，可以放在培养皿中，插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将两种细胞分别种在插件的两个孔中，等待细胞贴壁长满后，将插件移除，这样，两孔间的缝隙就是一个无细胞的“划痕”。不仅能够观测到周细胞向内皮细胞迁移的行为，而且可以使用细胞免疫荧光染色的方法，对周细胞内的细胞骨架排列进行观测，确定细胞的一个趋化行为。 一，实验材料 1) 细胞: PMVECs （C-12282，PromoCell）Pericyte 2) 实验耗材: 伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176) 3) 细胞培养基: EC-media （C-22120， PromoCell） Pericyte media （ScienCell Research Laboratories） 4) 灭菌镊子 5) 试剂：中性粒周蛋白 （ab4448， Abcam） 鬼笔环肽 （Invitrogen） 二，实验步骤 1）铺细胞（图二） 将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。 在ibidi细胞插件的每孔中分别加入1.5 × 104的PMVE
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动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
GB 31658.5-2021 氟苯尼考是一种抗生素类药物，具有安全高效、广谱抗菌等特点，被广泛应用于**禽、猪、牛等动物的菌性疾病。氟苯尼考在动物体内的主要残留物是氟苯尼考胺，也有氟苯尼考草氨酸和氟苯尼考醇等一些其他代谢物。 本实验参考GB 31658.5-2021《动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定》标准，建立了SPE-UPLC-MS/MS法测定动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺的残留量。 01 样品提取 称取试样2.0 g（精确至0.02 g）于50 mL离心管中，加入氘代氯霉素内标100 μL，涡旋混匀，静置15 min，加入乙酸乙酯-氨水溶液10 mL，涡旋1 min，3000 r/min离心5 min，取上清液于另一支50 mL离心管中，残渣重复提取2次，合并3次提取液。 离心管中加入5%乙酸2 mL，振摇混匀，于40 ℃水浴中浓缩至1.5 mL，加入5%乙酸2 mL ，加正己烷5 mL脱脂，涡旋1 min，3000 r/min离心5 min，弃上层，下层提取液重复脱脂一次，待净化。 方案所运用到的产品及仪器 Copure®MCX净化柱，60 mg/3mL 02 样品净化 活化：依次用2 mL甲醇和2 mL水活化MCX小柱； 上样：取待净化液过柱； 淋洗：用2 mL 5%乙酸淋洗； 洗脱：用5 mL 10%氨甲醇洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干； 重新复溶：加入500 μL 30%乙腈水溶液复溶，漩涡，滤膜过滤，上机测试。 03 标曲配制 称取6个试样同样品处理流程处理（不加内标），收集洗脱液后于40℃氮气吹干，作为空白基质。 准确移取一定量的混合标准液加入到空白基质底液中，同时加入100 ng/mL氘代氯霉素内标溶液100 μL，加入30%乙腈溶液溶解至0.5 mL，配制成浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL，涡旋混匀过滤膜，上机测试。 04 仪器条件 Thermo Fisher TQS Endura 液相部分 色谱柱：Hypersil GOLD C18(2.1 mm×100 mm,1.9 μm) 流动相：A：水 B：乙腈 流速：0.25 mL/min 柱温：35℃ 进样量：10 μL 洗脱程序：梯度洗脱表1 表1 梯度
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SPF级实验动物环境设施常用消毒方法及应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
SPF级实验动物环境设施常用消毒方法及应用 在实际生产运行中，对SPF级实验动物环境的病原微生物的控制要求较高，尤其是对特定病原微生物。SPF级实验动物屏障环境建筑设计较为特殊，整个系统庞大而复杂，功能分区严格，在屏障内长期有活体实验动物和仪器设备，所以在对特定病原微生物控制时的消毒方法应综合考虑。 为了保证屏障工作正常运转，不仅要长期为屏障内的实验动物提供适宜的湿度、温度、照度、控制噪音等，还要长期做好屏障消毒工作，定期对消毒效果进行监测，确保SPF级实验动物屏障内无特定病原微生物感染，否则会影响到整个屏障实验动物质量和动物实验结果。 SPF级实验动物屏障消毒常见方法为机械性清除、物理消毒法和化学消毒法。 机械性清除是用机械的方法清扫、洗刷、通风等清除病原体，是最普通和常用的方法。在SPF级实验动物屏障环境病原微生物控制上，机械性清除是控制病原微生物最基本的要求。但机械性清除法不能彻底对SPF级实验动物屏障环境病原微生物进行清除，但可减少病原微生物在屏障内的数量，属于辅助性消毒。 物理消毒是指利用物理因素杀灭或消除病原微生物及其他有害微生物的方法。SPF级实验动物屏障环境因自身条件要求限制，主要选用脉动真空高压蒸汽灭菌、紫外灯照射杀菌、钴-60辐照3种灭菌物理消毒方法。 化学消毒是指用化学消毒药物作用于微生物和病原体，使其蛋白质变性，失去正常功能而si亡。化学消毒是 SPF 级实验动物屏障最常用的消毒方法，化学消毒使用的化学药品溶液为消毒剂。消毒剂的使用方式包括喷洒、浸泡、擦拭、熏蒸等。目前，SPF 级实验动物屏障常用的有氧化消毒剂、碘类消毒剂、醛类消毒剂、酚类消毒剂、醇类消毒剂、季胺类消毒剂、卤素消毒剂等。 消毒效果比较研究 01不同消毒方式的效果比较 通过对多种消毒方式进行比较研究，选取不同测定时间点 (消毒前及消毒后的30min、2h、6 h、24 h、48 h、72 h)，检查消毒完成前后实验室的沉降菌最大平均浓度，比较各消毒
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干细胞污染防控技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
在干细胞的基础与应用研究飞速发展的今天, 干细胞的体外培养和实际应用中可能出现的安全问题越来越受关注。相对于干细胞内源性污染，外源性污染防控更重要。本文介绍一种如何控制外源性污染的方法。 干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞, 是构成机体所有功能细胞的种子细胞 ,在体外适宜的培养条件下可以无限增殖, 进而分化为多种功能细胞及组织器官。当代科学家普遍认为, 人类干细胞的研究将为再生医学提供广阔的应用前景 。特别是在组 织工程学方面,干细胞被认为可以解决长期困扰临床的器官不足和免疫排斥的难题, 从而实现人类用人工培养的组织和器官替代或更换疾病组织和器官的目标。 干细胞研究及其相关临床应用在为人类带来巨大利益的同时 ,也存在着生物危害的潜在安全隐患。例如 ,无论用于基础研究还是临床** ,都必须经过实验室干细胞分离 、培养 、定向诱导分化甚至基因操作, 体内研究还涉及细胞的移植和体内示踪等较为复杂和耗时的过程 ,在干细胞实验室操作中 ,存在来自干细胞的内源性的和操作过程中外源性的生物危害风险。 一 内源性污染 1 内源性污染的来源 内源性污染主要是从干细胞的来源来考虑的 。目前, 在干细胞的基础研究和临床**研究中 ,首要来源是自体干细胞;其次是异体干细胞 ;此外 , 还有经过特殊培养的动物来源的干细胞等 。所谓干细胞的内源性污染,着重强调的是细胞自身所携带传染性疾病以及遗传性疾病的问题。 二 外源性污染 1 外源性污染的来源 外源性污染 ,通常是指外源性微生物污染 ,包括细菌、支原体 、真菌和病毒污染等。细菌感染较为多见的是大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌、假单胞菌属等 ;常见的支原体污染包括以下几种:人源支原体通常由实验人员带入 (如口腔支原体 、人支原体、唾液支原体);动物来源的支原体通常经牛血清带入 (发酵支原体 、精氨酸支原体 、莱氏支原体 );猪鼻支原体(分离自猪)可能经胰蛋白酶 (在分离 、消化细胞时使用)带入。 外源性污染可能的途径有:①
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用慢冻速融法保存细胞的原理
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
一般来讲，细胞转移最有效的方法是进行低温保存（- 70℃～- 196℃），而细胞超低温保存的基本原理是：当细胞处于- 70℃ 以下环境时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故而可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过 0～- 20℃ 阶段的程序降温，在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 经过研究人员的长期试验，发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻速融，这样可以最大限度的保存细胞活力。 材料准备 1、仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、- 20℃、- 70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。 2、玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、废液缸。 3、塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10 ml）、15 ml 离心管、冻存管（1～2 ml）。 4、其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。 5、PBS, 胎牛血清，DMSO，培养液，双抗，胰蛋白酶（0.25%）。 细胞冻存 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由冰晶形成的细胞损伤。 1、10% 的 DMSO+ 90% 胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。 2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15 ml 离心管中。 3、离心 1000 rpm,5 min。 4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5x10^6 /ml～1x10^7 /ml。 5、 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。 6、冻存：标准的冻存程序为降温速率- 1～- 2℃/min；当温度达到- 25℃ 以下时，可增至- 5℃～- 10℃/min；到- 100℃ 时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入- 20℃ 冰箱 2 h，然后放入- 70℃ 冰箱中过夜，取出冻存管，移入液
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「全国爱肝日」深度解析乙肝耐药抗病毒**的真实病例
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
2022年3月18日是第22个全国爱肝日，病毒性肝炎属于全球性公共卫生问题，在中国，感染乙肝或丙肝病毒人数超过一亿，全球占比超过10%。 现代医学对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）的认识始于1960年代，病毒发现者Baruch Samuel Blumberg和其他人共享了1976年诺贝尔生理学和医学奖。 HBV经母婴、血液（包括皮肤和黏膜微小创伤）和性接触传播。HBV至少有9种基因型（A型至I型）和1种未定基因型（J 型）。我国以B基因型和C基因型为主。我国肝硬化和HCC患者中，由HBV所致者分别为77%和84%。 乙肝的抗病毒**分为核苷酸类似物以及干扰素两大类，其中核苷酸类似物占主要部分。耐药是影响核苷（酸）类药物抗乙肝病毒**疗效的重要障碍。当用核苷（酸）类药物长期**时，耐药的发生较为常见。耐药不仅可使已取得的**效果（如组织学改善等）丧失，还可导致肝脏病变急剧恶化，使疾病进展（如肝炎复燃、肝脏失代偿、肝衰竭等）。在抗病毒**过程中，检测到与HBV耐药相关的基因突变，称为基因型耐药。 我国核苷（酸）类药物耐药问题严重，与不规范使用这些药物和医患对耐药认识不足有关。因此对于乙肝耐药问题应重视和规范用药。 乙肝耐药的真实病例分享 由首都医科大学附属北京佑安医院鲁俊锋大夫为大家带来1例真实世界的乙肝耐药抗病毒**病例，欢迎大家交流。 ①基本情况 吴某，37岁，慢乙肝20余年，伴黄疸，B型 用药史：2013年 干扰素针剂** ②病例记录 ③专家点评 1.耐药位点突变会影响患者对药物的应答，可能造成低病毒血症（可进一步解释对于低病毒血症患者的**策略），应及时查明原因。 2.大部分乙肝患者有多年的用药史较复杂，及时进行耐药突变株检测有助于判断耐药发生并指导调整**方案，降低肝脏不良事件及肝癌的发生。 3.目前指南还没有给出明确的TDF/TAF耐药位点，对于临床上出现TDF/TAF表型耐药指征的患者需要特别关注，有待进一步探索。 乙肝患者如何防止发生耐药情况 ①不随
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细胞培养基本操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
细胞培养是生物医药科研工作者要掌握的基本技能，也是决定实验成败的关键环节。因此，了解细胞培养基本操作要领对于生物医药科研工作者，尤其是从事基础研究的科研人员尤为重要。本文将从实际操作角度谈谈体外细胞培养过程中的操作要领。 从脐带华通氏胶组织分离培养的原代细胞 1.实验前准备 正常细胞生长环境为5%二氧化碳，恒温37℃以及饱和湿度。开始进行细胞培养前，实验者要查阅资料，了解所要培养细胞的生长习惯，如贴壁、半贴壁、悬浮等。了解细胞生长的营养条件，大部分细胞是10%胎牛血清+89%培养基+1%抗生素。当然，培养基细分有很多种类，如高糖、低糖、分化培养基、干细胞培养基等。根据培养细胞的生长条件，预先选择合适的耗材，如促贴壁或低吸附培养瓶、培养皿、培养板等。在处理细胞前，算好本次处理所需的细胞生长培养基总量，生长培养基现配现用。 2.细胞消化 对于贴壁类细胞，传代相较于悬浮细胞操作步骤多，应避免不必要的细胞污染发生。细胞生长汇合度80-90%左右时即可进行传代操作。因为细胞生长有浓度依赖性，过完或过早传代都会影响细胞状态。培养箱取出细胞，PBS清洗2遍。这时要将细胞培养瓶中的液体吸净，可以用真空泵、移液管、一次性吸管等，但是无论用什么方式吸净，都要避免操作手触碰瓶口而造成污染，避免吸头触碰细胞面而对细胞造成机械损伤。吸净液体后，加入适量的胰蛋白酶。胰蛋白酶不宜过多，只需几滴，倾斜培养瓶后能将细胞面覆盖即可。此时可将细胞放在培养箱中，37℃的条件有助于胰蛋白酶发挥消化作用。消化时间在2分钟左右即可。当然有的细胞较容易消化，可能消化过程只需30秒，如TC-1、MC-38等肿瘤细胞株；有的细胞消化较慢，如原代培养的间充质干细胞(MSCs)。另外，如何判断细胞消化过程是否结束？我们可以在倒置显微镜下观察细胞形态，细胞大部分从多角形变为卵圆形，并见细胞漂浮。也可以通过肉眼直接观察细胞面由光滑向毛玻璃状变化。
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支原体污染的来源及各种检测方法的特点和优势
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
现实是这样的 支原体污染是细胞培养试验室中最常见污染之一，保守估计常规细胞培养中有15~35%存在支原体污染[1]。 一被污染深似海，从此快乐是路人。 情况是这样的 支原体（Mycoplasma）是一类没有细胞壁、形状多变、能通过滤器的可独立生存的最小原核微生物，大小为0.1~0.3μm，可以在培养基中自己生存，也可以与细胞共生或胞内寄生[2]。支原体的繁殖周期较短（1~9小时）[3]，因此，一旦污染，支原体数量会快速增长，3～5天内能在培养基中达106CFU/mL。 支原体污染可能来自培养基、血清、操作人员、污染的操作环境、污染的细胞和水浴锅交叉污染等等，但是人源的污染概率最大，数据表明80.6%的实验人员为支原体携带者[4]。进而影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。 支原体污染不易被察觉，因此定期检测和过程样品监测显得非常重要，如细胞库检测、生产用细胞检测、培养过程样品污染监测和检定用细胞检测，防患于未然，各个关键节点监控必不可少。 那能怎么办？ 选用合适的方法，及时定期监测，重要节点把控，即可！ 目前支原体检测方法大致分7种，主要根据支原体的特征，如培养基中能自由生活、个头小、形状多变、可附着到细胞上、有独立的遗传物质且A-T含量高、有特有的呼吸代谢系统、有独特的细胞组成等等来建立的检测方法[5]。 客观的讲，每个方法都有自己的特点和优势，但目前主流检测方法是培养法、指示细胞法、NAT方法和生化法。几种方法特点对比如下： 大家对这几种方法并不陌生，其中生化法是基于支原体特有的酶进行支原体检测。活的支原体溶解后释放大量能力代谢相关酶，与底物反应促进ADP转化为ATP。通过荧光素酶法间接反应样品中添加底物前后ATP的变化，进而判断有无支原体污染和评估污染程度。 生化法支原体检测最典型的特征是能检测活的支原体，检测时间短。因此很多企业将该方法用于常规细胞样品和培养过程样品快速检测，检测阳性样品可以借助
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细胞主要污染的源头以及分辨细胞是否污染和防治方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
中乔新舟 做细胞培养的时候，对于刚开始接触细胞培养的同学来说，最怕的就是细胞受污染。以下是细胞主要污染的八个源头以及分辨细胞是否污染和防治一些细胞污染的方法，仅供参考。 细胞污染认定：凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。细胞污染根据污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。 01细胞物理性污染预防措施 物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。 02化学性污染防治手法 培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制
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拉曼技术的发现、发展和在制药行业的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
“1921年夏，我到欧洲的航行使我有机会第一次看到地中海的美丽的蓝色乳光，这种现象似乎很像是由于阳光被水分子散射引起的。为了检测这种解释，**是找到光在液体中漫射所遵循的规律。” ——摘自印度物理学家拉曼在诺贝尔奖领奖仪式上的演讲 看看，看看，别人看海是看到的光散射；而我看海看到的是海里那条美人鱼。 拉曼散射的发现 1928年，印度科学家拉曼（C.V.Raman,1888-1970）观察到一个现象：当光穿过透明介质，部分被散射的光发生频率改变，这一现象被称之为拉曼散射[1]。C.V.Raman也因为这一发现获得了1930年诺贝尔物理学奖。 基于印度科学家C.V.拉曼（Raman）发现，光从样品中散射是由于光与样品分子发生弹性碰撞（瑞利散射）或非弹性碰撞（拉曼散射）。瑞利散射光具有与入射激光相同的波长，但拉曼散射光以不同的波长从样品返回，该波长对应于样品中分子键的振动频率，因此对散射光谱进行分析可得到的分子振动、转动的信息，并应用于分子结构分析研究，称为拉曼光谱（RamanSpectra）。拉曼光谱是一种散射光谱，是光与物质分子、原子相互作用的一种形式。 从弱到强逆袭的拉曼 虽然拉曼的发现获得诺贝尔奖，在上世纪30、40年代受到广泛重视，也曾是研究分子结构的主要手段，但由于当时拉曼信号太弱，无法满足样品测试的苛刻要求而无法广泛应用。60年代，随着激光光源的发展，特别是大名鼎鼎的表面增强拉曼散射光谱（SERS）技术的出现，拉曼逆袭成为高灵敏度仪器，并得到广泛应用。SERS技术有灵敏度高，水干扰小，检测快速，抗光漂白和谱峰窄的优点[2,3]。 拉曼技术应用 由于透射性好，拉曼可以透过包装，测定任何对激光透明的介质，如玻璃，塑料或溶于水的样品。药厂、化工厂用拉曼来做原料或库管样品的检验，那可是便携拉曼的看家本领。这类应用的共性就是检测的成分简单，含量较高，不用HPLC分离，不用制样，透过包装就快速检测。除了应用于物质组成检测或成分鉴定外，拉曼光谱还可以用于
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环境空气颗粒物（PM10和PM2.5）连续自动监测系统技术要求及检测方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
新年伊始，生态环境部修订发布了国家生态环境标准《环境空气颗粒物（PM10和PM2.5）连续自动监测系统技术要求及检测方法》（HJ 653—2021，以下简称《HJ 653技术要求》）。《HJ 653技术要求》改变了仪器使用规则，为使用光法原理的仪器进入到PM2.5和PM10监测去除了技术障碍，致力于进一步降低环境颗粒物质量浓度 为什么需要新的 《HJ 653技术要求》？ 近年来，我国大气环境治理成效显著，但颗粒物仍然是很多城市环境空气的主要污染物，因此需要采取进一步行动。生态环境环境监测司、法规与标准司组织修订的《HJ 653技术要求》结合了两个方面：当前环境空气颗粒物自动监测技术的发展和保障大气环境质量管理的需求。 聚焦光法技术 为提高环境空气颗粒物自动监测仪器的性能指标，新的《HJ 653技术要求》在两个关键方面带来了变化： • 更严格的规定 环境空气颗粒物自动监测仪器技术性能研究方面，仪器硬件配置和参数设置的规定旨在通过提高监测数据的质量来改善监测结果。 • 接受新技术趋势 借鉴国外相关标准，保持仪器原理的兼容性。通过取消对光法技术的限制来鼓励技术创新和发展。这意味着，现在除了常用的β射线吸收法或微量振荡天平法外，光学技术也成为了焦点。 光法技术专家——Palas® Palas® Fidas® 单颗粒计数气溶胶粒径分布光谱仪使用光法技术监测空气颗粒物，扩大了应用范围。也为采用不同方法原理的仪器进入PM2.5和PM10监测扫清了技术壁垒。 得益于近年来光法技术创新和成熟以及显著的成本优势。在欧洲和美国市场，光法仪器已经被越来越多的业主选择。在欧洲，从2019年开始，基于光法原理的PM监测仪器安装基数已超过了基于β射线吸收法或微量振荡天平法原理的仪器。在美国，基于纯光法原理的仪器也正在成为市场的主流仪器。中国这次法规修改，拥抱这一监测技术趋势，将大大促进技术创新和更新换代，也为广大业主带来更多的选择。 准确稳定的光法测量仪器--- Fidas 200系统
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