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核磁共振成像原理介绍之层厚（THK）
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
核磁共振成像原理介绍-层厚 前面简单的介绍了核磁共振成像原理中的层面选择、线性梯度场等概念，下面简单介绍下核磁共振成像中的层厚（THK） 层厚是指成像层面在成像空间第三维方向上的尺寸。对于MRI. 层厚表示一定厚度的扫描层面。 层面的选取在实际临床操作中都是有一定厚度的。 我们把射频脉冲的频率范围称为带宽。带宽决定了层面的厚度。 因为射频脉冲的频率范围越大，对应符合拉莫尔频率的磁场范围就会增大，层面厚度增加。 注意:当发射射频脉冲时，只允许使一个层面中的质子产生磁共振，其他层面中任何一个质子不会产生磁共振。 除了带宽决定层面厚度外，梯度场Gz 也会对层厚产生影响，如果选取层面射频脉冲的带宽不变，不同的Gz，对应的厚度不同， Gz 变化快(斜率大) ，对应层面厚度小， Gz 变化慢(斜率小) ，对应层面厚度大。总之，层面厚度取决于层面选择梯度Gz 和射频脉冲的带宽。 层面厚度关系到层选方向的分辨率，层面薄， 则分辨率高; 层面厚，则分辨率低。 但层面不能太薄，由于我们还要将成像层面分成大量体素，层面太薄时每个体素内质子数量减少，各体素产生信号小，信噪比小，达不到高分辨率的目的。 通过以下两种方法降低层面的厚度: (1)使用窄带宽的射频脉冲。窄频率的带宽将激励更窄的磁场强度范围内的质子(图1) 。 (2) 增大梯度场的斜率(图2) 。 图1 带宽与层厚的关系 图2层厚与梯度的关系 层厚是图像质量的重要决定因素； 层厚的增加，使成像组织的体素体积增加， 相对于较薄的层面来说，体素内质子数量增加，信号强度增加，所以图像的信噪比将会增加，图像的表观改善。 但是，层厚增加了，信噪比增加的同时，空间分辨率降低，部分容积效应作用会显著。
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单细胞功能蛋白质组技术助力提高CAR-NK转染效率和细胞疗效
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
截至目前，超过5种CAR-T细胞**产品获得美国FDA认证，批准上市。国内CAR-T产品也已获批上市。但CAR-T产品也存在着生产周期长、有细胞因子风暴及神经毒性副作用等挑战。 CAR-NK细胞被认为可能应对这些挑战，其发展引起了研究人员的极大兴趣——主要是因为相比传统的CAR-T细胞，CAR-NK细胞具有独特的优势。与CAR-T细胞不同，CAR-NK细胞可以应用于异体细胞**环境，这意味着它有潜力成为一种“现成的”**方法，并降低移植物抗宿主病(GVHD)的风险，解决了周期长，必须应对个体化需求的问题。CAR-NK细胞不像CAR-T细胞那样在体内长时间存活，从而降低了靶向正常细胞和非肿瘤细胞的风险。此外，由于NK细胞分泌的细胞因子相与T细胞不同，NK细胞造成细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性的风险较低。 更重要的是，CAR在NK细胞中的表达可以增加其固有的细胞杀伤能力，改善未修饰前NK细胞的**结果。已知未修饰的NK细胞临床前研究已经产生了很好的结果及安全性，但仍未转化为成功的临床实验，虽有多达50%的患者中产生了阳性反应，但其他实验报告的临床疗效还是有限。提示我们CAR修饰的NK细胞**可能是更好的**方案。 慢病毒NK细胞转染方案 限制CAR-NK细胞**发展的挑战之一是基因转染方式。逆转录病毒载体已被广泛研究，转染后在NK细胞中的效率约为27%-52%。以及转染后CAR-NK细胞活力低和突变的风险而受到限制。一种更安全的选择是用慢病毒(LV)转染，因为它提供了降低基因毒性和插入突变的风险。然而，其转染效率往往比逆转录病毒的转录效率要低得多。 CAR-NK细胞有几种类型的慢病毒(LV)正在开发中，最近人们对优化vesicular stomatitis virus-G (VSV-G)-pseudo typed LV(VSV-G LVs)的转染很感兴趣。 St. Jude儿童研究医院的研究人员于2021年6月在Cytotherapy杂志发表文章，研究表明，VSV-GLVs转染的NK细胞转染效率低和细胞活力低是由于toll样受体4(TLR4)通路的激活。 VSV-G激活TLR4信号通路 免疫系统使用模式识别受
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原代细胞的培养应用及分离注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
原代细胞培养的应用： 1、为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段； 2、为传代培养创造条件； 3、服务于临床实践，用于药物筛选等。 原代细胞培养之分离注意事项： 组织块培养法： 1)组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。 2)加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。 3)当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。 4)为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。 原代细胞与细胞系有什么区别？ 根据传统定义，自组织第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞 [Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]. 这类细胞直接从组织分离，生命周期有限，经数次传代后会逐渐停止生长。原代细胞在有限的生命周期内需掌握好细胞的最大生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。 细胞系是不断生长、分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。 但实际上，经过长时间、连续的传代培养后，细胞系随着代数的增加，细胞的基因型和表型都有可能发生改变。 需要指出的是，在不同的科研小组中这些术语的定义会有所不同。许多研究员不用细胞系这个词表示细胞群，除非细胞经过了遗传改造。
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斑马鱼等水生生物呼吸代谢测量全面解决方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
易科泰生态技术公司提供水生生物呼吸代谢测量全面解决方案： 斑马鱼等鱼类（包括鱼卵及胚胎）呼吸代谢测量技术方案 贝类呼吸代谢测量技术方案 虾、蟹及昆虫等呼吸代谢测量技术方案 浮游动物呼吸代谢测量技术方案 微塑料积累及其代谢响应研究技术方案 荧光光纤氧气传感器技术，高灵敏度、高分辨率、免维护 “Stop-Flow”测量技术，可循环长时间测量分析 模块式结构，配置灵活，可客户定制，提供最佳测量方案 广泛应用于水产养殖种质资源表型分析研究、水体环境毒理学、水质生物检测、海洋与淡水鱼类及贝类等水生生物生理生态学研究等。 应用案例一： 随着城市化和工业化进程的逐步加快，由人类活动造成的水体污染和水体富营养化问题越来越多。对此，加拿大McMaster University和University of Waterloo两所大学的实验人员通过测量分析慢性暴露于低氧和（或）城市污水处理厂废水中鳉鱼的能量代谢，探讨了污水处理厂附近的压力源组合可能对鱼类的生理和健康产生的交互影响，结果表明：同时暴露于污水和缺氧的环境中会降低鳉鱼的标准代谢率（SMR）（参见下图）。在所有试验处理中，含氧量和污水处理之间存在显着的相互作用（p = 0.02），缺氧环境并没有影响到饲养在清洁水中的鱼的 SMR；但当鳉鱼同时暴露于缺氧和污水中时，中度和重度缺氧组的 SMR 分别降低了 37% 和 25%（图 1A），并且导致了显著的缺氧效应( p = 0.03)。此外在常氧环境下测量的静息代谢率 (RMR) 的变化趋势与标准代谢率( SMR)并不一致，缺氧环境和污水环境对不同对照组的RMR并没有统计学意义的影响（缺氧效应，p = 0.42；废水效应，p = 0.96；图 1B）。（PS：本研究中鳉鱼的能量代谢差异与体重变化无关，因为各实验样本之间的体重并没有显著差异，肝指数和Fulton’s K肥满度等指数也没有任何差异。研究成果发表在《Environmental pollution》，题目为“Exposure to wastewater effluent disrupts hypoxia responses in killifish (Fundulus heterocli
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国自然热点话题：肠道菌群研究思路解析
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
人体是一个由自身细胞和共生微生物细胞构成的超级生物体，而微生物的数量和基因总数要比人类多得多，它们注定会对我们的健康产生重要影响。近年来，肠道微生物成为了一个热门研究方向，相关的研究成果更是频频登上各大顶级期刊。 肠道微生物研究为何成为热门研究领域？ 人体肠道微生物基因组作为人类的第二套基因组，与人类健康密切相关。大量的研究表明肠道微生物与包括心血管、肿瘤、神经、消化等多种疾病的发生发展密切相关，其因果关系也在逐步阐明中。 随着研究的深入，人们越来越认识到肠道微生物在疾病的诊断**、个性化营养等方面的重要意义，许多国家都加大了肠道菌群方向的科研投入，在全球范围启动了几项重大的研究计划，产生并积累了大量人类微生物宏基因组信息，为后续研究提供强大数据支持，也为产业化奠定了坚实的科研基础。 人类基因组计划的完成带动了精准医疗、基因靶向药、基因筛查、诊断和冶疗产业的迅猛发展。随着技术的逐渐成熟，肠道菌群相关的诊疗有可能成为医疗领域一股颠覆性的力量。 肠道微生物研究热门领域 1. 肿瘤 科学家们在上世纪90年代把传染性细菌幽门螺杆菌与胃癌联系起来。从那时起，科学家们开始发现一些可能与肿瘤的发生和发展相关的菌群。肿瘤免疫疗法是近几年来癌症**领域最成功的方法之一，目前主要分为两个分支：细胞**免疫和免疫检查点抑制剂**（ICB）。 免疫检查点分子是免疫系统中起抑制作用的调节分子，其对于维持自身耐受、防止自身免疫、以及通过控制免疫应答的时间和强度而使组织损伤最小化等至关重要。免疫检查点分子表达于免疫细胞上，将抑制免疫细胞功能，使机体无法产生有效的抗肿瘤免疫应答，肿瘤形成免疫逃逸。免疫检查点抑制剂类药物，可解除这种抑制作用，让免疫细胞重新激活工作，消灭癌细胞。 近来，许多研究表明一些肠道菌群的存在与ICB疗效的提高有关。为了弄清其中潜在的分子机制，Kathy D. McCoy团队筛选并研究了多种能显著提高ICB疗效的肠道菌群，发
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共聚焦显微镜的成像原理及应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
什么是共聚焦显微镜？ 共聚焦显微镜是激光共聚焦扫描显微镜 LCSM 的简称，它显微成像主要采用 3D 捕获的成像技术，使其具有较高的三维图像分辨率。这 些都是 通过构建显微照片来实现的。在荧光显微镜使用过程中，由于需要高强度紫外光辅助成像，所以显微镜 内的汞弧灯产生的强光可能会导致令人不安的背景噪音，甚至会导致光漂白。 共聚焦显微镜原理是通过数码相机针孔的高强度激光来实现数字成像的技术，有效避免了荧光显微镜 所产生 的问题。 共焦显微镜原理 共聚焦显微镜中的图像是来自一个焦平面的光通过针孔数码相机聚焦拍摄，从而规避 来自其支点上方或下方的光。固定在设备上的激光连续聚焦在样品的选定区域，同时，被样品吸附的荧光染料也会被数码相机捕捉。共聚焦设备包含两个旋转镜头用来拍摄组图。 然后通过所累积的不同焦平面的图像序列，使用软件编译完整的 3d 图像。此图像可以在轴向（z 轴）和横向（x 和 y 轴）平面进行微调。这些细胞和其他矩阵的再现是通过使用双倒置的光锥照亮物体来实现的。 使用标准落射荧光显微镜所存在的问题是当遇到较厚的基质或标本时所表现出的荧光程度较大。大于 2 微米的样品发出的辐射会危及生成图像的准确性，从而损失成像的细节。而共聚焦显微镜则可以通过缩小激发范围并使用光学切片来消除背景噪声。 共聚焦显微镜的应用 ECM模拟凝胶的成像 细胞外基质 (ECM) 或属于所有细胞的非细胞成分，在细胞功能中是必不可少的。ECM 的弹性调节细胞的许多生物学功能，例如间充质干细胞的分化、粘附和迁移。 细胞生物学中常常通过水凝胶来模拟ECM。共聚焦显微镜的应用主要在于可与聚丙烯酰胺凝胶的压痕法结合使用。共聚焦自动图像成像可以有效测量 ECM 模拟中的压痕和穿孔。比如，共聚焦激光显微镜可以测量出 PAAM 凝胶组合物的深度和刚度。这种方法可以替代 AFM 纳米压痕法和微针法。 由于共焦成像可以可靠地探测大多数样品表面下方 0-200 µm 之间的任何位置。然而，重要的
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如何遏制HIV耐药性
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
到2020年度，全球约有3770万HIV感染者，其中2750万人正在接受抗逆转录病毒疗法。HIV耐药将影响抗病毒药物在降低HIV感染率以及与HIV相关的发病率和死亡率方面的有效性。在向WHO报告的30项调查中，有21项调查的数据显示：在初治人群中，对奈韦拉平或依非韦伦的**前耐药率达到了10%以上，先前使用过抗病毒药物的人群也表现出耐药率较高的现象。在HIV母亲所生的婴儿中，有近一半的婴儿对奈韦拉平和/或依非韦伦产生了耐药。 第一代和第二代非核苷类药物耐药性的全球流行率促使我们需要快速过渡到基于第二代整合酶抑制剂（以多替拉韦为代表）的**方案。自2019年以来，世卫组织已建议使用多替拉韦作为针对所有人群的**一线和二线**药物。与目前使用的其他药物相比，它更加高效，便于服用，副作用更少，同时它也有很高的基因耐药屏障，因此更能支持长期**并保持疗效。现今，第3代非核苷类药物“艾诺韦林”的面世具有副作用小，疗效确切的优点，也逐渐被一些临床大夫所关注。 阻止HIV耐药的传播对于确保现有**方案长期疗效和持久性显得非常重要。由于耐药病毒的出现，所有HIV药物，包括较新药物类别的药物，都有部分或完全失效的风险。如果不加以预防，HIV耐药性将危及疗效，导致HIV感染人数的增加以及相关发病率和死亡率的提高。 为了阻止HIV的传播，政府、疾控和医务工作者都应促进HIV最佳**药物的可及性，通过VCT门诊提供持续性的随访和护理，并增加病毒载量及耐药检测的频率，以了解HIV**是否有效，并在确认**失败的情况下迅速更换**方案。 我国的高效抗HIV药物已进入医保时代，包括2种基于第2代整合酶抑制剂的3联单片合剂“必妥维”以及简化**方案的2联合剂“多伟托”，另外还有第3代非核苷类药物“艾诺韦林”的面世，以及重症住院患者需要的融合酶抑制剂“埃博韦泰”共4种药物。这无疑让临床医生针对不同患者有了更多更好的选择空间。 随着我院近期在院内开展的HIV耐药检测，相信将为有效控制HIV耐药打下坚实
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小鼠皮肤瘙痒模型的建立及抓痒行为学检测方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
动物瘙痒模型的建立及抓痒行为学评价方法 一.摘要 瘙痒是一种皮肤神经官能症疾患。临床上将只有皮肤瘙痒而无原发性皮肤损害者称之为瘙痒症。目前瘙痒的发病机制尚不确定，现有动物模型多只是反映瘙痒的某些特点，以西医指标评判为主。 二.造模动物 现用于制备瘙痒模型的动物有主要有小鼠、大鼠、豚鼠和家兔等，以小鼠、豚鼠更为常用。常选用成年动物，雌雄各半。 三.造模方法 1. 磷酸组胺诱发制备豚鼠瘙痒模型 1.1 原理 组胺受体是一类G蛋白偶联受体，通过激活瞬时感受器电位受体，继而激活一系列的细胞内信号传导，从而导致瘙痒。 1.2 方法 清洁级豚鼠，体质量250-280g，雌雄各半。实验前48 h先将豚鼠右后足背剪毛，脱毛剂脱毛，面积约1cm2。实验当日再将脱毛处皮肤用细砂纸轻轻擦伤，使之发红，以渗血但不出血为度。于创伤处涂抹0.05%的磷酸组胺30μL/只（或0.01%的磷酸组胺50μL/只），30min内豚鼠如不出现瘙痒反应（即舔右后足创伤部位的动作），需再涂抹1次组胺，如此重复操作，直至出现为止。记录涂抹组织胺的次数及累积用量。也可将磷酸组胺换成2%的5-羟色胺10μL，同上法制备豚鼠瘙痒模型。 2. 右旋糖酐诱发制备小鼠瘙痒模型 2.1 原理 右旋糖酐可诱导机体释放内源性组织胺，使小鼠产生皮肤瘙痒。 2.2 方法 SPF级昆明种小鼠，18-21g，雌雄各半。小鼠尾静脉注射0.025%右旋糖酐0.05mL/10g（1.25mg/kg）。以小鼠前爪搔抓头部、后爪搔抓躯干、嘴咬全身各部位作为瘙痒指征，模型成功。观察记录30min内小鼠搔痒次数及搔痒持续时间。 3.氨基吡啶（4-AP）诱发制备小鼠瘙痒模型 3.1 原理 4-AP可促机体肥大细胞释放组胺，导致小鼠发生瘙痒症状。 3.2 方法 小鼠模型：SPF级昆明种小鼠，18-21g，雌雄各半。选择小鼠背尾部作为注射部位，给小鼠背尾部皮下注射0.02%的4-AP溶液，0.1mL/只。小鼠持续的舔体后出现停顿计数1次，记录10min内各小鼠舔体次数。 4. 组胺和4-AP联用诱发制备小鼠瘙痒模型 4.1 原理 组胺受体是一类G蛋白偶联
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植物/藻类热耐受评估技术方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
随着全球变暖的加剧，世界上越来越多地区的农业都开始面临热胁迫（heat stress）的威胁。因此，评估植物尤其是农作物的热耐受性（heat tolerance）并培育具有较高的热耐受性作物品种成为目前农业应对全球变暖的最紧迫任务之一。同时，温室效应造成的海水升温，也对海洋藻类造成了极大的影响，进而威胁到全球的生态安全。 虽然科学家对植物/藻类热胁迫的研究由来已久，但一直以来缺乏相应的仪器技术方案能够快速、直接、全面地对植物/藻类的热耐受性和热稳定性进行评估。易科泰生态技术有限公司利用国际先进植物热胁迫相关研究仪器技术与最新的科研成果，推出易科泰植物（包括藻类）热耐受性评估技术方案（抗高温胁迫检测技术方案）： 1.基于植物热耐受性/稳定性检测技术和叶绿素荧光技术的植物热耐受性（抗高温胁迫）测量检测技术方案，可选配智能LED培养箱、红外热成像分析等功能单元，全面实验分析植物热耐受性或抗高温胁迫性能 2.基于植物热耐受性/稳定性检测技术和叶绿素荧光技术的藻类热耐受性（抗高温胁迫）测量检测技术方案，并配置藻类培养与在线监测、藻类光合-呼吸测量监测等功能单元 3.大田高通量作物/植物热耐受性（抗高温胁迫）评估技术方案，采用SpectraScan近地遥感与EcoDrone无人机遥感技术，可选配手持式或便携式叶绿素荧光测量及光合仪等 以上功能单元均为国际一流的仪器技术。用户可根据研究需要灵活组配，还可搭配叶面积仪、植物生理生态原位监测系统等常规仪器。每个单元在各种植物藻类胁迫包括热胁迫研究中均有大量的文献与研究成果。感兴趣的老师请与我们联系索取相应研究文献。 下面介绍综合运用这一技术方案在植物/藻类热耐受评估的最新研究成果与应用案例： 一、拟南芥、马齿苋与蓝藻的热耐受评估 捷克帕拉茨基大学的研究人员最早应用这一技术方案对植物和藻类进行热耐受性评估，研究成果发表于2019年《New Phytologist》。热耐受性测量仪
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如何确保Cre-lox小鼠能够删除正确的基因
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
许多表达Cre的品系在构建小鼠模型时均有着不明显或未表征的表型。 而其中的一些表型（包括意外表达模式和不可预测的删除效率）可能会让实验人员很难对实验作出解释，由此导致Cre-lox神话破灭。 那么，要如何解决这些问题呢？ 脱靶Cre表达 当Cre不在驱动Cre表达的启动子直接支配下表达在其他组织或器官中时，就会发生脱靶Cre表达。 如果Cre品系发生这种情况，而实验人员又无法发现，那么floxed小鼠基因可能会在意想不到的组织中被删除。 因此：需要充分了解cre品系的表达模式 首先，查阅已发表的文献，了解业界就Cre表达已检查了哪些组织和器官。当研究人员创建新的Cre品系时，势必会在启动子驱动Cre表达所在的组织中寻找Cre表达，但他们通常不会验证其他非靶组织中是否不存在Cre表达。 如果您的品系没有已知的Cre表达信息，则应在表达可见标志物（例如：β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、GFP或其他荧光蛋白）的众多Cre报告基因品系中选择一个品系，并将您的cre品系与之进行杂交。 只需一次杂交就能产生携带Cre转基因和Cre报告基因的小鼠，这样，您就可以检查您所希望的细胞中是否表达Cre。 生殖系中的脱靶Cre表达 生殖系中的脱靶Cre表达可能会特别棘手，因为您的鼠群中可能会出现所有细胞中都有完全重组的敲除等位基因的小鼠。 通常，生殖系表达Cre是因为减数分裂后卵母细胞中持续存在Cre RNA或蛋白质。 对于许多Cre品系（不是全部） 使用Cre阳性雄性小鼠进行育种可以避免删除生殖系中loxP等位基因。 可以设计在floxed小鼠外显子上游和下游区域退火的引物，通过PCR轻松监测鼠群的生殖系Cre表达。 这样，如果产生了完整重组敲除等位基因，则可扩增较小产物（图1）。 对所有繁育小鼠进行基因分型，从鼠群中剔除已删除等位基因的所有小鼠。 （图1：位于两个loxP位点两侧的引物（绿色）将会在删除等位基因后扩增获得较小产物） LoxP位点重组效率低下 Cre重组l
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蛋白免疫印迹实验常见问题原因分析汇总
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
蛋白免疫印迹实验常见问题原因分析汇总如下： 一、检测无信号 主要可能由于以下原因导致： 1. 用于检测的二抗不匹配。解决办法：需要确定一抗的宿主。 2. 一抗二抗的浓度过低：需要耐心地重新实验。 3.一抗不识别被检测物种中的蛋白质：可以再检查以下一抗的特异性。 4.凝胶上上样的蛋白量太少：凝胶上样品过少也会导致信号弱，所以适当增加样本量也可以防止此现象发生。 5.传输效率相当低：出现这种情况可以尝试修改转移程序的操作，确保 PVDF 与甲醇预孵育。转移后干燥 PVDF 以确保蛋白质与疏水膜的结合。 6.一抗使用次数过多：亿康如果过度稀释对信号检测也会有一定的影响，所以尽量使用新稀释的一抗。 7.阻塞时间过长或洗涤次数过多：尽量减少阻塞时间和洗涤时间。 8. 检测试剂盒不起作用：这种情况出现的较少，实验中注意试剂盒的有效期是否正常，也可使用阳性对照并确保检测试剂盒正常工作。 9.叠氮化钠可能会抑制二抗：尽量避免在稀释缓冲液中使用叠氮化钠。 10.一抗或二抗的孵育时间太短：可适当延长孵化时间 11. SDS 上样缓冲液和样品裂解液没有充分混合或者混合不均匀： SDS 上样缓冲液需要随用随配，以保证其新鲜度，另外缓冲液与裂解液可以使用涡旋混合器进行充分混合。 二、无蛋白质的区域具有高背景 蛋白免疫印迹常见问题中出现这种现象，可能由于以下几种情况所导致。 1.可能由于封闭时间过短或封闭缓冲液使用不当。大多数一抗基本不会和白蛋白或酪蛋白发生交叉反应。如果任何没有蛋白质的区域具有高背景，则封闭步骤可能无法正常工作。 2.一抗或二抗的浓度过高所致：适当降低抗体浓度。 3.洗涤不够充分：可以增加洗涤的次数。 4.孵化温度过高：一抗的孵育温度以4°C左右为宜。 5.转印膜选用不当，或者转印膜干燥：一般情况下选用PVDF膜具有较好的转印效果，同时防止膜干燥。 6.较高分子量的高背景也有可能是由于还原试剂、SDS或样品加热方式时长不正确。 三、出现白带或信号迅速减弱 1.一抗或二抗过
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Wetern Blot蛋白印迹实验方法及步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
蛋白免疫印迹法是蛋白质学中常用的检测方法，Wetern Blot-蛋白印迹实验步骤 主要是通过SDS凝胶分离、转印到膜上并进行信号检测的方法。具体实验方法如下： 一、试剂和缓冲液 l 1x RIPA 缓冲液：50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脱氧胆酸钠、 1% Triton X-100 或 NP40。 l 1x PBS 缓冲液：137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4 l BCA 蛋白检测试剂盒或 Bradford 蛋白检测试剂盒 l 1.5 M Tris 缓冲液 (pH 8.8)： 90.68 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 将 pH 调节至 8.8，最后 500 ml l 1.0 M Tris 缓冲液 (pH 6.8)：60.58 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 将 pH 调节至 6.8，最后 500 ml l 10% APS：使用前制备的 1 ml ddH 2 O中的 100 mg AP 。 l 10% SDS：10 g SDS 在 100 ml ddH 2 O 中。 l 1x Tris-甘氨酸缓冲液：Tris配比25 mM； PH=8.3 的甘氨酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。 l 3x SDS 蛋白上样缓冲液配制：使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘油 添加30% 、 EDTA浓度30 mM 和 溴酚蓝 配比0.2% 。缓冲液应随用随配、分装冷冻备用。1x TTBS ： 25 mM Tris（pH 7.5）：0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳汞 l 1x 转移缓冲液：3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 200 ml 甲醇，添加 ddH 2 O 至 1L 二、样品制备 样品也可以在一些商业裂解缓冲液中裂解，例如Thermo Fisher的 Pierce IP 裂解缓冲液 ，而不是 RIPA 缓冲液。 三、细胞培养样品制备 1. 贴壁细胞 l 去除上清液并用 1X PBS 洗涤以去除残留培养基。 l 添加预冷的 400 ul-1 ml 1X RIPA 缓冲液/100 mm 培养皿。在冰上孵育 5-10 分钟。 l 完全刮去细胞并转移到冰上预冷的 1.5 ml 微管中。 l （可选）彻底均质化或超声处理。 l 4°C 12,000 rpm 离心 10-15 分钟，收集上清液备用。 l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。 2. 上清细胞 l （可选）取出 100 ul 等分试样进行细胞计
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实时荧光定量PCR法进行无乳链球菌血清分型的步骤及优点
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
B组链球菌(GBS) 是一种荧光检测带有包膜的革兰氏阳性菌，是新生儿侵袭性感染败血症和脑膜炎的重要原因，GBS血清抗体传统分型法通常需要经过乳胶凝集、多重 PCR 和条带大小分析或全基因组序列分析等步骤，过程繁琐，技术成本昂贵，所以在PCR实验室中采用实时荧光定量PCR 法进行血清分型不仅可以替代乳胶凝集法，还可以改进 GBS 血清型数据的采集。 GBS 细菌菌株分离与培养 将GBS 分离株在胰蛋白酶大豆 (TS) 或 5% 羊血琼脂平板上于37°C 培养，然后在 TS 培养基中于 37°C 培养过夜。 通过乳胶凝集进行血清分型 根据制造商的说明，使用 Immulex Latex Agglutination Streptococcus B 试剂盒（Staten Serum Institute；Copenhagen，Denmark）通过乳胶凝集对所有 GBS 分离株进行血清分型。简而言之，将 10 μl 乳胶试剂添加到悬浮在 10 μl 盐水中的单个 GBS 菌落中。如果 30 秒后可见凝集，则旋转反应并解释为阳性。 实时荧光定量法 PCR 进行血清分型 设计引物和探针以扩增无乳链球菌每种血清型的多糖荚膜基因的区别区域。引物中的寡核苷酸未经修饰和脱盐，探针用荧光探针（5' 6-羧基荧光素 (6-FAM)）和两种猝灭剂标记，并通过高压液相色谱法纯化. PCR实时荧光定量分析 使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 从 GBS 的过夜培养物中提取基因组 DNA。PCR 反应最终体积为 20 μl，由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7.4 μl 无菌水、0.2 μl 正向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 反向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 探针（100 μM 储备液）和 2 μl GBS DNA（25 ng/μl）。在 荧光定量PCR仪器上进行三次反应，并进行软件分析。反应参数如下： 50°C 初始孵育 2 分钟；在 95 °C 下初始变性 10 分钟；在 95 °C 15 秒和 60 °C 1 分钟下进行 35 个 PCR 循环。阳性反应定义为循环阈值（CT ) < 30 对于 50 ng DNA 模板/反应。每次运行都包含阴性对照反应（无 DNA 模板）。实验结果与乳胶凝集进行比较。通过对比实验发现使用实时荧光定
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基因编辑技术 CRISPR/Cas9介绍和调控机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
基因编辑， “何方神圣” 基因编辑是一种对靶基因或转录产物进行敲除、插入和定点突变等精确修饰的基因工程技术，主要通过人工核酸酶实现对基因组的特定基因序列的敲除、插入或精确修饰。目前，主要有三大基因编辑技术，包括：锌指核酸酶 (Zinc finger nucleases; ZFNs) 技术，转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like (TAL) effector nucleases; TALENs) 技术和 CRISPR/Cas9 技术。 ZFNs 是最较早用于基因组编辑的人工合成的限制性内切酶，该酶是异源二聚体，包含 DNA 结合锌指蛋白 (ZFP) 结构域和非特异性 FokI 核酸酶结构域。DNA 切割域的 FokI 核酸酶必须二聚化以切割 DNA。该技术已被用于修饰各种生物体内的内源性基因。 与 ZFNs 的模块化结构一样，TALENs 的羧基末端也含有 FokI 核酸酶结构域，它借助 TALEs (来源于植物致病性黄单胞菌属细菌) 来识别特异性 DNA 碱基对。相较于 ZFNs 技术，其优势在于可以定点识别靶基因，从而使得基因编辑更加准确高效，其脱靶效应以及细胞毒性也得到了显著改善。 图 1. 不同基因编辑手段的对比 2020 年，两位女性科学家 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因发现 CRISPR/Cas9 基因剪刀，而获得 2020 年诺贝尔化学奖。 CRISPR/Cas 系统由一小段 RNA 和一种高效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 组成的系统，该技术不像 TALENs 技术和 ZFNs 技术是依赖于蛋白与靶基因之间的识别，而是由 sgRNA 和靶基因之间形成复合物，从而完成特定基因序列的编辑。 CRISPR/Cas9 技术切割效率相对较高且操作简单，并且可以同时进行多位点的编辑。总之，三种不同的基因编辑技术都有其各自的特点。今天小 M 的“重头戏”，CRISPR/Cas9。 CRISPR/Cas9 的调控机制 在细菌及古细菌中，CRISPR 系统共分成 3 类，其中 I 类和 Ⅲ 类需要多种 CRISPR 相关蛋白 (Cas 蛋白) 共同发挥作用。而来自 Streptococcus pyogenes 的 Ⅱ 型系统只需要一种 Cas 蛋白 (Ca
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免疫荧光与荧光染料解析
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
概述 荧光显微镜的基本原理是借助荧光染料对细胞成分进行高度特异性的可视化观察。这可能是一种与兴趣蛋白质遗传相关的荧光蛋白，如绿色荧光蛋白（GFP）等。如果克隆无法实现，例如在组织学样本上无法实现，则需要使用另一种技术如免疫荧光染色来对兴趣蛋白质进行可视化观察。为此，人们使用抗体来连接不同的荧光染料并将其直接或间接地结合到适当的靶点上。此外，借助荧光染料，荧光显微镜的应用就不再仅局限于蛋白质观察，还能对核酸、多糖和其他结构进行染色，甚至像钙离子这样的非生物物质也能被检出。本文就为大家介绍了几种常用的荧光染料。 免疫荧光 在荧光显微镜下，有两种方法可以显示兴趣蛋白质。可以借助内在的荧光信号，也就是通过克隆从而在基因层面把一个荧光蛋白和一个靶蛋白联系起来；又或者借助荧光标记的抗体特异性结合到兴趣蛋白质上。对于某些生物学问题来说，后者更为实用甚至更为必要。例如，在组织学样本的情况下，通常样本来自不含任何荧光蛋白的生物体，所以不可能使用荧光蛋白。此外，如果有功能性抗体可用，免疫荧光比荧光蛋白技术要快得多，因为荧光蛋白方法必须克隆兴趣基因并将DNA转染到相应细胞中。荧光蛋白的另一个缺点在于其本身就是一种蛋白质。因此细胞内就具备了特定的蛋白质特性，因而可能导致功能紊乱或对所结合的兴趣蛋白产生干扰。当然，值得注意的是，荧光蛋白通常是观察活细胞的**方法。 免疫荧光利用抗体对抗原的特异性结合亲和力。此处可存在两种不同的结构。最简单的方法是使用一种荧光标记的抗体，该抗体与兴趣蛋白结合，称为直接免疫荧光。 大多数情况下会使用两种形式的抗体。第1抗体与靶蛋白结合，自身（1st抗体）没有荧光标记。但与第1抗体结合的第2抗体（2nd抗体）特异性携带荧光染料，这种方法被称为间接免疫荧光。间接免疫荧光有几个优点，一方面会存在放大效应，因为不止有一种第2抗体与一种第1抗体结合。另一方面，针对您兴趣蛋白，不需要一直用荧光染料标记
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