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5/6肾切除致慢性肾衰小鼠模型的制备方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
慢性肾衰竭（chronicrenalfailure, CRF）是指各种肾脏病导致肾脏功能渐进性不可逆性减退，直至功能丧失所出现的一系列症状和代谢紊乱所组成的临床综合征，简称慢性肾衰。伴发心血管病变是CRF高死亡率的主要病因。慢性肾衰动物模型的建立有利于CRF的发病机理，组织形态的变化与生态指标及临床表现的相互关系的研究，是筛选有效药物，阐明疗效机制的重要媒介。 制备CRF动物模型的方法有很多，包括5/6肾切除、肾皮质电灼、冷冻技术、腺嘌呤等，其中应用较为广泛和易行的是5/6肾切除。5/6肾切除手术后残余肾脏较好地模拟了CRF残存的肾脏单位，广泛被应用于CRF**和诊断实验。 1. 制备原理 小鼠5/6肾切除后残存肾单位出现高灌注、高滤过和高压力，进而导致肾小球硬化和残余肾单位的进一步破坏，出现以肾小球肥大、硬化等为主要特点的慢性肾衰竭的肾间质纤维化病变。 2. 手术方法 采用左肾2/3切除、右肾全切除的方式构建5/6肾切除切除小鼠模型。 图1. 左肾2/3切除 3. 检测指标 血清尿素氮（Bun）、血清肌酐（Scr） 图2. 与假手术组（Sham）相比，模型组（CKD）小鼠血清中的Bun、Scr浓度显著升高 手术模型精选案例 大小鼠主动脉弓缩窄（TAC）致心肌肥厚和慢性心衰模型 小鼠急性胰腺炎模型 赛业小动物手术疾病模型平台 可提供100＋种手术模型造模服务及配套分析服务 ☑ 心脑血管系统手术模型 ☑ 神经系统 ☑ 消化系统手术模型 ☑ 肿瘤细胞或组织接种术 ☑ 骨髓或细胞移植术 ☑ 血管导管手术 ☑ 动物给药或病毒、质粒注射 ☑ ...... 以实验“可重复”作为服务标准 我们以实验“可重复”作为金标准，对技术团队进行大量的手术模型操作训练，确保每个模型多个批次之间数据的稳定性。 一站式模式动物技术服务平台，涵盖模型定制、饲养繁育与表型分析 除传统的动物模型定制、饲养繁育服务外，赛业生物可提供标准化的涵盖心血管、肿瘤、免疫、代谢、神经等领域的表型分析服务，真正给您提
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回顾：单细胞转录组技术发展之十年历程
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
俗话说，十年是个风水岭，单细胞转录组技术发展至今十年间，在促进对生物学和疾病的认识上发挥出的巨大潜力有目共睹。那么，十年间单细胞转录组是如何发展至今的？又取得了哪些新的进展呢？今天，让我们跟随Sarah Aldridge和Sarah Teichmann两位大神，一起来回顾单细胞转录组学技术十年发展。 一、过去十年中单细胞转录组学技术是如何发展的？ 单细胞转录组学技术是2009年北大汤富酬老师等人通过少数小鼠原始生殖细胞，基于高通量测序技术，实现了在单个细胞中对mRNA全基因组检测。此后，单细胞转录组学技术不断发展创新，包括标签测序方法（例如STRT-seq和CEL-seq，MARS-seq）、全长测序（例如SMART-seq / SMART-seq2）等。真正实现高通量单细胞测序技术的发展是后续开发的纳米液滴，微孔技术和原位条形码技术。这些技术的发展与完善, 使得单细胞转录组测序技术进入高通量与自动化的全新时代。 图1 单细胞技术的发展历程 单细胞转录组学的实验技术发展，数据处理等不断进步，对于揭示标记基因以及鉴定细胞发育轨迹等至关重要，也正是这些技术的进步，催生出了新一代检测技术——空间转录组学技术。 空间转录组测序能在保留空间位置信息的同时检测基因表达。由Stahl等人开发的空间转录组学测序方法是最早的，可用于检测整个转录组以及空间位置的转录组检测技术（无法达到单细胞分辨率）。而最新发表的研究已经从技术上实现了单细胞分辨率的空间转录组检测。随着单细胞转录组学和空间转录组学的结合，越来越多的细胞图谱出世，这些图谱以高分辨率绘制了所有细胞基因活动的空间位置图。 二、单细胞转录组学正在改变我们对健康和疾病的理解 在单细胞技术发展的推动下，人类细胞图谱（HCA）全球联盟于2016年创立，以绘制人体的“谷歌地图”。单细胞层次的转录组数据在人体上的价值是深远的，健康的人体组织和模型生物参考图谱将为衰老，疾病和精准**提供基础背景（图2）。 图2 单细胞技术的应用 通过人体组织细胞图谱，
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外泌体NfL，轻度创伤性脑损伤后远隔症状的诊断性生物标记物？
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
导读 持续轻度创伤性脑损伤（mTBI）是一种复杂的、异质性的损伤，其病理机制包括神经轴索损伤和血管损伤，并伴有强烈的炎症反应。机械组织损伤后，受损细胞释放外泌体到胞外空间。外泌体可以穿过血脑屏障，并可以从外周循环系统中分离出来，因此可以很容易地从外周循环中检测其含量。外泌体所携带的物质可以使研究人员更加简单方便地对中枢神经系统组织特异性的病理过程做出解析。 本研究通过对具有mTBI病史的退伍军人进行研究，验证了外周循环系统（外泌体和血浆）中候选TBI生物标记物（NfL、IL-6、IL-10、TNF-α和VEGF）与持续性神经行为症状之间的关系。 研究中使用Simoa HD-1分析仪，检测NfL、IL-6、TNF-α、IL-10和VEGF在外泌体和血浆中的浓度水平并进行分析。Simoa HD-1分析仪是一款全自动数字式单分子免疫阵列检测技术平台，是基于其声名显赫的单分子免疫阵列技术（Simoa）开发的超灵敏的蛋白质检测平台，其检测的平均灵敏度是传统技术的1000倍。 发表期刊： Neurology；IF=8.689 原文链接： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32461282/ 研究背景 mTBI与损伤后数年内持续存在的或恶化的神经行为功能障碍有关。常见的创伤性脑损伤（TBI）临床后遗症和合并症，例如脑震荡后遗症（PCS），创伤后应激障碍（PTSD）以及抑郁症都有着明显的症状重叠，并且在持续重复性TBI的患者中可能更严重。 本研究检测了具有mTBI病史的退伍军人的外周血和血浆中候选生物标记物的水平，并探讨其与慢性症状的关系。采用Simoa技术检测了神经丝轻链蛋白NfL、肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）和血管内皮生长因子（VEGF）在外泌体和血浆中的浓度水平。比较了上述候选生物标记物与PCS、PTSD和抑郁症状之间的关系；以及无创伤性脑损伤（对照组）、1-2次mTBI患者和重复性（3次或更多）mTBI患者的生物标记物水平。 样本 参与者被分为不同的TBI组进行分析，具体如下：（1）重复性（3次或更多）mTBI，（2）1-2
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空间转录组技术用于免疫**的研究与展望
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
肿瘤免疫**现状 近年来，免疫疗法，这种通过激活患者的免疫系统来杀死癌细胞的策略，已成为对抗癌症的新希望。目前的免疫疗法主要基于癌症疫苗，细胞因子（例如白介素2），继细胞转移（ACT）和免疫检查点抑制。基于他们的特点，特别针对程序性细胞死亡-1 /程序性细胞死亡配体1（PD-1 / PD-L1）途径的免疫检查点抑制剂已被批准为用于黑色素瘤，淋巴瘤和其他恶性肿瘤。 但是，现有研究显示，只有少数患者对**有积极反应，一些患者最终因**而产生抗药性或遭受不良反应和自身免疫毒性。而出现这种不良反应的原因部分归因于肿瘤微环境（TME）的动态组成。在这里，肿瘤细胞，浸润的免疫细胞和间质之间的复杂相互作用以及免疫细胞群的位置和密度会影响疾病的进展和对**的反应。因此，理解肿瘤的空间信息至关重要，因为可视化肿瘤与介导免疫监视的各种细胞之间的相互作用将增进我们对致病机制和潜在药物的了解。空间背景，包括细胞间距离和特征异质性，也可以与临床结果相关联，以鉴定对免疫疗法反应的预测性生物标志物。同时，分析当前的免疫**策略如何改变TME结构和免疫环境也可以帮助指导未来的**方法。 空间转录组检测技术特点 空间转录组检测技术逐渐受到广大研究学者的青睐，其不仅可以提供研究对象的转录组数据信息，同时还能定位其在组织中的空间位置，这将有助于确定肿瘤异质性的来源，并揭示致病机制、潜在的药物靶标和新型生物标志物。因此，运用该技术可以分析免疫**如何改变TME结构和免疫环境，TME中肿瘤细胞，脂肪组织，血管，三级淋巴结构和基质之间的动态相互作用。 现有的空间转录组检测技术主要有基于原位（in situ）高分辨率的SeqFISH，MERFISH，ISS技术和基于空间Barcode标记的高通量ST（Spatial transcriptomics）技术。其中，Visium空间转录组技术是ST技术的升级版，通过使用空间条形码的脱氧核苷酸微阵列，能够对完整组织切片中的转录组进行定量可视化和分析。 图1 Visium空间基因表达解决方案 Vis
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eRNA与Super Enhancer RNA在转录调控中扮演的角色
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
增强子是真核生物中关键的顺式作用基因调控元件，能有效地促进基因表达。它们可以通过作为转录因子和辅助因子的结合平台来维持转录的精确控制。超级增强子是由一簇典型增强子串联组成的具有更强转录调控能力的顺式元件。而全基因组分析发现增强子和超级增强子可以普遍进行转录，产生eRNA和SE-lncRNA。它们都具有组织表达特异性，而且在影响增强子活性和其他不同机制来调控着基因表达。 这两年eRNA和SE-lncRNA的转录调控作用越来越受到关注，而其在不同生理或疾病状态下调控作用和机制研究开展的还比较少。我们来通过这篇文章的工作了解下在前列腺癌中，利用非编码RNA芯片和生物信息学手段（上海生物芯片有限公司完成ceRNA芯片实验和生物信息分析工作，并作为第一作者和共同通讯作者），怎样筛选前列腺癌特异eRNA和SE-lncRNA，并预测它们潜在转录调控机制和临床应用方向吧。 前列腺癌(Prostate cancer ，PCA)是世界范围内男性最常见的癌症之一。目前前列腺癌特异性表达的eRNA和SE-lncRNA还没有被广泛筛选，其作用机制也亟待研究，这有助于阐明前列腺癌发生、发展的分子机制。文章首先利用 SBC ceRNA芯片对三对前列腺癌与癌旁样本进行了eRNA、 SE-lncRNA和mRNA表达谱分析，鉴定得到差异表达的681个eRNA和292个SE-lncRNA。并对不同实验下鉴定的活性增强子转录eRNA进行了分析，发现不同实验鉴定的活性增强子转录eRNA整体表达没有差异，但STARR-seq鉴定的开放与关闭增强子转录eRNA 的整体表达有明显差异。而SE-lncRNAs的整体表达略高于eRNAs。 图2:(a) STARR-seq在LNCap细胞系鉴定的开放与关闭增强子区eRNA表达值箱线图； (b)SE-lncRNA与eRNA表达值箱线图 接下来对芯片结果进行了验证，首先利用TCGA数据库中前列腺癌数据对结果进行验证，又利用实时荧光定量PCR的方法对已知前列腺癌相关基因和差异表达eRNA进行验证，均与芯片结果吻合。 那么这些eRNA和SE-lncRNA有哪些生物学功能呢？从几百个eRNA和SE-lncRNA如何着手展
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胎盘生长因子试剂盒样品收集、处理及保存方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
胎盘生长因子试剂盒样品收集、处理及保存方法： 1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 佰晔细胞 2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 3、细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4、组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液 5、保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 胎盘生长因子试剂盒注意事项： 1、胎盘生长因子试剂盒应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。 2、实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 3、不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 4、使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。 5、使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6、洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7、底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 8、加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9、按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
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基于自动分割的白粉病定量分析系统Macrobot的优势及应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
Plant Phenomics | "Macrobot": 一种基于自动分割的白粉病定量分析系统 谷物（小麦、大麦、大米、玉米等），已成为人类主要的食物来源，占据了世界每日热量摄入的50%以上。与任何其他作物一样，谷类作物也会受到病原体的不断攻击，但由于谷类作物的疾病会直接影响到它们所提供给人类的营养成分，因此植物病理学家和育种学家都对谷物及其病害格外感兴趣。 白粉病是由多种专性活体营养真菌引起的疾病，会对多种农作物造成大范围的破坏。禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis)是导致小麦和大麦白粉病的病原体。从开始感染到产生新孢子，白粉菌的无性生命周期会在一周内完成：单倍体无性真菌孢子（分生孢子）在接触到植物叶片后的数小时内就会开始萌发，附属生殖管会直接穿透叶片表皮细胞的细胞壁，并形成吸器结构，真菌的活体营养供应机制也会在孢子初次接触叶片的24小时内建立。在后面的几天中，附生生长的菌丝会在最初感染部位附近的植物表皮细胞中形成许多继发吸器，并在约三天后形成肉眼可见的真菌菌落。在随后的几天中，菌丝体会长出大量的孢子，从而完成整个生命周期。在具有额定孢子滴度的受控感染试验中，感染的严重程度和感染区域的大小通常是评定染病等级的重要参数，并以此估计植株对疾病的易感性高低。 由于田间生产规模扩张、气候变化导致的频繁虫害、杀虫剂有效性降低和田间抗病性迅速下降等，对植物病害的管理正变得越来越困难。而在过去的几十年中，对植物及其病原体的基因组学取得了实质性进展，有望抵消上述的负面趋势。但是，只有当基因组数据得到与之相关的表型数据的支持时，才能将基因组信息与特定的性状联系起来。尽管多年来育种学家和研究人员收集了大量有关不同基因型白粉病抗性的数据，但由于大多数据都是在不可控的野外环境下采集，且由不同的研究者目测评估，使得采集到的数据难以重复。 近日，Plant Phenomics在线发表了吉森大学(Justus-Liebig-UniversitätGießen, JLU) Ste
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LI-6800/LI-6400XT 光合仪检查小贴士
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
春节一过，生长季就要开始了。下面是关于LI-6800光合作用测量系统的检查清单，通过这些检查，可确保您的仪器运转正常。 LI-6800便携式光合作用测量系统 ☞ 检查仪器的软件版本，确保升级到最.新（目前最.新的是1.2.2）； ☞ 确认仪器处于出厂校准状态； ☞ 检查主机进气口处的空气过滤器，如有必要，请更换。检查分析器头部的灰尘过滤器，如有必要，请更换。 ☞ 清洁叶室顶部的薄膜，确认其透光度良好，如有必要，请更换。检查叶室闭合时的密封圈弹性，如果弹性变弱，可考虑更换； ☞ 确认管子的快速金属接头的连接性完好； ☞ 用湿纸巾清洁化学药品管底盖连接处的O型圈； ☞ 检查调整叶温热电偶的位置； ☞ 检查电池电量，亏电时请充电； ☞ 如果你有标准气体，可查看分析器的零点和跨度； ☞ 通过点击软件中warmup and system tests来进行整体系统检查。 LI-6400便携式光合作用测量系统 ☞ 在不使用测量系统时，LI-6400的电池要充满电存放； ☞ 确认仪器处于出厂校准状态； ☞ 更换化学药品； ☞ 清洁叶室顶部的薄膜，确认其透光度良好，如有必要，请更换。检查叶室闭合时的密封圈弹性，如果弹性变弱，可考虑更换； ☞ 用湿纸巾清洁化学药品管底盖连接处的O型圈； ☞ 检查调整叶温热电偶的位置； ☞ 查看CO2注入系统中的白色过滤嘴，如通体发黄，请更换。 ☞ 如果你有标准气体，可查看分析器的零点和跨度。
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三种基础培养基的分类与举例应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
培 养 基 培养基是用来供给细胞营养，促使细胞增殖，也是细胞赖以生长的环境。 细胞培养实验中用量最多的就是细胞培养基，虽然细胞培养实验基本技术大同小异，但是每种细胞的培养条件却相差甚远。若偏离某种细胞所需的培养条件，则会导致细胞表达不同的表型。 培养基按照来源分类：在动物细胞体外培养实验中，可使用天然培养基（Natural Medium）或是合成培养基（Synthetic/Artificial Medium）。 天然培养基 源于动物体液或组织分离提取，营养成分丰富且各项条件与体内环境相似，所以培养效果佳，但是由于来源于动物，成分复杂，且批间差较大。 合成培养基 是由高纯度化学成分（无机盐、氨基酸、维生素、含碳物质等）与纯水配制而成，所有成分都是确定且可知其确切含量的。合成培养基根据实验目的又可分为三种： 短时间保存细胞活性 即各类平衡盐溶液，具有特定的pH和渗透压；能维持细胞离开生物体后几小时内的活性。 延长细胞存活时间 即基础培养基，在平衡盐溶液中添加各种有机化合物或血清，配合适当的实验操作条件，可将细胞培养至多代。 特殊功能 即特殊培养基，根据实验目的-诱导分化、增殖等要求，将基础培养基额外添加各类因子的特殊培养基。 目前，合成培养基凭借成分明确且种类繁多等特点和优势占据市场主导地位，也是研究人员的首要选择。 合成培养基成分与功能 培养基一般含有氨基酸、无机盐、维生素、含碳物质和其他营养元素，每种成分对于细胞存活、代谢等功能都有不同影响，不同细胞系需要的成分含量也不同，因此市面上会存在各类培养基配方。 因培养基种类繁多，因而，我们只简单列举了几种常见基础培养基为大家进行介绍。 01 DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）是目前最常使用的改良式Eagle's培养基。DMEM与MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。主要用于快速生长的细胞，分低糖（1000 mg/L）、高糖（4500 mg/L）两种。DMEM含更高浓度的NaHC
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关于HE染色必须知道的真相-数据指标是唯一可用的吗
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
目前，关于肠道的研究如火如荼，在文章或报告中我们经常能看到如下图结果和方法，这就是我们经常用的石蜡切片后进行HE染色，并测量绒毛高度、隐窝深度、以及计算绒毛高度和隐窝深度比，也有测量绒毛或隐窝数量等。这些指标经常用作肠道黏膜屏障功能或反映肠道健康的评价指标，那么这些指标就是唯一可以用的吗？答案当然是否定的。 我们先来了解下肠道绒毛形态相关指标的意义，如下图所示，您应该很快就明白了这些指标的意义吧。这些指标从一定程度上可以反应肠道的状况，比如绒毛高度和隐窝深度的比值经常与动物的生长速度正相关；隐窝深度可反应肠道干细胞活性和功能。但是仅仅这些指标是远远不能代表肠道黏膜屏障功能的。 另外，用来评价肠道黏膜屏障功能技术方法还有多种： • 血浆内毒素 • 循环D-乳酸 • 细菌移位（比如外周血中细菌DNA片段） • 消化道组织酶活（二胺氧化酶 、蔗糖酶等） • 肠黏膜上皮细胞通透性 • …… 在我们以后的文章中会一一介绍。
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免疫研究之IFNAR1基因在人体组织的表达与作用机制探索
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是在免疫、肿瘤等研究领域发挥着重要作用的IFNAR1基因。 基因基本信息 备注：标有√的意为赛业红鼠库有该种保存状态的小鼠 IFNAR1基因研究概况 干扰素（interferon, IFN）是一组天然存在的细胞因子，最初是以其干扰细胞病毒复制的能力而得名。干扰素具有重要的免疫调节、抗病毒、抗血管生成、抗增殖和抗肿瘤活性。根据不同干扰素所传递信号的受体不同，通常将干扰素分为3个主要类型：Ⅰ型干扰素、Ⅱ型干扰素和Ⅲ型干扰素。Ⅰ型干扰素是目前临床上抗病毒**的主力，也是最常用的一类抗生素。 IFN和靶细胞上的受体结合介导其生物学效应。I型干扰素的受体由IFNAR1和IFNAR2两个亚单位组成。IFNAR1结合I型IFN后，可激活对调节生长、存活、分化、病原体抗性和抗病毒免疫至关重要的JAK-STAT信号通路，触发许多蛋白质的酪氨酸磷酸化，包括JAK、TYK2、STAT蛋白质等。可以自身形成活性IFNB1受体，并激活不涉及JAK-STAT途径激活的信号级联（通过相似性）。 图1. 由I型IFN激活的经典Jak/STAT信号通路。IFNAR1相关的Tyk2和IFNAR2相关的Jak1磷酸化STAT2和STAT1，与IRF9一起形成ISGF3复合物。该复合物转运至细胞核，并与顺式元件ISRE（Ifn-stimulated Response Element）结合，从而启动了多个Ifn诱导型基因的转录。 与IFNAR1相关的疾病包括丙型肝炎、黄热病、麻疹、乳头状瘤、病毒感染性疾病等。在其相关的途径中有免疫反应IFNα/β信号途径和DAP12受体在NK细胞中的免疫反应作用。在SARS-CoV-2中，先天免疫系统在驱动局部和全身炎症以及细胞因子风暴中的关键作用已得到证实。这种失调的免疫反应集
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溶瘤病毒概况：病毒选择、作用机制、工艺改造、临床策略
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
溶瘤病毒通过病毒感染，溶解肿瘤，表达免疫调节因子等，从而激活免疫系统，成为一种重要的肿瘤免疫**手段。 本文梳理一下病毒类别及选择，作用机制，工程改造，临床概况，供大家参考。 溶瘤病毒 DNA病毒 文献11 RNA病毒 文献11 临床试验病毒使用概况 文献12 使用最多的是腺病毒（Adenoviruses），其次为单纯疱疹病毒HSV-1（唯一获批的溶瘤病毒产品，Amgen T-VEC使用此病毒），呼肠孤病毒（Reoviruses）和痘类病毒（Poxviruses:）分列3，4位，其余使用较少。 溶瘤病毒抗肿瘤免疫机制 裂解肿瘤细胞，释放肿瘤相关抗原和肿瘤新生抗原（TAAs，TANs），激活特异性免疫应答。 溶瘤病毒可以引起免疫原性细胞死亡（包括坏死，坏死性凋亡，焦亡，细胞自噬死亡，免疫原性凋亡等），诱导损伤诱导分子模式（DAMPs）；而溶瘤病毒的病毒成分，诱导产生病原相关分子模式（PAMPs），二者进而激活机体免疫系统。 溶瘤病毒感染肿瘤细胞可以诱导细胞因子和趋化因子释放，招募更多免疫细胞并活化。 文献11 溶瘤病毒基因工程 1. 肿瘤抗原 溶瘤病毒在肿瘤局部裂解肿瘤释放TAAs和TANs，和肿瘤疫苗类似，但是可能不足以诱导肿瘤特异性T细胞应答。可以通过将TAAs基因整合在病毒基因组，表达更多的TAAs，以增强特异性的T细胞免疫应答。 已开展的临床研究 NCT02285816（MG1Maraba/MAGE-A3, With and Without Adenovirus Vaccine With Transgenic MAGE-A3Insertion in Incurable MAGE-A3-Expressing Solid Tumours，Canadian Cancer Trials Group/Ottawa Hospital Research Institute） 使用MG1 Maraba溶瘤病毒，工程表达 MAGE-A3，**MAGE-A3表达的实体瘤。 NCT02879760（OncolyticMG1-MAGEA3 With Ad-MAGEA3 Vaccine in Combination With Pembrolizumab forNon-Small Cell Lung Cancer Patients，TurnstoneBiologics, Corp）使用MG1-MAGEA3联用K药**非小细胞
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帕金森病致病基因之PRKN
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是和帕金森病相关的PRKN基因。 基因基本信息 备注：标有√的意为赛业红鼠库有该种保存状态的小鼠 PRKN基因研究概况 Parkin是由PRKN基因编码而来的，该基因长达138万bp，是人类最大的基因之一，小鼠和大鼠的PRKN基因的长度也在120万bp左右。人类的Parkin蛋白由465个氨基酸构成，该蛋白是一种E3泛素连接酶，负责将死亡标签——泛素贴在无用的蛋白上，让蛋白酶识别分解。PRKN在人和大小鼠中的基因长度差别不但，但主要形式的RNA却有很大区别，人类的主要转录本的长度几乎是大鼠的2.7倍，不过蛋白的氨基酸碱基数量却是一致的。 Prkn是一种帕金森病（PD）隐性基因，也就是说需要该基因出现隐性纯合时人类才会患病。图1显示的是Parkin蛋白的不同结构和突变。从左到右分别是泛素结合区（UBL），连接区（Linker），0号环指结构域（RING0）, 典型的结构RBR（RING1-IBR-RING2），其中的REP结构富含半胱氨酸。 图1. 人群中突变的位点，红色表示致病位点，黑色表示影响不明。DOI: 10.3233/JPD-160989。 在PD中，Parkin蛋白主要影响线粒体功能，钙离子稳态，突触功能，溶酶体/蛋白酶降解功能，神经炎症，蛋白折叠，凋亡以及氧化和例子损伤；该蛋白同时在肿瘤中发生中也有重要的作用，不正常的Parkin蛋白功能会导致生长增殖抑制不受控，激活持续的增值信号，造成细胞能量失调，抑制细胞死亡，影响基因组的稳定性，诱导血管生成等。 图2. Parkin在帕金森病和肿瘤中的作用。DOI: 10.1007/s12035-018-0879-1。 在正常情况下，Parkin（PARK2）能将CyclinE和其他蛋白标记上泛素，引导蛋白酶对其
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从不同动物组织中提取总DNA的方法及步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
1. 从动物组织中提取总DNA a．取不超过25mg的组织(脾不超过10mg)，剪切成尽可能小的碎片，加入180微升样品裂解液A。 请勿使用过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效果提高。新鲜或冻存的组织均可，但固定过的组织请参考后续的其它步骤进行。 b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。 在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1-3小时内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。 c．清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。 转录活性水平很高的组织例如肝和肾组织，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步骤(步骤1.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤d。 d．最高速剧烈Vortex 15秒。加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。 加入样品裂解液B后需立即Vortex混匀。加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，但大多数情况在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、脾，在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需剧烈晃动或Vortex样品，以尽量破坏凝 胶状物。 e．加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。 加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。 f．把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。 进行本步骤前需将纯化柱置于
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细胞转染技巧及常见问题分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
1. Freestyle™ 293-F细胞的培养：在37℃，125rpm，8% CO2的摇床培养箱中培养；转染当天Freestyle™ 293-F细胞密度达到1.5-2.5×106个/ml时可以进行转染，但细胞存活率需>95%；可以使用生产的台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(C0011)进行细胞存活率检测。 2. 以50ml悬浮培养的Freestyle™ 293-F细胞为例，取两个洁净无菌离心管，分别加入1.25ml不含抗生素和血清的Freestyle™ 293-F细胞培养液；然后其中一管加入50μg质粒DNA，另一管加入100μl Lipo293F™转染试剂，分别用移液器轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。将含有DNA的培养液用枪轻轻加入含Lipo293F™转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置15分钟(室温存放6小时内稳定)。 转染体系体积 10ml 20ml 50ml 100ml 200ml 500ml Lipo293F™转染试剂 20μl 40μl 100μl 200μl 400μl 1ml Freestyle™ 293-F细胞培养液 0.25ml 0.5ml 1.25ml 2.5ml 5ml 12.5ml DNA 10μg 20μg 50μg 100μg 200μg 500μg Freestyle™ 293-F细胞培养液 0.25ml 0.5ml 1.25ml 2.5ml 5ml 12.5ml 单独稀释好的Lipo293F™转染试剂和DNA，混匀并室温静止放置15分钟， 随后加入到培养的悬浮细胞中继续培养48-72小时，后续进行目的蛋白的检测和纯化。 3. 把2.5ml Lipo293F™转染试剂-DNA混合物全部加入到50ml悬浮培养的Freestyle™ 293-F细胞中。由于青霉素/链霉素双抗可能影响重组蛋白的表达，通常不建议在细胞转染时加入双抗；如细胞培养环境容易发生污染，可酌情加入1/5常规用量的双抗。 4. Freestyle™ 293-F细胞在37℃，125rpm，8% CO2的摇床培养箱中继续培养48-72小时后，即可收集细胞进行目的蛋白的检测和纯化。 常见问题： 1. 转染效率低： a. 优化质粒与Lipo293F™转染试剂比例，有必要是可以适当尝试加大质粒用量。 b. 应使用高纯度、无菌、无污染物的质粒进行转染，DNA纯度方面A260/A280比值要接近1.8通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能
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