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线性泛素化在调控IFN抗病毒信号的新机制的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
近年来，蛋白质泛素化成为基因表达调控研究的热点，泛素化在各类细胞信号通路中发挥重要的调节作用。泛素分子通常含有7种内部赖氨酸残基，通过这些残基可与其他泛素分子的甘氨酸C端相连产生分支，形成多聚泛素化修饰。 近年来又鉴定了一种新的多聚泛素链——线性泛素链，由两个泛素N、C端首尾相接而成。已有研究鉴定线性泛素化是由线性泛素化复合体(LUBAC)作为泛素连接酶特异性诱导，该复合体由血红素氧化IRP2泛素连接酶(HOIL-1L)、HOIL-1L互作蛋白(RNF31/HOIP)和SHANK相关域互作蛋白(SHARPIN)组成，同时去泛素化由线性连接特异的OTU去泛素化酶(OTULIN)介导。LUBAC/OTULIN广泛参与NF-kB、IFN、NLRP3、TRIM25等天然免疫相关蛋白的调控，但是具体的机制还未知。 线性泛素化修饰的生物学功能研究主要集中在NF-κB介导的免疫反应和细胞死亡等相关通路中，已经鉴定的线性泛素化修饰的底物仅有NEMO、 IRF3、ASC和TRIM25几个。近期，苏州大学生物医学研究院郑慧教授团队在Nature Communications杂志上发表了题为“Regulation of the linear ubiquitination of STAT1 controls antiviral interferon signaling” 的研究论文，鉴定了线性泛素化修饰的一个新的底物，并首次揭示了蛋白线性泛素化修饰对干扰素(IFN)抗病毒信号的关键调控机制。 郑慧教授团队经过近几年的深入研究，发现信号转导与转录激活因子1(STAT1)在静息细胞中存在强烈的线性泛素化修饰，并通过一系列实验证实了STAT1是一个新的线性泛素化修饰的蛋白底物。 研究人员在细胞中观察到内源性STAT1具有依赖于HOIP的强泛素化修饰，敲低HOIP将导致显著抑制内源和外源STAT1的线性泛素化。敲除细胞HOIP敲除细胞，发现细胞内STAT1完全无法线性泛素化。 接着，研究人员试图探究线性泛素化的生物学意义，实验表明线性泛素化对STAT1介导的天然免疫起到限制作用,线性泛素化起到维持IFN信号稳态的作用。 研究人员进而分析STAT1对IFN下游信号的具体调控机
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来自噬菌体的惊喜--- M13 Antibody (HRP)
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
前言 2018年10月诺贝尔化学奖的一半颁发给了美国科学家George P. Smith和英国科学家Gregory P. Winter, 两人获奖的原因是多肽和抗体的噬菌体展示技术。噬菌体展示技术在生物医药研发中有着十分广泛的应用，是生物新药研发的源头技术，M13噬菌体则被广泛地应用于噬菌体展示技术。M13的酶标抗体,是在噬菌体展示技术筛选结果ELISA检测中不可缺少的试剂。 M13噬菌体 M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13 DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA片段，也不会影响M13 DNA的复制，这为M13 DNA构建克隆载体提供了条件。 噬菌体结构 M13 噬菌体的生物学特性 M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染F+（含F质粒，能产生性菌毛）的大肠杆菌。感染宿主后通常不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。但生长水平比未感染组低。 噬菌体侵染细菌的过程 M13噬菌体载体 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。 在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因 Ⅱ/Ⅳ 和基因 Ⅷ/Ⅲ 之间）。基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因 Ⅹ 也可用来克隆外源片段。 噬菌体载体结构 M13噬菌体展示系统 M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4 kb，编码10种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ 和次要衣壳的pⅢ 、pⅥ 、PⅦ 和PⅨ 。其中，pⅢ 和PⅧ 是噬菌体展示中最常用的两种
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新英格兰医学杂志发表关于新冠病毒引起肺部血管新生异常的研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
研究背景 随着盛夏到来，全球新冠疫情亦进入防控为主的下半场。一方面，不少药物如瑞德西韦和众多新冠疫苗的临床试验纷纷进入到人体实验阶段，为医学界带来了一丝希望，另一方面一些在新冠流行早期不为关注的隐患，比如最近在欧美儿童中出现的川崎病以及新冠病人中更高的中风概率也纷纷浮现。尽管许多研究都已在对新冠的致病机理展开攻关，但是直至现在，医学界对于新冠病毒导致的呼吸衰竭依然未能描绘一个清晰的图像。作为新冠病毒的主要致死原因之一，新冠病毒导致的呼吸衰竭与其他呼吸道疾病和病毒性肺炎有着非常不一样的临床特征，包括早期隐蔽性高，肺部被大量粘液包裹等。与2009年的H1N1全球大流行相比，新冠的致死率更是高出10倍或以上，在医疗资源紧张的地区更甚。因此，新冠绝对不是一个"大号流感"。更好地了解新冠患者外周肺组织中由于病毒侵袭引起的病变和分子机理，对于监控疫苗和各类药物的临床效果有着至关重要的作用。近期，来自美国，德国，瑞士的研究团队合力在新英格兰医学杂志上发表了一篇重磅文章，为新冠病毒在呼吸衰竭中的致病机理带来了全新的视角。 研究设计 研究人员从由于呼吸衰竭致死的7位新冠患者中获取尸检组织，并取得在2009年死于A型流感（H1N1）继发的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的7个尸检肺部组织以及10个年龄与性别相匹配的健康肺部组织以进行比较。其中对照组的健康组织来自器官捐赠的非感染者。所有组织均为石蜡保存组织。通过H&E染色，多重荧光免疫化学组织染色，扫描电镜，微型CT扫描和NanoString多重基因条形码荧光杂交等多个手段，研究人员对这两种病毒性肺炎的组织以及未感染肺部组织进行了病理学及基因表达的深入研究。 研究结果 新冠患者的肺部组织的一个最重要的病变特征是肺部组织的不可逆转的损伤。在全部7例来自新冠患者的肺部组织中，都均具有弥漫性肺泡损伤，并伴有肺泡I型细胞坏死，肺泡2型细胞增生以及肺泡内蛋白沉淀（见下图）。其中4个病例出现局部性变化伴随轻
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常与急性白血病混淆的罕见病-肥大细胞白血病的特异性表现
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
肥大细胞白血病（Mast cell leukemia，MCL）又称为组织嗜碱细胞白血病，约占恶性肥大细胞肿瘤的 15％。 但因其罕见，在体内恶性增殖的晚期表现及症状，又与急性白血病相似，所以很容易与急性嗜碱性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病嗜碱性粒细胞急变或伴骨髓嗜碱粒细胞增多的 AML 混淆。 那么，面对 MCL 有什么相应的诊断策略吗？有哪些特异性表现可以作为诊断的突破口吗？以下临床病例可为您详细解答： //// 病史介绍： 患者男性，59 岁。反复腹泻、乏力、皮疹、消瘦 1 年；面色黝黑，贫血貌，睑结膜苍白，浅表淋巴结不大，B 超示脾脏肿大，肋下 7 cm 可触及，肝脏肿大，肋下 2 cm 可触及。 血常规 ：白细胞计数 18.2×109/L，红细胞计数 1.64×1012/L，血红蛋白 60 g/L，血小板计数 142×109/L。 外周血白细胞分类：中性分叶核粒细胞 22%，淋巴细胞 30%，单核细胞 3%，嗜酸性粒细胞 2%，分类不明细胞 42%，原始细胞 1%，有核红细胞 2 个/100 个白细胞。 初步检查及诊断： 骨髓细胞形态学检查：骨髓增生极度活跃，粒、红二系增生受抑，巨系增生活跃。血小板散在或小簇可见。髓片中分类不明细胞约占 79%，散在或成堆分布。此类细胞胞体大小不一，呈圆形、椭圆形或梭形，胞核圆或不规则，可见单个核、双核、分叶核，部分胞核中可见核仁，胞质中充满深紫色大小不一的颗粒。 细胞化学染色结果：POX（-）100%；PAS（-）10%，（+）14%，（+++）76%；NAS-DCE（+）100%；甲苯胺蓝染色（+）100%； 图 1 骨髓染色 基因检测：骨髓 KIT 基因 F522C 突变。 骨髓活检：骨髓象提示造血组织增生明显活跃，未见幼稚细胞、淋巴细胞、浆细胞增多和聚集。可见一类细胞弥漫单一性分布，胞体小，胞质少，胞核呈圆形的细胞异常增生。巨核细胞数量大致正常，胞体中等，核有分叶，散在分布。骨髓间质骨小梁规则，未见明显纤维化。 该细胞免疫组化结果：CD34（-），CD117（+），髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）显示粒系细胞
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免疫原的设计策略
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
前言 抗体（antibody）是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，是由浆细胞分泌并参与体液免疫的重要分子。众所周知，抗体被广泛用于基础科学研究、病理诊断、检测试剂盒和药物的研发。 针对不同应用的抗体来设计不同的抗原是抗体开发的关键第一步。抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。 为研发生产最优质的抗体，华安生物的小伙伴在免疫原设计上经过无数次的摸索，积累了多年经验。今天，小编就将免疫原设计策略分享给大家~ 常用的免疫原有很多种，如多肽、蛋白、小分子、核酸、糖类及细胞等，但如今最常见的免疫原还是以多肽和蛋白为主。 根据抗体的应用不同，我们对免疫原的设计策略也有所不同。 PART01 应用于基础科学研究的抗体研发 该类抗体的免疫原一般设计为多肽或制备蛋白的片段。目前有不同网站可以用于参考设计多肽，该免疫原设计需考虑多肽亲水性、免疫反应性及种属特异性这三点。如http://tools.iedb.org/main/,该网站列出了B细胞表位，T细胞表位的预测。 图1：蛋白的B细胞表位预测图，不同的片段其B细胞表位的免疫反应性有差异，其中黄色区域的表示有一定的免疫反应 通过比对不同种属的蛋白序列来比较种属特异性，以便测试设计的多肽在不同种属中的差异。 图2：HSP27人蛋白，小鼠蛋白和大鼠蛋白的序列比对 通过序列比对图，我们可以根据最终的抗体要求，进行序列设计。若需要抗体能同时识别不同种属，设计时则优先考虑序列一致的区域；若只需要抗体能特异性识别人蛋白或是小鼠蛋白，设计时就需要找出特异性的片段。图中*表示氨基酸在不同种属中是一致的。 图3：蛋白的三位结构，该蛋白的三维结构，有折叠区，也有线性区域 蛋白三维结构在多肽设计考虑中也是至关重要的。常见的B细胞抗原表位一般会选择线性区域，而非折叠区域或螺旋区
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面对不同样品时如何选择合适的PCR的功能
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
在初次接触PCR仪时，小白们都会有各种各样的困惑。譬如：PCR仪上的热盖和PCR管盖作用一样吗？，不同品牌的热盖都是一样的吗？热启动又是什么意义？两个加热模式哪种情景适用？带着这些问题，小宝给大家一一解答！ 01 众所周知，PCR仪又称热循环仪，是配合PCR过程的专用变温仪器，热盖是仪器上方的一部分，用来避免样品在高温环境下蒸发冷凝在管盖上而减少反应样品体积的风险。 02 PCR又称聚合酶链反应，是体外扩增目的DNA片段的方法，在多方面广泛应用，主要分为三大步骤：高温变性、低温退火、适温延伸。分别添加引物、模板、Taq酶、dNTP和缓冲液等反应物混合，在约为95℃环境下，双链DNA氢键断裂解旋为单链；单链与人工设计的引物在约为60℃温度下，按照碱基互补配对的原则相结合；并升温到72℃左右，利用Taq酶延伸合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 03 在此过程中，某段温度会接近或高于100℃，部分样品会随着高温向上蒸发，遇上温度较低的PCR管盖，则会冷凝在管盖上，管内的样品就会有一定损失，少一部分没有参加循环，造成样品得率降低。 在此之前仪器还不具备这个装置，是通过样品里滴加石蜡油来解决此问题的，但实际上后续对石蜡油的处理较为繁琐。后续热盖的出现能够有效避免该风险，热盖的温度一般都会比模块高5-10℃，这样模块内的PCR管上端温度始终大于反应液的温度，由于高温处压强大于低温处压强，液体不会向上蒸发，于是所有的样品反应液体积不会发生变化。 04 但由于样品管的高度不一，早期的仪器不可调热盖只能用于统一高度的样品管，当使用较矮的样品管时，需要加入铝块，较为麻烦；目前可调式热盖分为旋钮式和自调节式等：有些仪器旋钮式热盖的高度和压力是根据样品管可调整：但换样之前需要将旋钮旋回原位。并且存在压力不好控制的问题：过紧会使样品管变性等；过松则无法达到相应温度影响结果。自调节则可根据样品管高低调节高度。 所谓热启动则是在样品管中添加的Taq酶用于适温延
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Optima XPN系列超速离心机在病毒分离的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
在病毒研究与药物研发中，病毒的分离必不可少。但是病毒颗粒（直径介于20nm-300nm之间1，电镜结果显示病毒直径约为100nm2）和包装产生假病毒的慢病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）等多种类型病毒载体的沉降系数各不相同，而低转速、低离心力无法使病毒沉降，通常需要60,000-100,000×g以上的离心力来进行有效分离。 什么样的离心机才能满足病毒分离的需要呢？ 病毒分离专家贝克曼库尔特推出的Optima XPN系列超速离心机以其卓越性能、安全可靠、操作简单、专业设计等满足高效分离纯化病毒颗粒的需求，助力病毒研究。 1. 生物安全 由于病毒样品本身的高感染性与高污染性，在进行病毒研究时如何保障生物安全至关重要。在进行病毒分离纯化时，为了防止气溶胶污染以及实验环境清洁，必须要使用生物安全离心机（生物安全离心机长什么样）。 Opima XPN系列超速离心机考虑到整体生物安全性设计，通过配备前后两个制药级气体除菌过滤器（PALL），在排出气体及释放真空时保证气体清洁。同时，搭配生物安全转头与多重保护离心管进一步防止病毒样品溢出，提高生物安全性。 制药级气体除菌过滤器 - 采用EMFLON II 制药级气体除菌过滤器，截留精度远高于HEPA，有效防止气溶胶污染。同时双过滤器的安装保障进出气体清洁，提升生物安全等级。 2. 运行安全保障 病毒分离时使用的超速离心机除了需考虑生物安全之外，仪器本身的运行安全同样至关重要。Optima XPN系列具备多重安全检测系统： - 过速检测保证转头转速不高于最高转速 - DRIC动态惯量检测在动态情况下进行转头惯量检测和能量计算，保证仪器的安全运行 - 新颖的插入式（Top-loading）水平转头SW32 Ti和SW32.1 Ti，使用更加方便、安全 插入式SW32 Ti水平转头 3. 操作简单，使用方便 - Optima XPN系列超速离心机具备触幕式15寸超大智能显示屏、可选择中文或英文界面，使可选参数一目了然，简化操作。另外，远程监控与预约系统也使离心机的使用更加方便
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肿瘤靶向**的2个重要信号通路-RAS与mTOR
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
随着肿瘤研究的发展，人们开始认识到不同肿瘤的基因改变和信号通路改变有着很大的不同，针对个体特征的基因改变和信号通路的改变进行研究，是一种有效的肿瘤**战RAS、mTOR都是肿瘤常见的生物标志物，生物标志物检测有助于推动抗肿瘤药物的研发。 RAS癌基因是人类肿瘤中最常见的癌基因，在血液肿瘤和实体瘤中常见RAS基因突变，靶向RAS信号通路**是战胜肿瘤的一个重要途径。而mTOR信号传导上游的H3K、Akt等蛋白都是具有细胞转化、促进肿瘤形成潜能的蛋白，在多种肿瘤的形成中起重要作用，也有不少研究显示，mTOR通路在某些肿瘤活性增高，可作为这些肿瘤**的靶点。也有生物公司目前正在为**癌症的“前沿靶标”开发药物，主要靶向肿瘤**中的RAS和mTOR这两个重要的信号通路。 RAS蛋白可作为分子开关激动下游RAF蛋白激酶（BRAF、CRAF和ARAF）。而RAF蛋白激酶中重要的底物是MAPK/ERK激酶（MEK1，MEK２）。激活ERK激酶可在转录因子调控下，控制细胞周期进展、分化、蛋白质合成、代谢、细胞存活、细胞迁移、入侵和衰老，甚至ERK激酶的激活可以使正常细胞获得许多肿瘤细胞的特征。RAS基因突变较常见于胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、腹膜癌、胆管癌、黑色素瘤等肿瘤，相比之下，淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病肝癌、骨肉瘤，前列腺癌中通常较少包含RAS基因突变。因此RAS基因突变作为免疫靶标生物标志物的研究，开展生物标志物检测，运用生物标志物辅助**选择以及设计**组合将有助于抗肿瘤药物和方法的研发。 广泛存在于各种哺乳动物细胞中，并可参与细胞的生长、增殖、蛋白合成、转录和代谢过程的mTOR，属于丝/苏氨酸蛋白激酶是大环内酯类抗生素西罗莫司的靶蛋白。mTOR上游信号转导途径受多种因素调节，如生长因子、胰岛素、营养(氨基酸)、能量(三磷酸腺苷)及氧等，各种细胞信号激活mTOR信号通路是通过P13K／Akt途径来实现的。mTOR信号传导上游的H3K、Akt等蛋白都是具有细胞转化、促进肿瘤形成潜能的蛋白，在多种肿
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m6A RNA甲基化在发表多篇10+文章的运用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
导读 最近小编检索了关于m6A修饰的文章发表情况，发现目前2020年发表的关于m6A修饰的文章已经达到309篇，已经追平2019年整年度发表篇数，可以预见m6A RNA修饰下半年年发表文章会呈现出爆炸式增长。 图1. 近6年m6A RNA修饰相关文章发表情况（ data from PubMed） 那么您是否已经了解m6A修饰10+ 高分文章的研究思路呢？刚好小编读到一篇关于m6A修饰的文章，可谓也是我们推荐的m6A修饰常见的研究模式（RNA修饰与关键酶），思路之清晰、手段之全面、机制之详尽，其他生物学过程/领域完全或部分都可以套用这篇文章的思路，10 +文章妥妥的！！强烈建议收藏！！让我们来重温如何玩转m6A修饰10+文章！ Molecular Cancer （IF=10.679）杂志刊登了m6A修饰最新研究：m6A依赖的糖酵解增强结直肠癌（CRC）发生发展。该文章采用多组学联合应用技术检测了Mettl3-KO(m6A甲基化转移酶敲除细胞株)和WT HCT116（结直肠癌细胞株）甲基化修饰，这项研究揭示METTL3通过m6A-IGF2BP2/3-依赖性机制稳定HK2和SLC2A1 (GLUT1)在CRC中表达，表明m6A修饰的糖酵解途径可以促进结直肠癌的发展，同时为以METTL3及其途径为靶点高糖代谢的CRC患者提供了合理的**靶点和**方向。 发表期刊：Molecular Cancer 影响因子：10.679 发表时间： 2020.4.3 实验方法: m6A-seq, RNA-seq，MeRIP-qPCR, RIP等（云序可提供以上服务） 文章链接： m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression 文章内容 （1）寻找RNA修饰关键酶METTL3 为了探寻m6A修饰与结直肠癌（CRC）的糖酵解代谢的相关性，采用qPCR检测结直肠癌患者体内脱氧葡萄糖吸收（FDG uptake）和m6A修饰相关酶表达的情况，发现Mettl3（m6A甲基化转移酶）的表达与FDG摄取存在明显的相关性。 图2. 结直肠癌患者体内Mettl3表达与FDG吸收相关 同时检测到在CRC体内Mettl3高表达和葡萄糖代谢强烈保持一致，那么在结直肠癌患者体内FDG和Mettl3的变化是否影响甲基化整体
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细胞实验室的规范维护措施与维持细胞培养环境的安全
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
细胞实验环节中，细胞培养环境至关重要。之前我们已经介绍过鱼骨图，熟悉了影响细胞实验的微小环境。今天逍鹏生物为大家分享细胞实验室的相关规章制度，细胞实验室的使用方法和维护措施，确保细胞实验室得到正常运转，使工作人员熟悉操作并了解相关微生物类（含病毒、细菌等）的潜在危害，避免实验室工作者及实验室内部环境暴露于潜在危害性物质中，且能够在安全的环境下进行技术研发工作。 本次我们介绍生物实验室设备、安全操作规定、废弃物处理及实验室清洁等规定。 PART1 人员进出管制及物品进出管制 01 人员进出管制 ▲ 操作人员示意图 细胞实验室主要由团队内相关实验研究人员使用，原则上不对外开放，其他人员如确实需使用细胞室，必须预先征得实验室负责人和该细胞室负责人同意。 1. 进出细胞室实验室需要严格登记。如有不符合实验室工作和生物安全要求的人员或样本，实验室负责人和细胞室工作人员有权责令整改。 2. 使用人员需参加专门的细胞培养室使用规范培训（无菌技术培训）并通过考核后，方可获准进入细胞实验室进行实验。严禁未经许可擅自进入细胞实验室或使用相关设备。 3. 为维持所有实验区、准备室压差值正常，以维持工作环境安全性，请进出时随手将门关紧，不同区域之间的门不可同时开启，以避免发生污染。 02 物品进出管制 所有进入细胞实验室的物品需经过传递窗，尽量经过紫外灯光照20min，使用酒精表面消毒。 严禁将可能含有污染物或病原菌的实验物品带入细胞室。细胞室内仅放置少量实验必需耗材即可，不得整箱搬入，出现洁净室内物品堆积状况。细胞室内储物柜的物品放置可由相关管理人员安排，并做标记。 PART2 细胞实验室设施介绍 ▲ 实验室设备示意图 01 纯水系统 ▲ 纯化水系统示意图 日常：保持设备及管路外观清洁，定期更换滤芯（1次/3个月）。纯化水系统短期停运期间，每三天需运转1～2小时，正常运行下每一个月进行一次巴氏消毒，遇到停机超过7天或纯化水
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解析泛素-蛋白酶体系统：蛋白质降解的主要途径
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解。泛素对蛋白质来说无异于“死神来了”，一旦被盯上，终将被摧毁。 泛素-蛋白酶体系统降解蛋白的途径包括两个主要阶段。第一阶段为泛素与蛋白底物的相互作用：①高能硫酯键E1（泛素活化酶）-泛素复合物的形成，消耗一分子ATP，并释放一分子单磷酸腺苷（AMP）和一分子焦磷酸；②活化泛素（E1-泛素复合物）转移到E2（泛素结合酶）上，释放出E1，形成高能键E2-泛素复合物；③底物被E3（泛素连接酶）识别并与之结合；④E2-泛素复合物上的泛素转移到E3上，形成高能键复合物，继而底物通过赖氨酸的ε-氨基形成酰胺键与泛素连接，泛素分子逐个相加形成链状结构。第二阶段为蛋白酶体对底物的降解：⑤底物泛素链与蛋白酶体19S的泛素受体相互作用，蛋白底物去折叠，并通过蛋白酶体受体端裂隙进入20S核心颗料内部，被逐步降解；⑥在泛素C-端水解酶、脱泛素酶和寡肽酶的作用下，释放出泛素分子（可再次参与循环）。 泛素-蛋白酶体系统由以下几个组分构成： ①泛素：含有76个氨基酸残基，具有7个赖氨酸残基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63)和一个甲硫氨酸残基(M1)： MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG，分子量约8.5kDa，泛素之间主要通过赖氨酸残基和甲硫氨酸残基进行各种连接，泛素链与蛋白底物的结合形成被蛋白酶体降解的识别信号，根据泛素与底物的连接位点，目前有9种方式的泛素化，包括M1, K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63, G76。不同方式的泛素化调控不同的功能。其中，与蛋白酶体降解相关的泛素化为K48。 泛素衍生物： 货号 名称 描述 SI201 Ubiquitin-WT 人重组泛素 SI202 Ubiquitin-K6 人重组泛素K6（除了K6，其他赖氨酸突变成了精氨酸） SI203
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高通量自动化筛选加速对蛋白质定向进化的影响
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
进化在自然界中每天都在发生，从未停止，由自然选择压力进行筛选，往往需要漫长的时间。近代生物学的发展使人们认识到蛋白质进化大多是由于某些点突变或修饰的积累而形成的。2018年诺贝尔化学奖获得者弗朗西斯.阿诺德，其首次提出了酶的定向进化理论而获此殊荣。 2018年诺贝尔化学奖得主 蛋白质定向进化技术，被广泛的应用于酶分子改造，以改变酶分子的活性和催化效率，改善底物的选择性、pH和温度的耐受性等方面，也可以应用于改善代谢途径、优化代谢网络等，在蛋白质工程、代谢工程和合成生物学领域都发挥了重要的作用。 蛋白质定向进化策略 根据原理的不同，可以主要分为三种策略，随机进化、理性进化，和介于两者之间的半理性进化。这三种方式各有优缺点，其中随机进化的多样性最高，但样本量巨大，筛选困难，常使用易错PCR、DNA Shuffling等技术；理性进化，借助于软件建模，进行分子对接等模拟实验，减少了筛选的工作量，但往往得到的蛋白质活性不高；半理性进化，根据晶体结构进行同源建模，对特定位点进行定点饱和突变的方式，缩小突变文库，提高阳性突变率。 蛋白质定向进化策略及方法[1] 除了理性设计突变外，其他两种进化策略所产生的突变库都需要大量的筛选工作，依靠人工进行筛选，每天重复性的机械操作让实验员感到乏味，巨大的工作量和数据量让项目经理感到崩溃，时间和资金的耗费让老板难以面对。 高通量自动化筛选加速进化过程 想要快速从成千上万的蛋白质中筛选出阳性突变，短时间内完成漫长的自然筛选过程，依靠人工筛选，需要耗费大量人力，并且人员之间的操作误差无法避免，无法实现标准化，导致结果无法完全相互比对，丢失一些阳性突变。 以自动化液体处理工作站为核心的自动化系统，逐渐成为酶定向进化中对突变文库进行高通量筛选的不二选择。自动化系统可以实现突变文库筛选的自动化、高效化、标准化，提高实验通量及效率，缩短酶定向进化过程的筛选周期。 以
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云序RNA修饰技术在华南农大余义勋课题组植物m1A修饰调控机制的运用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
导读 RNA甲基化修饰在调控生物生长发育的过程中起重要作用，m6A和m5C在植物体内的产生机制和生物学功能已有较多研究论文发表，然而RNA m1A（N1-甲基腺嘌呤）修饰在植物中的研究还非常少。 近日，Plant Physiology 在线发表了华南农业大学余义勋课题组题为“The N1-methyladenosine methylome of petunia messenger RNA” 的研究论文。研究结果显示RNA m1A修饰在植物生长发育中起着重要作用。 矮牵牛RNA m1A修饰促进生长发育 发表期刊：Plant Physiology 影响因子：6.305 发表时间：2020.05.27 实验方法: m1A-seq, RNA-seq（云序提供） 此研究由云序生物合作客户华南农业大学余义勋课题组完成的，该课题组利用m1A-seq & RNA-seq（本实验云序提供）技术对矮牵牛花瓣中含m1A修饰的RNA进行全转录组分析，发现乙烯处理降低了花瓣mRNA m1A峰的水平。另外还发现矮牵牛tRNA特异性甲基转移酶61A (PhTRMT61A)的沉默降低了体内和体外mRNA的m1A水平，定位于细胞核内的PhTRMT61A被抑制会导致叶片发育异常。这些研究结果显示RNA m1A修饰可以作为表观转录组调控机制并在植物生长发育中起着重要作用。 矮牵牛m1A峰的motif序列和结构特征 云序生物热门RNA修饰—m5C甲基化 1、NSUN2转移酶调控HEK293细胞mRNA m5C修饰 发表期刊：Epigenomics 影响因子：4.404 发表日期：2019.02.01 实验方法：m5C-Seq，RNA-seq（云序提供） 云序客户扬州大学单位在Epigenomics 杂志利用CRISP/Cas9技术构建NSUN2-/-HEK293细胞系，并利用m5C-Seq和RNA-seq（本实验云序提供）检测mRNA中m5C的修饰水平和基因表达水平。该研究一共检测到1185个修饰和790个表达发生改变的基因。进一步生信分析揭示：发生m5C甲基化修饰能够调节基因表达，并且这些差异表达基因能够显著富集到与细胞增殖相关的信号通路上。同时作者还发现，下调NSUN2能够显著抑制HEK293细胞的增殖和迁移，其中GRB2和CD44可能是NSUN2调节细胞增殖的关键调节因子。该研究阐述了NS
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人源血清学检测二抗的选择标准
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
血清学检测是许多健康问题诊断过程中的关键检测方法，包括器官移植筛查，交叉匹配，疾病诊断，监测等。这些检测在临床决策中起着至关重要的作用，免疫分析是目前可用的最强大，最灵敏的血清学检测方法之一，它基于抗原抗体之间的高度特异性结合，即使在低浓度下也能进行定性和定量检测。有多种免疫测定方法，以下是其中最常见两种检测方法示意图，分别是夹心法（图1A）和直接法（图1B），当选择用于夹心法检测的抗人二抗时（图1A），需要考虑一抗的种属，并使用与该物种有最小交叉反应的二抗。 图1：测定方式：A.夹心法，B.直接法 免疫分析在多种疾病诊断起重要作用 各类免疫测定技术各有优缺点，例如，快速测定法（如胶体金侧向流动法）可在数min 内提供定性结果，可进行即时检测，而ELISA可能需要花费数小时才能完成，但可提供定量数据。 而当前严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行更加凸显了侧向流动分析的优势，由于该疾病具有快速传播和较高的死亡率等特征，美国FDA已采取相关措施，允许各州未经FDA批准就可开展新的SARS-CoV-2检测。该修订允许使用快速检测试剂盒，该试剂盒定性检测患者针对SARS-CoV-2产生的IgG和IgM抗体，从而显著加大了SARS-CoV-2的检测能力，尽可能地减少病毒的传播。尽管侧向流动检测具有明显的优势，但这种分析方法无法提供定量的数据。 表1.几种类型的免疫测定法的优缺点，检测过程，检测的Ig类型 免疫测定方法 检测过程 可检测免疫球蛋白亚型 快速测试/横向流动（胶体金） 胶体金层析试纸条主要由4个部分组成：在样品区滴加样品后，借助毛细作用，样品泳动至玻璃纤维膜，金标复合物溶解，并与样品进行抗原抗体反应，形成复合物，继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，带有金标记的复合物被检测区抗原或抗体捕获，呈现条带。而质控线不管有无目的样本，都会与金标抗体进行结合并显色
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贝克曼离心技术在新冠疫苗研发的运用
作者：德尔塔 日期：2022-04-15
有效药物与疫苗是防控新冠疫情的制胜武器。疫情发生以来，国内外多家科研机构和制药公司兵分多路，与时间赛跑，全力以赴开发有效抗病毒药物与疫苗。 贝克曼库尔特生命科学事业部作为一家以“服务健康中国2030”为愿景的公司，一直关注疫情发展，全力支持前线的同时，旗下的多款产品助力新冠**药物与疫苗研发，如之前提到的Biomek自动化工作站、Vi-Cell系列细胞计数和活力分析仪（请参考《浅谈加速新冠**药物与疫苗研发的两种途径》）。而离心技术作为生命科学领域的一项基础技术，贯穿整个药物与疫苗研发、生产、质控的过程。贝克曼离心机全线产品满足新冠病毒药物与疫苗研发中对于仪器的需求，并提供技术支持与保障。 我国目前新冠疫苗的研发按照灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体活疫苗、核酸疫苗五条技术方向稳步推进。不同类型的疫苗各有其优缺点，在研发上也各具特点。 图1：新冠疫苗研发路径 灭活疫苗 灭活疫苗是一种经典的疫苗形式，是指病原微生物经培养、增殖，用理化方法灭活后制成的疫苗。目前我国两款新冠病毒灭活疫苗获得国家药品监督管理局许可，启动临床试验，分别由国药集团中国生物武汉生物制品研究所、北京科兴中维生物技术有限公司开发。制备灭活疫苗的工艺流程包括病毒培养、灭活病毒、纯化病毒、加入佐剂等几个关键环节。一般通过动物器官培养、鸡胚培养或细胞培养来得到病毒样品。收获病毒颗粒后进行灭活，并进行纯化精制，从而获得高纯度的目标病毒。 图2：基于细胞培养的灭活疫苗典型开发流程 贝克曼离心机产品线提供了一系列高性能的离心机和转头,以便研究人员选择符合其疫苗生产相关步骤需求的离心系统。基于细胞与鸡胚的疫苗生产流程中，Avanti JXN-26智能型高效离心机可配备最大容量为6 升的JLA-8.1000定角转头与连续流转头，满足大体积样品的分离与更高的离心效率。病毒经灭活、过滤富集后，借助超速区带离心 - 在蔗糖溶液中按照颗粒的大小和形
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