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原代细胞核膜的分离
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
原代细胞核膜的分离 试剂和器材： 1. DNA酶Ⅰ； 2. KCl（1mol/L溶于20mmol/L Tris-HCl，pH7.4）； 3. MgCl2（1mol/L储存液）； 4. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（无水乙醇配制的1mol/L储存液）； 5. 纯化的细胞核； 6. 缓冲液：2mmol/L Tris-HCl，pH7.4； 7. 膜悬浮缓冲液（ESB）：0.25mol/L蔗糖、2mmol/L Tris-HCl，pH7.4； 8. 梯度溶液：1.0mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2.0mol/L的蔗糖溶于2mmol/L Tris-HCl，pH7.4； 9. 除了MgCl2外的所有溶液须含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟； 10. Abbé折光计； 11. 高速离心机，配有固定角转子和离心管； 12. 超速离心机，配有固定角和吊桶式转子、离心管； 13. 相差显微镜； 14. 紫外分光光度计（配石英比色皿）； 实验方法： 除特殊注明外，所有操作均在0—4℃下进行。 1. 将纯化的原代细胞细胞核浸于缓冲液中孵育10min使之膨大去凝缩。之后约10000g离心10min，用缓冲液重悬沉淀，并重复这一步骤2次； 2. 用含DNA酶Ⅰ（0.01g/L）的缓冲液重悬凝胶样溶胀的细胞核沉淀。充分混匀并室温孵育30min，孵育的中途将上清调节至含约0.1mmol/L MgCl2。随着DNA被切割裂解，染色质很快失去了凝胶状特性。可通过相差显微镜检测核膜“影子”的产生； 3. 采用固定角转子或吊桶式转子，约60000g离心30min； 4. 用缓冲液重悬核膜粗产物，并再次离心。重复这一步直至DNA释放为止（即监测上清在280nm下的吸光度，直至达到一很低平台）； 5. 选择性地用KCl溶液洗涤获得地核膜，以加速离子结合蛋白，尤其是组蛋白的去除。然后约60000g离心30min； 6. 将核膜用核膜悬浮缓冲液重悬，覆盖配制的4个梯度溶液，置于吊桶式离心机中离心若干小时或过夜，以收集核膜等密度层； 7. 纯化的核膜应该主要聚集在1.5mol/L与1.8mol/L两蔗糖层的界面，用巴斯德吸管小心地从梯度液中移出核膜层； 8. 通过相差显微镜，或者通过琼脂糖包埋进行负染和/或薄片电镜，检查核膜的完整性； 9. 对纯化标本进行必须的生化分析，如SDS-PAGE或是酶
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原代细胞中期染色体的分离
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
原代细胞中期染色体的分离 试剂和器材： 1. 秋水仙胺； 2. 2-甲-2，4-戊二醇缓冲液：1mol/L 2-甲-2，4-戊二醇、0.5mmol/L CaCl2、0.1mmol/L Pipes-NaOH，pH6.8； 3. 梯度溶液：用2-甲-2，4-戊二醇缓冲液配制成280g/L、580g/L和600g/L的Nycodenz○R； 4. 二甲基二氯硅烷（10g/L浓度溶于四氯化碳中）； 5. 低速离心机与高速离心机； 6. 高速离心机，配吊桶式转子； 7. 用于吊桶式转子的15ml Corex管； 8. 23号注射器，带金属套管针； 9. 相差显微镜； 10. 双室梯度仪或者Gradient MasterTM； 实验方法： 1. 用二甲基二氯硅烷处理Corex管5min，然后60℃烘烤24h； 2. 向培养基中添加6×10-5g/ml的秋水仙胺，使培养原代细胞停滞在细胞分裂的中期，并孵育3h； 3. 轻轻振摇以选择性分离中期细胞，对分离的原代细胞4℃预冷20min，300g离心5min使之沉淀； 4. 用2-甲-2，4-戊二醇缓冲液重悬原代细胞并洗涤，之后再沉淀细胞（同步骤3）； 5. 以相同的缓冲液重悬细胞（细胞浓度应小于2g/L），37℃孵育10min，用23号注射针抽吸细胞悬液数次以裂解细胞，通过相差显微镜观察监视裂解过程； 6. 2000g离心10min以沉淀染色体； 7. 在处理过的Corex管中用等体积的280g/L和580g/L Nycodenz○R制备10ml梯度溶液，并将用600g/L Nycodenz○R悬浮的染色体沉淀放置于管底； 8. 16300g离心10min，染色体带（密度约为1.23g/ml）大约处于梯度的2/3位置； 9. 原代细胞中期染色体可以通过显带法染色；
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显微镜的四大光学原理
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
一．折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现像，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角。 二．透镜的性能 透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称“焦点”，通过交点并垂直光轴的平面，称“焦平面”。焦点有两个，在物方空间的焦点，称“物方焦点”，该处的焦平面，称“物方焦平面”；反之，在像方空间的焦点，称“像方焦点”，该处的焦平面，称“像方焦平面”。光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。 三．影响成像的关键因素—像差 由于客观条件，任何光学系统都不能生成理论上理想的像，各种像差的存在影响了成像质量。下面分别简要介绍各种像差。 1．色差 色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。白光由红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 七种组成，各种光的波长不同 ，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。光学系统最主要的功能就是消色差。 色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置观察都带有色斑或晕环，使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。 2．球差 球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不在是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响成像质量。 球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的补
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电子快门的方式——全局快门和卷帘式快门
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
常见的电子快门的方式有Global shutter（全局快门） 和 rolling shutter（卷帘式快门）两种，全局快门是通过整幅图片在同一时间曝光实现的。传感器的所有像素点同时收集光线，同时曝光。当预设的曝光时间到了，传感器停止收集光线，并将曝光图像转成电子图像。在这个过程中，并没有实际意义上的快门存在。在曝光开始的时候，传感器开始收集光线；在曝光结束的时候，光线收集电路被切断，传感器读出值即为一副图片。 卷帘式快门与全局快门不同，它是通过控制芯片逐行曝光的方式实现的。卷帘式快门也没有实际意义上的快门，而是通过通断电控制传感器，使其不同部分在不同时间下对光的敏感度不同。逐行进行曝光，直至所有像素点都被曝光。当然，所有的动作在很短的时间内完成，一般情况为1/48至1/60秒。需要注意的是，卷帘式快门采用的是逐行曝光的方式。假如物体或摄像头在拍摄期间处于快速运动状态，拍摄结果就可能出现“倾斜”、“摇摆不定”或“部分曝光”等任一种情况。 卷帘式快门是逐行顺序曝光，所以不适合运动物体的拍摄。当采用全局快门方式曝光时，所有像素在同一时刻曝光，类似于将运动物体冻结了，所以适合拍摄快速运动的物体。但是全局快门可能出现像糊现象。像糊现象出现与否取决于曝光时间的长短。假如曝光时间过长，且物体运动过快则会出现像糊；假如曝光时间很短，类似于运动物体在瞬间被冻结了，则少有像糊。两者对比如下图：
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原代细胞核孔复合物的分离
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
原代细胞核孔复合物的分离 试剂和器材： 1. 肝素； 2. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（溶于乙醇中配制成1mol/L储存液）； 3. 纯化的核膜； 4. 提取缓冲液（EB）：含1%（体积分数）Triton X-100的10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）、0.1mmol/L苯甲基磺酰氟； 5. Tris缓冲液：2mmol/L Tris-HCl、pH7.4，10mmol/L Tris-HCl、pH7.4； 6. 梯度溶液：0.25mol/L蔗糖溶液和1.5mol/L蔗糖溶液溶于10mmol/L Tris-HCl，pH7.4； 7. 所有溶液须含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟； 8. 梯度收集器； 9. 高速离心机，配有固定角转子和离心管； 10. 超速离心机，配有固定角和吊桶式转子、离心管； 11. 超声发生器（探针型，带有定时器）； 12. 双室梯度仪或者Gradient MasterTM； 实验方法： 1. 采用提取缓冲液，4℃抽提原代细胞核膜30min； 2. 20000g离心30min，松散地沉淀核孔复合物薄片。用2mmol/L Tris-HCl、（pH7.4）小心重悬沉淀，再次离心； 3. 用10mmol/L的Tris-HCl（pH7.4）小体积重悬沉淀（如1ml），并在冰浴上超声处理。为防止样品产热，超声过程中重复短时间处理（如10s），中间间隔冷却； 4. 通过制备负染标本，如用20g/L钼酸铵（pH7.0）或50g/L钼酸铵-1g/L海藻糖（pH7.0）进行电镜分析，及时监测核膜的破裂以及核孔复合物的释放。如果必要的话，继续超声处理； 5. 将样品加于0.25—1.5mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCl（pH7.4）线性密度梯度溶液上，4℃、约60000g离心1—2h； 6. 从蔗糖梯度溶液中部分收集； 7. 采用负染电镜检测收集各成分内容物，以确定核孔复合物沉淀在蔗糖梯度溶液中的位置，并进行完整性分析； 8. 对梯度成分进行SDS-PAGE，检测蛋白分离情况；
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原代细胞核基质的制备
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
原代细胞核基质的制备 试剂和器材： 1. 硫酸铵（含10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）及0.2mmol/L MgCl2的1mol/L与0.2mol/L硫酸铵溶液）； 2. 氯化镁（1mol/L储存液）； 3. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（无水乙醇配制的1mol/L储存液）； 4. 纯化的细胞核保存于含0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）、5mmol/L MgCl2的溶液中； 5. DNA酶Ⅰ； 6. Tris-HCl（1mol/L储存液，pH7.4）； 7. 悬浮缓冲液（SB）：5mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl，pH7.4（含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟）； 8. Triton X-100； 9. 低速离心机，配有固定角转子和离心管； 实验方法： 所有的试剂置于0—4℃，并且所有操作均在0—4℃完成。 1. 向核悬液中加入Triton X-100使其浓度达到1%（体积分数），孵育30min同时用移液器小心混匀，以免产生气泡； 2. 1000g离心10min，弃去上清。用悬浮缓冲液小体积重悬提取的核沉淀（如5ml）； 3. 用DNA酶Ⅰ（30U/mg DNA）消化细胞核30min； 4. 通过缓慢添加1mol/L硫酸铵溶液来增加盐浓度，使其最终离子强度达到0.6（0.2mol/L 硫酸铵），加入0.2mol/L硫酸铵使体积达到40ml，然后孵育30min； 5. 1000g离心15min沉淀核基质，弃去上清； 6. 用悬浮缓冲液重悬沉淀，用相差显微镜或薄片电镜检测获得的产物；
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原代细胞核仁的制备
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
原代细胞核仁的制备 试剂和器材： 1. 悬浮缓冲液：0.34mol/L蔗糖、0.05mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl，pH7.5； 2. 密度阻滞溶液：0.88mol/L蔗糖、0.05mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl，pH7.5； 3. 按要求向溶液中加入蛋白酶抑制剂； 4. 吊桶式低温低速或高速离心机； 5. 超声发生器； 6. 光学显微镜（相差或普通光学显微镜）； 实验方法： 所有操作须在0—4℃完成。 1. 将纯化的原代细胞细胞核溶于悬浮缓冲液中； 2. 超声处理悬液10—15s，中间间隔30—40s； 3. 用1g/L美蓝染色，通过相差或普通光学显微镜监测核的破裂。通常原代细胞细胞核完全破裂需要40—60s的超声处理； 4. 在离心管中，将超声处理物加入到一半体积的密度阻滞溶液上，2000g离心20min并收集核仁沉淀；
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用差速离心法从大鼠肝脏中分离原代细胞重线粒体组分
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
用差速离心法从大鼠肝脏中分离原代细胞重线粒体组分 试剂和器材 1. 甘露醇缓冲液：0.2mol/L甘露醇、50mmol/L蔗糖溶液、10mmol/L KCl、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4； 2. 玻璃棒； 3. Dounce匀浆器（20—30ml宽松配制，Wheaton B型）； 4. 高转矩桥式电动机（半导体开关控制）； 5. 高速离心机，配有可容纳40—50ml离心管的固定角转子低速冷冻离心机； 6. Potter-Elvehjem匀浆器，20—40ml间隙为0.07mm； 7. 注射器（内径约0.8mm），带金属套管针； 实验方法： 所给体积适用于约10g的肝脏。第6步以后所有操作须在0—4℃下进行。 1. 对一雄性大鼠过夜禁食，使其糖原耗尽； 2. 颈椎脱臼法处死大鼠，迅速切除肝脏并称重； 3. 将肝脏转移到置于冰上的烧杯中，用剪刀小心地剪碎（肝脏碎片的大小不得超过3mm3），然后用甘露醇缓冲液混悬（每克肝脏使用约4ml缓冲液）； 4. 将一半的液体和组织碎片倒入Potter-Elvehjem匀浆器，用研杵上下研磨5—6次（旋转速度约为700r/min），另一半的样品也重复该操作； 5. 将匀浆液平分到2个离心管中，并于1000g离心10min； 6. 倾倒上清后，放置在冰上。取30ml缓冲液重悬沉淀，用Potter-Elvehjem匀浆器的研杵研磨2—3次进行匀浆，并重复步骤5操作； 7. 倾倒后合并上清，再于1000g离心10min； 8. 用连在20ml注射器的金属套管针去除上清； 9. 4000g离心上清15min； 10. 用金属套管针和注射器去除4000g离心所得上清。为尽可能除去上清，针头尽量靠近凹液面； 11. 同样将致密的棕色沉淀上堆积的疏松粉红色物质小心地吸出，用纸片擦拭管内壁以去除附着液体； 12. 每管加入10ml缓冲液，用玻璃棒搅拌自然状态下重悬沉淀； 13. 在Dounce匀浆器中用研杵轻轻地研磨3次以完成重悬； 14. 用缓冲液补偿到原体积，再倾倒至新管中； 15. 重复步骤9—14 3次； 16. 最后，将纯化了的重线粒体重悬于合适的介质中（与后序分析相一致）；
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用Nycodenz○R不连续梯度溶液纯化酵母线粒体
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
用Nycodenz○R不连续梯度溶液纯化酵母线粒体 试剂和器材： 1. 酵母原生质体制备于山梨醇缓冲液中； 2. NycoprepTM Universal（600g/L Nycodenz）； 3. Nycodenz○R工作溶液：500g/L Nycodenz； 4. 山梨醇缓冲液：0.6mol/L山梨醇、20mmol/L Mes-KOH，pH6.0； 5. 山梨醇缓冲液（2×）：1.2mol/L山梨醇、40mmol/L Mes-KOH，pH6.0； 6. 悬浮缓冲液：0.6mol/L山梨醇、20mmol/L Mes-KOH，pH7.4； 7. 按要求向溶液加入蛋白酶抑制剂； 8. 高速离心机，配有8×50ml规格固定角转子； 9. 超速离心机，配有可容纳12—13ml管吊桶式转子； 10. Dounce匀浆器（约40ml紧密配制，Wheaton A型）； 11. Dounce匀浆器（约40ml宽松配制，Wheaton B型）； 实验方法： 所有操作须在0—4℃下进行。 1. 使用紧致配制Dounce匀浆器用研杵研磨15次来匀浆原生质体； 2. 用等体积的山梨醇缓冲液稀释，并用固定角转子在1500g转速下离心5min； 3. 轻轻倒出上清液，并保留沉淀； 4. 用山梨醇缓冲液将沉淀重悬到原体积，再重复第1、2步操作； 5. 合并所有上清液，在12000g转速下离心10min； 6. 将粗制的线粒体沉淀在约40ml的山梨醇缓冲液中重悬，用宽松配制的Dounce匀浆器轻轻地研磨几次； 7. 1500g下离心5min，以去除剩余的核和碎屑； 8. 用带金属套管针的注射器将上清去除，当心不要搅到疏松堆积的沉淀； 9. 12000g将上清离心10min，在约4ml的山梨醇缓冲液中重悬沉淀（使用宽松配制的Dounce匀浆器）； 10. 从25ml山梨醇缓冲液（2×）和18ml（和14.5ml）500g/L Nycodenz工作溶液来制备两种180g/L和145g/L的Nycodenz溶液；用水将每种溶液配制到50ml； 11. 在适用于吊桶式转子的管中装入这些Nycodenz溶液各5ml以及约2ml的粗制线粒体混悬液（若有必要，用山梨醇缓冲液注满）； 12. 在约200000g下离心30min。纯化的线粒体在两种Nycodenz溶液界面上呈带； 13. 用带金属套管针的注射器收集区带；用4倍体积的悬浮缓冲液来稀释；12000g离心15min，在悬浮缓冲液中重悬
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从组织和培养细胞中制备轻线粒体组分
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
从组织和培养细胞中制备轻线粒体组分 试剂和器材： 1. 匀浆介质：0.25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4； 2. 按要求向溶液加入蛋白酶抑制剂； 3. 磷酸盐缓冲液； 4. 低速冷冻离心机，配有30—40ml离心管的吊桶式离心转子； 5. 高速离心机，配有30—40ml离心管的固定角转子； 6. 用于肝脏：Potter-Elvehjem（聚四氟乙烯树脂和玻璃）匀浆器（30—40ml），连接高转矩桥式电动机（半导体开关控制）； 7. 用于细胞：滚珠轴承匀浆器或带23号或25号针头的注射器； 8. Dounce匀浆器（宽松配制，Wheaton B型）； 9. 20ml规格注射器（内径约0.8mm），带金属套管针； 实验方法： 所有操作须在0—4℃下进行。 1. 对肝脏：用剪刀非常细微地剪碎组织（或使用组织切碎机），用匀浆介质转移到Potter-Elvehjem匀浆器中（每2.5g组织使用10ml介质）。研杵研磨6次左右进行匀浆（500—700r/min）； 2. 对细胞：在5ml磷酸盐缓冲液中洗涤（1—3）×108个细胞，再换用匀浆介质进行洗涤。在3ml匀浆介质中混悬细胞，在滚珠轴承匀浆器中来回5次匀浆； 3. 800g下离心10min，沉淀核、细胞碎屑和未破碎细胞； 4. 倾倒或吸取（使用针管和注射器）上清，置于冰上； 5. 在宽松配制Dounce匀浆器中研杵研磨2—3次进行匀浆，使用10ml匀浆介质重悬沉淀（细胞则使用5ml）； 6. 重复离心，合并上清； 7. 将合并的上清在3000g下离心10min； 8. 将第7步得到的上清在15000g下离心10min； 9. 用10ml（细胞对应5ml）匀浆介质重悬轻线粒体沉淀，在宽松配制Dounce匀浆器中用研杵轻轻地研磨2—3次； 10. 15000g下离心10min； 11. 在适当的介质中重悬沉淀用于分析或进一步处理；
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机器视觉LED光源性能优势及类别
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
机器视觉具有三大技术优势：采像技术，处理技术及运动控制技术。视觉光源的选择是为了将被测物体与背景尽量明显分别，获得高品质、高对比度的图像。而且视觉光源的正确选择，直接影响系统的成败，处理精度和速度。 机器视觉光源的种类 理想的光源应该是明亮，均匀，稳定的，视觉系统使用的光源主要有三种，高频荧光灯、光纤卤素灯、LED（发光二极管）照明。 1、高频荧光灯：使用寿命约1500－3000小时。优点：扩散性好、适合大面积均匀照射；缺点：响应速度慢，亮度较暗； 2、光纤卤素灯：使用寿命约1000小时。优点：亮度高，缺点：响应速度慢，几乎没有光亮度和色温的变化； 3、LED灯：使用寿命约10000－30000小时，可以使用多个LED达到高亮度，同时可组合不同的形状，响应速度快，波长可以根据用途选择。 LED光源的性能优势 1、可制成各种形状、尺寸及各种照射角度； 2、可根据需要制成各种颜色，并可以随时调节亮度； 3、通过散热装置，散热效果更好，光亮度更稳定； 4、使用寿命长（约3万小时，间断使用寿命更长）； 5、反应快捷，可在10微秒或更短的时间内达到最大亮度； 6、电源带有外触发，可以通过计算机控制，起动速度快，可以用作频闪灯； 7、运行成本低、寿命长的LED，会在综合成本和性能方面体现出更大的优势； 8、可根据客户的需要，进行特殊设计。 LED光源的颜色 1、主要颜色：红色、蓝色、绿色、白色 2、其他颜色：橙色、红外、紫外 维视图像LED视觉光源，具有亮度可调、低温、均衡、无闪烁、无阴影，亮度、色温一致，使用寿命长等优点。公司致力于不断开发新的产品和完善其功能，提供多种机器视觉产品，免费提供测试，并协助提供整体解决方案它已广泛应用于各个行业。用户可以根据使用环境及使用范围的不同，选择合适的光源种类、颜色以及照明方式，使得检测系统达到最佳的性能，获得最优的检测结果。
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工业相机的种类及CCD、CMOS相机简介
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
工业相机（亦称作“机器视觉相机”）由两大基本部件组成：图像感光芯片和数字化的数据接口。 图像感光芯片由数十万至数百万个像素组成。像素把光线的强度转换为电压输出。 这些像素的电压被以灰度值的形式输出，所有像素放在一起就形成了图像，发送给计算机。数据接口主要有USB 2.0、1394和千兆以太网三种。 相比于传统的民用相机（摄像机）而言，它具有高的图像稳定性、高传输能力和高抗干扰能力等，“工业相机”一词或许不是很准确，因为这些相机还同时被应用在医疗、科研和安保等领域。 工业相机的分类 任何东西分类一定有它自己的分类标准，工业相机也不例外，按照芯片类型可以分为CCD相机、CMOS相机；按照传感器的结构特性可以分为线阵相机、面阵相机；按照扫描方式可以分为隔行扫描相机、逐行扫描相机；按照分辨率大小可以分为普通分辨率相机、高分辨率相机；按照输出信号方式可以分为模拟相机、数字相机；按照输出色彩可以分为单色（黑白）相机、彩色相机；按照输出信号速度可以分为普通速度相机、高速相机；按照响应频率范围可以分为可见光（普通）相机、红外相机、紫外相机等。 CCD相机和CMOS相机 目前市面上工业相机大多是基于CCD（Charge Coupled Device）或CMOS（Complementary Metal Oxide Semiconductor）芯片的相机。 CCD是目前机器视觉最为常用的图像传感器。它集光电转换及电荷存贮、电荷转移、信号读取于一体，是典型的固体成像器件。CCD的突出特点是以电荷作为信号，而不同于其它器件是以电流或者电压为信号。这类成像器件通过光电转换形成电荷包，而后在驱动脉冲的作用下转移、放大输出图像信号。 典型的CCD相机由光学镜头、时序及同步信号发生器、垂直驱动器、模拟/数字信号处理电路组成。CCD作为一种功能器件，与真空管相比，具有无灼伤、无滞后、低电压工作、低功耗等优点。以维视数字图像技术有限公司生产研发的MV-VS-L系列1394接口一体化工业CCD相机为例，
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碘克沙醇梯度提取哺乳动物原代细胞过氧化物酶体
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
碘克沙醇梯度提取哺乳动物原代细胞过氧化物酶体 试剂和器材： 1. OptiPrepTM（600g/L的碘克沙醇）； 2. 匀浆介质：0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、1g/L乙醇、5mmol/L 3-吗啉基丙磺酸（MOPS），pH7.2； 3. 稀释剂：6mmol/L乙二胺四乙酸、6g/L乙醇、30mmol/L MOPS，pH7.2； 4. 1mol/L 蔗糖溶液； 5. 按要求向匀浆介质和稀释剂中加入蛋白酶抑制剂； 6. 使用匀浆介质制备好的线粒体组分； 7. Dounce匀浆器（10ml宽松配制，Wheaton B型）； 8. 两室梯度制备仪或Gradient MasterTM； 9. 5ml注射器（内径大约为0.8mm），带金属套管针； 10. 超速离心机，配有容纳30—40ml体积的固定角离心转子，最大转速大约为100000g，另带大约30ml容量的厚壁管； 11. 梯度收集器； 实验方法： 哺乳动物原代细胞培养。 原代细胞收集后，所有操作均在0—4℃进行。 1. 使用碘克沙醇、稀释剂、1mol/L蔗糖溶液和水分别根据不同的体积比配制一下梯度溶液：500g/L碘克沙醇（5+0.6+0.4+0.0）、400g/L碘克沙醇（4+0.6+0.7+0.7）和200g/L碘克沙醇（2+0.6+1.1+2.3）； 2. 使用宽松配制的Dounce匀浆器在匀浆介质中对线粒体沉淀进行重悬（研杵研磨2—3次），相应地调整使得每克组织对应0.5ml体积； 3. 使用两室梯度制备仪或者Gradient MasterTM来制备线性梯度，使用注射器和金属套管针从200g/L和400g/L的碘克沙醇溶液中各取9ml，制备梯度溶液并置于适用于固定角离心转子的聚碳酸酯管中，每个梯度最底层均为2ml的500g/L碘克沙醇； 4. 在每个梯度溶液上层加入3ml混悬液，然后在105000g下离心1h； 5. 让转子从1000r/min开始持续减速，将梯度溶液收集于1ml中，密度越大的可越先得到收集。或者也可以用注射器和金属套管针来收集沿梯度溶液往下2/3距离上形成带的过氧化物酶体；
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哺乳动物原代细胞培养的β-半乳糖苷酶（荧光测定）
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
哺乳动物原代细胞培养的β-半乳糖苷酶（荧光测定） β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。 最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。 以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。 此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。 试剂和器材： 1. 反应缓冲液：100mmol/L醋酸钠，100mmol/L KCl、2%（体积分数）Triton X-100、5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），pH4.3； 2. 底物：1.7mmol/L4-甲基-伞形酮-β-D-半乳糖苷（4-MUG）或邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)，溶于反应缓冲液中； 3. 微量离心机； 4. 荧光计：透射光波长355nm，激发光波长460nm，比色皿可容纳200μl样品； 5. 流式细胞学(FACS)分析 6. 37℃水浴锅； 实验方法： 哺乳动物原代细胞培养。 原代细胞收集后。 1. 用两倍体积的缓冲液进行稀释，然后于0—4℃下在微量离心机中离心10min以获得具有梯度的沉淀物； 2. 在0.25ml的反应缓冲液中重悬沉淀； 3. 与等体积的底物进行混匀，37℃孵育1h。使用0.25ml的反应缓冲液代替底物来作为样品空白； 4. 再配有一份底物空白； 5. 1h后测定荧光； 6. 流式细胞学(FACS)分析
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叶绿素荧光参数及定义
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
叶绿素荧光参数及定义 叶绿素荧光参数是一组用于描述植物光合作用机理和光合生理状况的变量或常数值，反映了植物“内在性 ”的特点 ， 被视为是研究植物光合作用与环境关系的内在探针 。 为了统一叶绿素荧光参数名称， 在1990年召开的国际荧光研讨会上对上述的大部分参数给出了标准术语( standard nomenclature)。 现常用于分析叶绿素荧光参数的技术称叶绿素荧光动力学技术，其在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，该技术被称为研究植物光合功能的快速、无损伤探针，已逐渐在环境胁迫对植物光合作用影响研究方面得到应用。叶绿素荧光技术通常有调制和非调制两种。调制叶绿素荧光测定技术，是利用具有一定的调制频率和强度的光源诱导，通过饱和脉冲分析方法，使叶绿素荧光发射快速地处于某些特定状态，以进行相应荧光检测的技术。即其激发荧光的测量光具有一定的调制（开/关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光；打开一个持续时间很短（一般小于1 s）的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。该技术方便野外观测之用。 部分叶绿素荧光动力学参数的定义： F0：固定荧光，初始荧光(minimalfluorescence)。也称基础荧光，0水平荧光，是光系统Ⅱ(PSⅡ)反应 中心处于完全开放时的荧光产量，它与叶片叶绿素浓度有关。 Fm：最大荧光产量(maximalfluorescence)，是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量。可反映经 过PSⅡ的电子传递情况。通常叶片经暗适应20 min后测得。 F：任意时间实际荧光产量(actualfluorescence intensity at any time)。 Fa：稳态荧光产量(fluorescence instable state)。 Fm/F0：反映经过PSⅡ的电子传递情况。 Fv=Fm-F0：为可变荧光(variablefluorescence)，反映了QA的还原情况。 Fv/Fm：是PSⅡ最大光化学
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