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HE 染色和免疫组化染色是否可同时进行
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
免疫组化是利用抗原与抗体间的特异结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内的特定抗原、抗体进行定位、定性、定量的一门技术。在DAB染色后进行HE染色。既能看到免疫组化的结果，又能看到细胞的形态，CD34+免疫组化染色后是棕色的颗粒，效果很好。 1. 做免疫组化的片子**不要同时做HE染色，因为那样会掩盖阳性着色的结果；而且用苏木素复染细胞核也是淡染，若要在免疫组化的片子上观察形态学的改变，除非有非常典型的表现，一般是有很大的难度的。 2. 培养的细胞做免疫组化：每个样本只有一张片子吧？唯一的办法是进行免疫双染，同时做CD34和AFP（甲胎蛋白）。我觉得后者阳性便可以或多或少的获得向肝细胞分化的证据。 3. 用HE染色来识别造血干细胞向肝细胞分化，需要看到肝细胞的典型形态学改变后才可以下结论。早期的肝细胞仅凭形细胞态学观察并不能很容易的被识别。病理大夫看组织切片，重要的是看其组织学结构，对肝细胞也是这样。如果单拿出来一个细胞，还是培养的细胞，染色后真的不容易区分。 4. 如果是切片，也就是说每个样本可以有多张切片，可以在连续切片上分别染CD34和AFP，拍照时选择相同视野，也有一定说服力。但是还是不如双染法更可靠。 5. 这两者都表达在胞浆中，染色容易相互覆盖。所以在双染的方法选择上你还要再考虑一下，可不可以用免疫荧光双染。
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MTS检测检测细胞增生长的方法
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
细胞生长检测：MTS检测法4102 1．培养1653IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。 2．取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10％小牛血清）。 3．每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。 4．每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。 5．检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。
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SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸
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外周血细胞分离的方法有几种
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细胞的重要来源。其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分 离法、Ficoll分离法。 自然沉降法： 将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的 和淋巴细胞，下层主 要为红细胞。此方法简便但各层中的细胞种类多，不纯。血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和少量红细胞。下层虽以红细胞为主，但 也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。 差异沉降法： 用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细 胞分离开。其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两者易于分离开， 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。此法 分离的细胞纯度也不高。 氯化铵分离法： 0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂 解，以排除红细胞的干扰。另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。
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缓冲溶液的缓冲能力介绍
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
缓冲溶液中加入少量强酸或强碱，其溶液pH值变化不大，但若加入酸，碱的量多时，缓冲溶液就失去了它的缓冲作用。这说明它的缓冲能力是有一定限度的。 缓冲溶液的缓冲能力与组成缓冲溶液的组分浓度有关。0.1mol·L-1HAc和0.1mol· L-1NaAc组成的缓冲溶液，比0.01mol·L-1HAc和0.01mol·L-1NaAc的缓冲溶液缓冲能力大。关于这一点通过计算便可证实。但缓冲溶液组分的浓度不能太大，否则，不能忽视离子间的作用。 组成缓冲溶液的两组分的比值不为1∶1时，缓冲作用减小，缓冲能力降低，当c（盐）/c（酸）为1∶1时△pH最小，缓冲能力大。不论对于酸或碱都有较大的缓冲作用。缓冲溶液的pH值计算公式： 此时缓冲能力大。缓冲组分的比值离1∶1愈远，缓冲能力愈小，甚至不能起缓冲作用。对于任何缓冲体系，存在有效缓冲范围，这个范围大致在pKaφ（或pKbφ）两侧各一个pH单位之内。 弱酸及其盐（弱酸及其共轭碱）体系pH=pKaφ±1 弱碱及其盐（弱碱及其共轭酸）体系pOH=pKbφ±1
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红细胞裂解液配制注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
裂解液：ACK裂解液作用更柔和些 注意事项： （1） 裂解液如果放在冰箱里，一定要预热，37度即可。裂解期间试管也可水浴，但如果是夏天室温比较高则不必； （2） 裂解5min后立刻离心（从所有管都混匀后计时间）； （3） PBS离心洗涤2次； （4） 裂解液pH值很重要，**一次不要配多，时间长效果不好，一次配100mL， 避光保存。 2.离心速度：800-1000rpm，5min 3.研磨轻柔很重要 4.培养淋巴细胞的最佳培养液是RPMI 1640，因为是原代细胞，要用10%胎牛血清。还有非常重要的一点，要想让细胞增殖得好，必须加二巯基乙醇（beta-2ME） 5.细胞密度1－2X10^6/mL
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动物组织提取基因组DNA常见问题
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。 3. 提取的DNA不易溶解，不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。 4. 电泳检测时DNA成涂布状，操作不慎；污染核酸酶等。 5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复操作步骤2～8。 6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。
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动物组织提取基因组DNA的步骤
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行） 3.加等量的酚：氯仿：异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。 6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。 8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。 10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
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培养基常用的灭菌方法
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
高压蒸汽灭菌： 高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。培养基在爱制备过程中混入各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h内完成灭菌工作。灭菌时一般是在0.105MPa压力下，温度121℃时，灭菌15~30min即可。消毒时间不宜过长，也不能超过规定的压力范围，否则有机物质特别是维生素类物质就会在高温下分解，失去营养作用，也会使培养基变质、变色，甚至难以凝固。 可将蒸馏水或自来水装在三角瓶中，装水量一般不超过瓶的2/3，用牛皮纸或硫酸纸包扎封口，然后放入高压锅中灭菌后即为无菌水。 灭菌后的培养基可放到培养室中预培养3d，若无污染现象，则证明灭菌是彻底的，可以使用。暂时不用的培养基**置于10℃下保存。含IAA或GA3的培养基应在1周内用完，其他培养基最多也不要超过1个月。 过滤灭菌： 一些植物生长调节剂及有机物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇热容易分解，不能与培养基一起进行高温灭菌，而要使用细菌过滤器滤去其中的杂菌。细菌过滤器与滤膜（孔径0.45微米）使用之前要先进行高压灭菌。过滤后的溶液要立即加入培养基中，若为液体培养基，可在培养基冷却至30℃时加入；若为固体培养基，必须在培养基凝固之前（50-60℃）加入，振荡使溶液与其他成分混合均匀。
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抗体孵育时间过长或温度较高如何解决
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，**随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。 DAB变质和显色时间太长：DAB**现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色**在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
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胡萝卜素与叶黄素优缺点介绍
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
叶黄素具有独特的保健功能和良好的着色性能，可在食品行业广泛应用，在焙烤食品、饮料、冷冻食品、果冻及果酱类食品中着色，色彩鲜艳且持久。 摄入足够量的叶黄素能保护视黄斑，有效地预防视力下降。叶黄素作为抗氧化剂，能清除自由基和游离基，限制由于新陈代谢和关心所致的组织损伤，提高肌体的免疫力，预防衰老。 叶黄素作为着色剂根据不同产品建议添加量为(叶黄素晶体)。叶黄素与β-胡萝卜素的性能对比： 1. 两者都为胡萝卜素类物质，呈色都为金黄色，即色调一致； 2. β-胡萝卜素在油质产品里只能少量溶解，在100℃的植物油里只能溶解0.25%，大部分为分散性悬浮状态；叶黄素在油质产品里的溶解度比β-胡萝卜素大8倍，在100℃的植物油里能溶解2%，溶解性更好； 3. 在水分散性产品方面两者的呈色也基本一致，为乳黄到金黄色，β-胡萝卜素目前只有乳浊性水分散产品，叶黄素在浓度不要求很高的情况下可以有透明澄清产品； 4. 两者作为营养强化剂，β-胡萝卜素只是作为维生素A源，在体内转化为维生素A被人体吸收，叶黄素除作为营养强化剂外，还有保健作用，其保护视网膜、清除自由基和游离基的作用更被人们关注。 5. 稳定性方面，两者耐热性均很好，在不同PH下呈色均稳定，在抗光性方面，β-胡萝卜素就不如叶黄素，叶黄素具有更好的光稳定性。 6. 价格方面，由于β-胡萝卜素自然资源含量低，生产工艺复杂，生产成本较高；叶黄素由于自然资源丰富，含量高，生产工艺相对较简单，生产成本也就较低，故，叶黄素相对于β-胡萝卜素，存在价格优势，用叶黄素作为着色剂可适当降低生产成本，提高产品在市场的竞争力。
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卡波姆934、940、941区别
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
卡波姆不懂型号主要是粘稠度的不同，卡波姆其商品名为卡波普（carbopol)，按粘度分为934、940、941等。 1、Carbopol940：短流变性、高粘度、高清澈度，低耐离子性及耐剪切性，适用于凝胶及膏霜中。 2、Carbopol941：长流变性、低粘度、高清澈度，中等耐离子性及耐剪切，适用于凝胶及乳液。 3、Carbopol934：交联聚丙烯酸树脂，局部给药系统，在高粘度时稳定，用于浓凝胶剂、乳剂、混悬剂。 卡波姆是以季戊四醇等与丙烯酸交联得到的丙烯酸交联树脂，是一类非常重要的流变调节剂，中和后的卡波是优秀的凝胶基质，有增稠、悬浮等重要用途，工艺简单，稳定性好，广泛应用于乳液、膏霜、凝胶中。
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常用检测器有哪几种
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。 PDA检测器：即紫外检测器，点时间可检测单一点处吸收值。 DAD检测器：二极管阵列检测器，可理解为无数个PDA检测器串联。即点时间可检测某一波段吸收值，比PDA检测器定性能力强大。 荧光检测器：对某些吸收紫外光后可发射荧光的物质进行检测，灵敏度较高。 蒸发光散射检测器：可以检测没有紫外吸收的有机物质（不可用于梯度洗脱） 示差折光检测器：根据折射率的变化对样品浓度检测（不可用于梯度洗脱），万能检测器，但是定性能力和PDA一样差。
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紫外可见吸收检测器的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
紫外可见吸收检测器(UVD)是HPLC中应用最广泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有流动地的紫外可见光度计。 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽(190nm～800nm)。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。 局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。
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乙二胺四乙酸二钠盐的合成方法
作者：德尔塔 日期：2022-02-18
按一定的配比将氰化钠与甲醛的混合物缓缓加入乙二胺水溶液中，在85℃、减压下通入空气以除去氨气。反应完毕后，用浓硫酸调Ph值至4. 5，再经脱色、过滤、浓缩、结晶分离、干燥得成品。 氯乙酸法：先将100kg氯乙酸、100kg冰和135kg 30%的NaOH溶液混合，在搅拌下加入18kg 83%～84%的乙二胺，在15℃下保温1h。分批缓慢加入30%的NaOH溶液至反应物显碱性为止，并在室温下保持12h。加热至90℃，加活性炭脱色。滤液用盐酸调Ph值到4.5，并在90℃下浓缩、过滤；滤液冷却后结晶、分离、洗涤，在70℃下干燥得成品。 用乙二胺四乙酸与氢氧化钠溶液作用制得：在装有搅拌器的2L反应烧瓶中，加入292g乙二胺四乙酸，1.2L水。在搅拌下加入200mL 30%氢氧化钠溶液，加热至全部反应完。加20%的盐酸中和至pH=4.5，加热至90℃浓缩，过滤。滤液冷却后析出结晶。抽滤分出，用蒸馏水洗涤，在70℃烘干，得产品二水乙二胺四乙酸二钠盐。 在搪瓷反应罐中加入乙二胺四乙酸、水，在搅拌下加入氢氧化钠溶液，加热至全部反应，加盐酸至PH为4.5，加热至90℃浓缩，过滤，滤液冷却，滤出结晶，水洗，70℃烘干，得乙二胺四乙酸二钠。 将氯乙酸钠与乙二胺缩合，经酸化得乙二胺四乙酸，再用氢氧化钠中和即得。把所得粗品溶于10倍水中，加入等体积乙醇以析出二钠盐，然后过滤，洗涤。
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