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知识分享：mRNA的分离和纯化
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理 从细胞或组织中得到RNA是一种混合物，其中包括tRNA，rRNA和mRNA，其中RNA为75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表达丰度也不一样。每克细胞可分离出5-10mg RNA。 真核生物mRNA具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴。绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20-300个腺苷酸组成的poly（A）尾，这种结构为真核mRNA分子的分离和纯化，提供了极为方便的条件，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的实验理论就在于此。 一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’端含有poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过oligo(dT)纤维素柱吸附和解吸附，即可得到较纯的mRNA。 实验材料 1、0.1mol/L NaOH （用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置） 2、寡聚Oligo（dT）-纤维素 3、加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置） 4、洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置） 5、5 mol/L NaCl（加0.1% DEPC处理过夜） 6、3 mol/L NaAc pH5.2（加0.1% DEPC处理过夜） 7、无RNase双蒸水(DEPC水) 8、70%乙醇（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置） 需要用到的实验仪器：恒温水浴箱，高速冷冻离心机，紫外分光光度计，巴斯德吸管，玻璃棉，5ml一次性注射器。 实验过程 （一） oligo(dT)纤维素的预处理 1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。 2、将悬浮液装入填有经DEPC水处理，高压灭菌后的玻
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知识分享：PLM-Puromycin试剂说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
一、产品概述： 产品名称: PLM-Puromycin 试剂 产品货号：FH880802 规格：100μl（标准规格） 浓度：1ug/ul 推荐使用浓度：1-10 μg/ml 有效期至： 二、产品原理： PLM-Puromycin试剂是一种由链霉菌中获取的氨基糖苷类抗生素，具有与tRNA分子3’末端类似的结构，可以和核糖体的A位点结合，从而抑制蛋白质合成对革兰氏阳性菌产生抑制作用。可用作筛选含该抗生素的基因质粒，细胞株构建，也可当做抗菌类抗生素使用。 三、储 存： 保存条件： -20℃或4℃避光保存，尽量避免反复冻融。 运输条件：4℃以下低温运输 四、使用说明： 以验证目的质粒是否具有Puromycin 抗性为例说明本试剂的应用： 1. 转染前一天铺HEK293细胞，培养基为含10% FBS 的DMEM培养基，以6 well plate为例，细胞数目约为0.5x106 cells。 2. 在无菌管中加入目的DNA质粒（1-2 ug）及无血清的DMEM或者Opti-MEM。 3.在无菌管中加入无血清的DMEM或者Opti-MEM及本公司VGF转染试剂4 -10 ug。 4.将2和3步中的溶液混合，室温放置20-30min。 5.将4步所得混合液逐滴加入至6 well plate中。 6.转染48h后，吸弃完全培养基，加入终浓度为1-10 ug/mlPLM-Puromycin试剂的完全培养基2ml。 7．再培养48h后，观察细胞状态，不含嘌呤霉素的细胞会飘起死亡，转入含嘌呤霉素抗性质粒的细胞则贴壁生长。再次吸弃完全培养基，加入终浓度为1-10 ug/mlPLM-Puromycin试剂的完全培养基2ml，继续杀死无嘌呤霉素抗性的细胞。 8.再培养48h，若细胞仍然贴壁生长且几乎长满，结果说明我们的目的质粒含有嘌呤霉素抗性基因，否则目的质粒不含嘌呤霉素抗性基因。 注意事项：筛选细胞时，细胞接种密度不能过大，以免影响筛选效率。当细胞密度比较大时，可加本试剂反复筛选，直至对照细胞完全死亡。建议的一般哺乳动物细胞选用的有效浓度范围为1-10 μg/ml,使用前要做浓度筛选，选择最佳
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如何选择合适的单、多克隆抗体及抗原
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆，产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。 一、单多抗优缺点 类型 优点 缺点 多克隆抗体 1.多克隆抗体有助于放大低表达水平的靶蛋白信号； 2.能识别多个表位； 3.比单克隆抗体更能容许抗原中的微小变化； 4.识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质，或者从非免疫原物种的组织样品中筛选靶蛋白； 5.多克隆抗体通常是检测变性蛋白质的**； 6.多表位通常可提供更为有力的检测。 1.易于产生批次间差异； 2.产生大量非特异性抗体，有时可能在某些应用中产生背景信号； 3.不适用于探测抗原的特定结构域，因为抗血清通常可识别多个结构域。 单克隆抗体 1.杂交瘤制得后，就成为了恒定的再生源，所有批次都将相同； 2.切片和细胞染色造成的背景较低。 3.具有特异性，适于分析测定中的一抗或检测组织中的抗原，并且通常所产生的背景染色显著低。 4.同质性非常高； 5.单克隆抗体的特异性能使其在混合物中和抗原高效地结合。 1.可产生大量特异性抗体，但可能特异性过强； 2.经过抗原的化学处理后比多克隆抗体更易于丢失表位。这可通过使用同一抗原的两个或多个单克隆抗体进行补偿。 二、单抗和多抗的选择 如果对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多（WB/IP/IF/ICC等)，可以选择制备单克隆抗体。 多克隆抗体的特异性较差，即使是使用相同的抗原制备
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引物修饰的常见类型及应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
脱氧次黄嘌呤（deoxyInosine，dI）： 脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基， 虽然不是真正意义上的通用碱基但当与其它碱基结合时会比其它碱基错配相对更稳定。 脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤**与dC结合。 脱氧脲嘧啶 （DeoxyUridine，dU）： 脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。 每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7 ℃。 硫代（Phosphorothioate，S-oligos）： S-oligos是寡核苷酸中单核苷酸间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的，碱基被添加上后，再进行连接修饰。两个碱基之间的磷酸可以转换成双键"S"(用硫代试剂）代替普通的双键"O"（用碘溶液）。 硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。 您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会降低，为了降低这种这种影响， 可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。 磷酸化（Phosphorylation）： 5'磷酸化是通过B-氰乙基化学反应添加到引物5'端的糖环上，而不是最后一个碱基上。可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应；在可抗外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。 内部氨基修饰： 主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接（如碱性磷酸酶）。 5'氨基修饰： 5'Aminolinker(C6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过B-氰乙基化学反应添加到引物5'糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。5' C6氨基修饰可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重标记诊断系统，目前主要用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物。 3'氨基修饰： 目前提供3
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DNA测序基本原理及流程
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
1977年，Sanger等人发展建立起来的一种DNA测序方法。 基本原理： 1.双脱氧链末端终止法 双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，将延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四组，每组按一定比例加入一种 (ddNTP)，它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。 双脱氧链末端终止法测序基本原理示意 双脱氧链末端终止法特点 双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的优点，而且更适用于大规模的测序。但它要求有一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特异性的引物。因此，早期的工作仅局限于单链噬菌体为模板，若干个不同的特定限制性内切酶酶解片段为引物，在模板链的不同部位引导合成，从而确定出噬菌体DNA的核酸序列。然而，对于大量存在着的天然双链DNA分子，因没有良好的制备产量和质量高的分离链的技术，而限制了双脱氧链末端终止法的应用程度。 经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进 标记物方面的改进： 由于放射性同位素对人体的危害，许多实验室开始利用非放射性物质来取代放射性同位素。如生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物 。在双脱氧法测序时，它们作为标记物，示踪测序反应的产物，最后通过酶显色反应或者荧光信号显示出测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素方法检测容易、安全、快速、费用也低。 经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进 电泳方法的改进: 电泳方法的改进主要采用毛细管电泳法。 毛细管电泳是被分离物质在毛细管中的电泳。1992年，Matnies等首先提出陈列毛细管电泳法，采用激光聚焦荧光扫描检测装置。25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5小时内可读出350bp。DNA序列分析效率可达6000bp/h 。 2.测序过
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静电对于食品安全检测仪所产生的危害如何防护？
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验室仪器中控制静电不只是为了安全，也可改善商品检测质量，例如在研磨运行中，静电电荷可影响制品优秀质量，或许在有的纺织厂运行中，静电电荷可构成纤维竖直而不平卧，结果产生次品。尽人皆知，用溜槽或管道运送物料会产生静电荷，使其材料粘附在溜槽或管道的内壁上，这样会构成堵塞。 1、最小发火能量 静电的放电导致的火灾或爆破危害，是可燃性混合气中产生的放电能变换为热能，使可燃气体温度上升，超越发火温度的结果。使温度上升到该发火温度的最小能量称为最小发火能量，以该值作为产生爆破、火灾的一个目标值。 2、如何避免静电对于食品安全检测仪的危害对策静电危害是由于具有了电荷的产生、电荷的积储、放电景象、可燃性物质存在这四个条件而产生的。因而，假如消除这些条件的一个就能够避免危害的产生。主要的是应当精确地判别阻止这四个段中的哪一个，并采纳恰当的对策。作为避免静电危害的根本办法，拟从避免、按捺带静电的观点动身介绍其具体办法。 遏制静电的产生：由于静电的产生源是物体之间的摩擦或分离作用等，因而要尽可能遏制这些作用。例如，在液体管路运送、粉尘物空气运送或许塑料的揉捏等工作中，最佳的办法是下降速度。实际上这么会影响工作效率。石油类的安全流速在1m/s以下。静电由于物质的不同而带电量或极性不同。因而可行的办法是避免运用简略带电的绝缘物，而运用经过组合难易产生静电的材料。 促进产生电荷的释放：在危害对策中，最简略的办法是进行接地。该办法是经过金属导体使产生电荷敏捷消失到大地中。可是，选用这种办法，假如带电体是导体能够简略地消除，而塑料或化纤类、石油类等绝缘物，由于带电有些的电荷难以移动，作用不大。 另外，还可在食品安全快速检测仪中附带导电性物质而使电荷得以释放。这其间包含在轮胎或操作人员的靴子以及化工厂的地板材料中参加金属粉末或碳黑，在化纤类或塑料类中运用亲水性油剂，以避免带电。假如进步空气中的相对湿度，则会在物体
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知识分享：SDS-PAGE的配制及电泳
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapir0建立，其原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只是分子量的函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)。由于SDS-PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么 SDS-PAGE后，就只出现一条蛋白质区带。SDS-PAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径等所组成。 实验材料 (一)试剂 1、30%丙烯酰胺混合液(Acr:Bis 为 29:1) 称取丙烯酰胺(Acr ) 29g 及甲叉丙烯酰胺(Bis ) 1.0g ,用 去离子水溶解并稀释至 100ml ,贮棕色瓶中于 4℃保存,可用一个月。 2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 取 1mol/L HCL溶液 48ml 、三羟甲基甲烷(Tris ) 36.6g ,加双蒸馏水 至 80ml 使其溶解,调 pH 至 8.8,然后用双蒸馏水稀释至 100ml ,置棕色瓶中, 4℃贮存。 3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 取 1mol/L HCL溶液 48
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知识分享：Tet-on表达调控系统
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
1992年Goseen等人成功的利用原核基因调控元件构建了四环素（tetracycline,Tet）真核细胞基因调控表达系统。目前，此系统已被广泛应用于基因功能和基因**领域的研究。 1、四环素调控表达系统的基本原理 Tet调控表达系统通过诱导药物（如Tet）改变调控蛋白的构象，从而达到调控目标蛋白表达的目的。 最初的Tet调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet阻遏蛋白（Tet repressor protein, TetR）与Tet操纵子（Tet operator, TetO）能够特异性结合。当细胞内无Tet存在时，Tet会与TetO结合，从而阻断下游抗性基因表达；当有Tet存在时，Tet使TetR构象发生改变，导致TetR与TetO分离，使下游抗性基因得以表达，细菌从而获得耐药性 2、Tet-on调控系统 利用TetR和TetO特异性结合的特点，多种类型的Tet调控系统逐渐发展起来。根据应用最为广泛的是Tet-on激活型系统。 Tet-on系统由调节表达载体和反应表达载体组成。 调节表达载体包含一个人巨细胞病毒早期启动子（PhCMV）和反义Tet转录活化因子（reverse tetracycline transcriptional activator，rtTA）。其中rtTA由反义TetR（reverse TetR, rTetR）和单纯疱疹病毒（HSV）VP16蛋白C端的一段转录激活区域融合而成。 反应表达载体由Tet应答元件（Tet-responsive element, TRE）、最小CMV启动子（minimal CMV promoter, PminCMV）及目的基因组成。其中TRE是7个重复的TetO序列。 由于PminCMV缺少增强子，因此rtTA未与TRE结合时，目的基因不表达；当rtTA与TRE结合时，VP16会使PminCMV活化从而使基因表达。 在Dox不存在时，rTetR不能与TRE结合，导致基因表达被抑制；而当Dox存在时，rTetR能与TRE结合，进而使得目的基因表达。 3、Tet-on调控系统的优势 Tet-on调控系统集高效率、精准、安全、可逆性四大特点。 维真可为您提供腺病毒、慢病毒、腺相关病毒和四环素调控表达载体，还提供病毒包装服务。
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知识分享：WesternBlot实验方法及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理： WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。 实验材料： 分离胶及积层胶溶液 、水饱和异丁醇 、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物 、1×SDS电泳缓冲液 、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件 、0.75mm封边垫片 、0.75mm样品梳子 、50μl微量加样器 、恒流电源 常用试剂： 1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺 将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。 小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8, 在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8,补加H2O至体积500ml。用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。 3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8, 在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8,补加H2O至体积100ml。用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。 4）4×SDS电泳缓冲液 Tris base 24.2 g 、Glycerin 115.3 g 、20%SDS 20 ml 加水至总体积1000ml。 应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%)。 5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) TEMED通
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知识分享：蛋白质含量的测定方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理： 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法、双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH-NH2+3H2SO4=2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4(2) (NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明
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【客户成果】外泌体circRNA PDE8A促进胰腺导管癌细胞侵袭
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
第三军医大学西南医院李晓武教授团队长期从事肝胆外科研究，近期，其实验室对利用Arraystar circRNA芯片研究发现了在胰腺导管癌细胞中高表达的circ-PDE8A可以通过miR-338调控MACC/MET/ERK通路，促进癌细胞侵袭。进一步研究发现，病人血浆外泌体中circ-PDE8A显著高表达，影响细胞侵袭，可作为潜在的预后不良指示生物标志物。该研究成果2018年发表在期刊CANCER LETTERS（IF: 6.375）（芯片实验由康成生物提供技术服务） 研究背景 胰腺导管腺癌(PDAC)是目前临床上预后最差的恶性肿瘤之一，由于侵袭性强、复发率高出于癌症相关死亡原因第6位。MET 为酪氨酸跨膜受体，是上皮细胞癌中的一个经典的原癌基因，激活后影响细胞迁移、入侵、血管生成、细胞分散、EMT和其他生物学过程。circRNA是一种内源性的非编码RNA，首尾相接形成共价环状结构。已报道circRNA在多种癌症中发挥调节作用，大部分是作为miRNA的吸附海绵来发挥功能。在PDAC中circRNA的作用机制还没有详细的报道。 外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30~150nm的膜性囊泡。外泌体中包含多种蛋白、RNA 、以及部分DNA分子，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。近期有多篇文章报道外泌体中的miRNA、lncRNA在癌细胞侵袭或代谢过程中发挥作用，PDAC外泌体中的circRNA的作用值得探究。 研究思路 为了探究外泌体中circRNA的作用，作者选取PDAC细胞系Hs 766T与高侵袭性的Hs 766T-LS提取外泌体总RNA，通过Arraystar human circRNA Array进行高通量筛选，对Hs 766T-LS细胞中显著上调的9个指标进行qPCR验证，circ_PDE8A （hsa_circ_0036627）趋势相符且在PDAC细胞系中过表达敲减显著影响细胞侵袭。扩大样本验证，在胰腺导管癌和癌旁样本中circ_PDE8A表达差异显著（P=0.014），可以作为预后不良的biomarker。 MET是影响癌细胞侵袭
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知识分享：动物细胞基因组DNA提取
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理 真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，制备DNA将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，同时保持DNA分子的完整。提取DNA的过程是指将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。 在提取DNA的反应体系中，SDS用于细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使起与DNA分子分离开来。 实验材料 （1）细胞裂解缓冲液： Tris (pH8.0) 100 mmol/L ；EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L； NaCL 20 mmol/L； SDS 10% ；胰RNA酶 20ug/ml。 （2）蛋白酶K： 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，用一次性过滤器过滤除菌，-20℃备用。 （3）TE缓冲液（pH 8.0），高压灭菌后室温贮存。 （4）酚：氯仿：异戊醇=25:24:1（体积比）。 （5）NaAc 3 mol／L。 （6）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。 实验过程 1、取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。放入匀浆器中，加入2ml细胞裂解缓冲液，然后充分研磨，至不见明显组织块，然后转入1.5ml 离心管中，以12000 rpm离心5min。 2、弃掉上清，加入0.4ml细胞裂解缓冲液，迅速吹散沉淀。加入20ul蛋白酶K（0.2mg/ml），混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，或转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 3、加入等体积酚：氯仿：异戊醇抽提一次，温柔混匀。4℃条件下，10000rpm，离心10min。 4、轻轻吸取上层液面，注意不要吸到两层之间的白色沉淀。如上层液面中白色沉淀较多或浑浊可以再次加入等体积酚：氯仿：异戊醇抽提一次。 5、向吸取的上清液中加入1/10体积的NaAc，轻柔混匀，然后加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，轻柔
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知识分享：基因定点突变
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理 基因定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法改变目的基因的序列，包括碱基的插入、缺失、点突变等。基因定点突变是基因研究中比较常用的方法，可以短时间内研究目的DNA所表达的目的蛋白的性状及表征。 定点突变需要设计特定的突变引物。引物长度一般为25-45 bp，建议选择30-35bp长度的引物p。引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求引物两边都能与模板搭上，所以引物的两边各设至少12个bp。以要突变的位点碱基为中心，加上两边11-12 bp的序列。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败。同时需要设计一条反向互补的引物。为保证PCR反应正常进行，引物设计完成后需计算Tm值，若Tm值不合适，可以适量调整引物长度。 实验材料 PCR引物，质粒或者基因组模板，PCR Buffer，PCR用高保真酶，ddH2O。 实验过程 1、PCR扩增 30 μL PCR（phusion）体系如下： 成分 体积（ul） 水 18.2 Buffer 6 DMSO 0.9 dNTP 0.6 酶 0.3 引物F+R 1.5+1.501 DNA模板 2、胶回收 第一轮PCR产物需要进行胶回收后再进行二轮PCR。 将第一轮PCR得到的条带进行切胶回收后，作为模板进行二轮PCR，二轮PCR的引物已第一轮PCR所用的两端引物。二轮PCR反应结束后需要进行纯化回收，为下一步的酶切做准备。 3、酶切 通过酶切回收目的基因片段、载体时，避开基因中的酶切位点，选择合适限制性内切酶。当酶切回收目的基因时要注意目的基因装在PENTER载体的位置。用限制性内切酶处理目的载体时，要将载体片段的量控制在2μg以内，并在酶切反应后进行去磷酸化处理。 30μL酶切体系 成分 体积（ul） 载体DNA
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知识分享：教你辨析标记基因和报告基因
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
一、标记基因和报告基因的概念 标记基因(marker gene)，是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。标记基因是选择标记基因的简称，是指其编码产物能够使转化的细胞、组织具有对抗生素等的抗性，或者使转化细胞、组织具有代谢的优越性。在培养基中加入抗生素等选择试剂的条件下，非转化的细胞死亡或生长受到抑制，而转化的细胞能够继续存活，从而将转化的细胞、组织从大量的细胞或组织中筛选出来的一类基因。在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否；在基因定位意义上来说，它是对目的基因进行标志的工具，通常用来检测目的基因在细胞中的定位。 报告基因(reporter gene)，是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因，主要用于判断目的基因是否成功导入到受体细胞，并在其中表达。故当报告基因被用来区分转化和非转化细胞、组织、器官时，也可将其称为标记基因。报告基因不仅能作为标记基因，此外，报告基因还能用于研究基因的表达调控，检测启动子的活性，发现新的启动子，观察报告基因和目的基因的融合蛋白在细胞内的位置等。 二、标记基因和报告基因的区别与联系 二者的联系在于：报告基因都可以看做是标记基因。报告基因也有标记的作用，标记目的基因是否成功转化的作用，但是它们又有着各自的特点。 标记基因通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。 而作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：1）已被克隆和全序列已测定；2）表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；3）表达产物唯一，对受体细胞无毒，并且能进行定量测定。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移
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解析肿瘤Hi-C多组学研究策略，IF≥10+文章不是梦！
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
Hi-C (High-through chromosome conformation capture) 是以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息分析方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系，获得高分辨率的染色质调控元件相互作用图谱。Hi-C可以与RNA-Seq、ChIP-Seq、ATAC-Seq等数据进行联合分析，从基因调控网络和表观遗传网络来阐述生物体性状形成的相关机制。 今天，小编以一篇经典文献带您了解Hi-C技术在疾病发生机制中的应用。 题目：Chromatin interaction analysis reveals changes in small chromosome and telomere clustering between epithelial and breast cancer cells 期刊：Genome Biology 影响因子：11.908 研究目的：采用HI-C技术探究乳腺癌细胞三维空间结构改变及其致病机制 实验分组：人乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系MCF-7 测序策略：Hi-C：HiSeq 2000 PE100；RNA-seq：HiSeq 2000 SE100 研究思路： 研究背景 三维基因组对于通过将远距离启动子、增强子和其他顺式调控区域集中在一起，来调控基因表达是非常重要的。癌症的发展导致异常基因表达的几种遗传和表观遗传改变。 此外，癌症是一种疾病，其细胞核中的主要形态学发生变化，用作诊断标记。尽管癌症的形态学特征具有很好的特征，但异常核形态的分子结构仍然不甚了解。 核内染色质的高级折叠涉及跨越不同尺度的分层结构。显微成像显示染色体位于被称为染色体区域的限定区域内。在细胞核中，每条染色体都有一个优先但不固定的位置，其中基因密集的染色体往往位于核内部。越来越多的证据强调了乳腺癌启动过程中染色体和基因定位的重要性。此外，最近的数据表明核的物理空间接近度对复发性易位的影响。 几项研究表明，基因组划分为两个区域，称为A/B compartments，它们在基因组中一般呈间隔分布。研究发现A compartment通常与表达活跃的open chromatin相关，而B compartment与转录抑制的closed chromatin相关。 TAD（topol
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