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Synaptic Systems 高质量抗体验证方案
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
随着现在生物技术的发展，抗体已经成为了强大的诊断和研究工具，其应用范围也日益扩大。抗体可以用于包括WB(蛋白质印迹)、ICC(免疫细胞化学)、IHC(免疫组织化学)、IP(免疫沉淀)、ELISA(酶联免疫吸附)等多种实验中来检测、分离或可视化相应的抗原。大多数情况下，抗原是一种蛋白质，但也可以是化学修饰或任意小分子的化合物。 长期以来，抗体一直备受生物科研工作者的青睐，无数科研人员每天都需要使用抗体来识别和分离各种应用的蛋白质。然而，近年来，抗体的使用出现“再现性危机”和“抗体危机”的问题，其主要因素在于抗体的交叉反应性和变异性。 一般而言，抗体的质量主要取决于两个方面特性：亲和力和特异性。 亲和力主要表现在测量表位和抗体的抗原结合位点之间相互作用的强度。抗体的亲和力越高，基于抗体测定的灵敏度就越高；特异性则是衡量抗体区分不同抗原的程度。这意味着即使是 抗体也有检测限，或者在J端情况下可能会显示假阳性结果。例如，如果一个高特异性和高灵敏度的抗体的目标抗原在要分析的样品中含量很低，那么通常会增加样品量，并以更高的浓度使用该抗体来放大信号。如果样品中存在另一个被该抗体结合得很弱的目标，那么这个非目标和抗体本身的不利的高浓度就会导致非特异性结合和假阳性结果。 不同的实验方法需要不同的抗体特性，因为抗原以不同的方式呈现。在变性SDS-PAGE 后，抗原可能是蛋白质印迹检测中呈线性的氨基酸序列，或者在细胞免疫分离、免疫沉淀或基于 ELISA 的方法中整体是天然结构。在免疫染色中，必须检测固定细胞或组织中的交联、化学修饰结构。这意味着一种抗体可能在一种应用中表现出优异的性能，但在另一种应用中却完全不适用。这也意味着一种检测的特异性并不能保证在不同应用中的特异性。必须对所有应用程序独立进行验证。 抗体验证八种方法 1. 省略一抗 这是测试由二级试剂引起的潜在背景的有用且重要的控制。然而，这个实验没有提供关于一抗质量的信
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血小板裂解物的制备方法有哪几种？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
血小板中含有很多不同的细胞生长因子，包括PDGF, VEGF，EGF等，存在血小板颗粒中的大量生长因子和细胞因子可以通过凝血酶激活和凝固自然释放，也可以通过冷冻/解冻介导的血小板溶解、超声或化学**人工释放。以不同的释放策略制备的人血小板裂解物被视为可以替代胎牛血清（FBS）作为培养基补充剂的合适选择，使人类细胞在无动物血清条件下高效增殖，在体细胞**和组织工程中具有广泛的应用前景。 血小板裂解物的制备方法有哪几种？ 诱导血小板释放生长因子和其他生物活性分子的四大方法： （1）多次冷冻/解冻循环（反复冻融法）： 多次冷冻/解冻循环是常见的简单有效和经济的方式诱导血小板激活释放因子。典型的情况是，浓缩的血小板在-80℃时被休克冷冻，37℃时解冻，从而使血小板激活和碎裂。 （2）直接激活法: 这种方法是加入钙盐溶液(通常是CaCl2)，以激活内源性凝血酶，从而纤维蛋白形成和血小板脱颗粒。也有人或重组凝血酶的直接激活，但重组凝血酶的使用可能会使HPL用于细胞**的监管和批准复杂化。 （3）声波降解法: 多年来，超声单独或与冷冻/解冻循环相结合也被用作一种快速、高效和经济高效的释放血小板的方法。在20kHz频率下超声作用30分钟可有效释放血小板颗粒含量。 （4）溶剂/洗涤剂 (S/D)处理: 从制备工艺上来说，S/D处理法略微复杂。用1%磷酸三丁酯(TNBP)和1%的TritonX-100在30℃下处理新鲜冷冻血浆（FFP）4小时，制备S/D-FFP。添加的试剂用大豆油萃取和不溶性C18树脂层析除去。用S/D-FFP免疫家兔，然后用未经处理的FFP吸附诱导的抗体，证实没有新的免疫原的形成。这种方法还有一个好处就是可以灭活被脂质包裹的病毒。
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培养RAW264.7细胞常见问题及原因分析
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在日常培养过程中发现RAW264.7细胞容易出现的问题主要为以下几种： 1.复苏不易成功2.细胞形态变异明显3.消化困难4.细胞生长缓慢，当你的细胞培养遇到上述瓶颈，不妨试一试以下几种解决办法。 1、复苏难以成功 原因：RAW264.7对空间十分敏感，复苏密度太高，细胞增殖太快，加剧细胞营养缺失，加速细胞老化。 解决办法：T75培养瓶复苏细胞数量控制在104~105 2、细胞变异明显 原因：细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促使该细胞呈现梭形、长梭形 解决办法：改善细胞培养环境，例如与细胞接触的玻璃器皿均高温灭菌，换flask培养瓶，采用一次性器具，使用质量较高的胎牛血清 3、消化困难 原因：细胞老化后，细胞伪足多且长，使细胞难消化，使用胰酶或细胞刮会对细胞损伤较大 解决办法：无需胰酶使用吸管重复吹打，可消化大部分正常状态的细胞；但若细胞为“长脚”状态，即使加入胰酶消化超过10min，也难以消化下来，勉强消化，对后续的实验数据也有较大影响。 4、生长缓慢 原因：支原体污染会导致细胞生长缓慢，甚至难以贴壁 解决办法：定期进行支原体检测，如发现支原体污染，即刻使用支原体去除试剂
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临床M2巨噬细胞相关基因辅助**胰腺导管腺癌
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
胰腺导管腺癌(PDAC)是全球七大癌症相关死亡原因，也是最常见的人类恶性肿瘤之一。根据2018年全球癌症统计，大约有45.9万名新确诊患者和近43.2万人死亡患者。由于早期准确诊断和肿瘤快速进展等困难，大量PDAC（胰腺导管腺癌）病例在诊断时出现临床晚期或远处转移。因此，开发新的、可靠的预后评估和疗效预测指标以进一步推进针对性**具有十分重要的意义。 越来越多的证据支持浸润M2巨噬细胞在胰腺导管腺癌(PDAC)的肿瘤进展中起关键作用。然而，对M2巨噬细胞浸润和中枢基因(FAM53B)在临床结局和免疫**中的生物学作用缺乏全面的分析。近期有一个研究团队针对M2巨噬细胞相关基因表达进行研究，以期望能探索出评估PDAC预后及疗效的新指标。 研究人员合并了两个PDAC样本数据集，GSE16515和TCGA-PAAD，以研究M2巨噬细胞分析的潜在作用。使用CIBERSORT算法获得M2巨噬细胞图谱，然后通过WGCNA发现与M2巨噬细胞相关较为显著的模块。然后，利用多cox回归模型进一步确定模块中的候选基因，最终确定5个关键基因。然后，建立了多基因风险模型和综合预后图。在后续分析和外部试验组(ICGC-PACA-CA)中验证其预后价值。随后，研究潜在的信号通路和**预测的风险评分。最后，进一步探讨FAM53B在预后预测、免疫浸润和免疫**中的生物学功能，为PDAC的临床**策略提供可靠的见解。 22个候选基因的LASSO系数谱 为了进一步研究候选基因的预后价值，研究人员从TCGA-PAAD项目中提取了表达数据和随访信息。在单因素Cox分析的帮助下，鉴定了22个M2巨噬细胞相关基因，具有显著的预后价值。并对这些hub基因进行了Lasso回归，识别出PDAC中与预后相关的9个M2巨噬细胞相关基因。进行多因素COX回归分析，确定5个M2巨噬细胞相关基因(FAM53B、SPINK2、ABCB4、GH1、INTU)为中心基因，所有这些基因均被认为是有益的预后指标(所有HRs
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学会这6步，轻松搞定transwell实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
做肿瘤研究的人，很少有不知道 transwell 实验的，它是用来研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。今天咱们就来讲讲怎么做肿瘤细胞的侵袭转移实验。 Transwell 侵袭实验，其实原理简单地说，就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。 我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞就要分泌金属蛋白酶将基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。 Transwell 简易图 以下就来为大家介绍侵袭实验步骤： 实验前准备：transwell 小室（一般选用 12um），24 孔板，基质胶（corning），细胞实验所需的基本的材料。 1 基质胶铺板 用 Matrigel 1：8 稀释（可以直接用无血清的培养基稀释），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝胶（时间不宜太长，之前有人说在 37 度孵箱过夜，反正元元师兄觉得不太可能）。 注意事项： 1. 铺胶之前将枪头以及所用的耗材至于冰箱 4 度当中，否则配胶的时候会直接凝固。 2. 铺胶的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。 3. 注意铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。 4. 注意无菌操作。 2 制作细胞悬液 1. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 2. 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 PBS 洗 1－2 遍，这一步很必要，否则细胞表面覆有血清培养基，细胞没有迁移侵袭的动力），用无血清培养基重悬。 3 接种细胞 1. 细胞悬液 200µl 加入 Transwell 小室（肿瘤细胞数目需要
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进行 ELISA 前制备样品的提示
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
样品制备方法 细胞培养物上清液 将培养基移至离心管， 4℃， 1,500 rpm 离心 10 分钟。 立即进行上清液的分装（血清）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数 细胞提取物 将组织培养板放置在冰上 吸出培养基并用预冷PBS 轻轻洗涤细胞一次 吸出 PBS ，加入100 mm 培养板加入0.5ml完全提取缓冲液 收集细胞至在倾斜板中，然后移至经过预冷的离心管中。 短暂涡旋后在冰上孵育 15-30 分钟 在 4℃ 下13,000 x rpm 离心 10 分钟，沉淀不溶性内容物 将上清液（这里是指可溶性细胞提取物）分装至预冷的离心管中，并于 -80℃ 保存。尽可能减少反复冻融次数。 条件培养基 将细胞接种到完全（含血清）生长培养基中，使细胞增殖达到一定的融合率。 弃去培养基，数毫升预热PBS 小心洗涤。重复洗涤步骤。 弃去PBS 洗涤液并小心加入无血清培养基。 孵育 1-2 天。 将培养基移至离心管， 4℃ 1,500 rpm 离心 10 分钟。 立即分装上清液（血清）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。 乳汁 收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。 分装上清液并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。 血浆 将全血收集到含抗凝剂的管中，例如 BD 抗凝真空采血管（目录号：363080/363080）或添加 0.1M 柠檬酸钠至 1/10 终体积。 4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。 立即分装上清液（血浆）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。 尿液 收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。 等分上清液（血清）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数 唾液 收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。 立即分装上清液（血浆）并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。 血清 将全血收集到未经处理的测试管中，或者到不含抗凝剂的管中，如 BD 血清用真空采血管（目录号：367812)。 在室温下连续孵育 20 分钟。 4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。 立即分
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细胞生长缓慢的原因分析
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
转载： 细胞生长缓慢的原因分析： 一.个别人的培养体系出现问题 1.检查你所培养的细胞是否存在污染。 (a) 如果培养细胞未添加抗生素(必须添加!),细胞污染则是不可避免的。 1)用肉眼和显微镜进行检查 2)如果细胞被污染则要弃掉。 (b)由于支原体污染不容易觉察到，因此必须定期检测 (c)检测可能污染的途径和原因 2.检查你用于培养细胞的培养基和血清(例如:是否批次不同或厂商不同)。如果你常规使用的是粉剂或10X储存液，而现在购买的培养基更换为1X液体，而随后证明问题就出自于此，处理方法请参见下则分享内容。 3.如果问题与培养基无关，那么很可能还是细胞的问题。 (a)复苏另一支冻存的细胞，并且与正在培养的细胞加以比较。两种细胞的培养应分开，以免在培养之初就产生污染。随后按(b) ~ (d) 步的方法做排查: (b)对传代培养的细胞进行计数，并绘制生长曲线与以前培养该细胞的资料进行比较，检在是否有下列改变: 1)传代时是否接种密度过低。 2)细胞传代是否过于频繁。 3)传代前细胞平台期是否过长。 (c)是否更换了胰蛋白酶或其他分离剂的批号?检查批号和供应商。 (d)是否细胞分离过程中严重损伤了细胞?应检测: 1)胰蛋白酶(其他消化试剂)消化时间是否过长。 2)消化液的浓度和活性是否过高、过强。 3)胰蛋白酶消化时、孵箱温度是否过高。 4)吹打消化细胞时是否过于用力。 5)细胞是否对EDTA过于敏感(如果添加了EDTA)， 6)胰蛋白酶稀释是否有误。 7)是否使用了一批劣质的胰蛋白酶消化液。 二.问题较为普遍，其他人也遇到同样的困难 检查共用的设备和试剂 温室和孵箱温度 1.温度和温度设定不准。 (a)自动调温器损坏。 (b)开关孵箱门过于频繁。 (c)孵箱门未关紧。 (d)风扇损坏造成散热不均。 用便携式温度表重新标定孵箱温度。 2.孵箱湿度不能维持 (a)水盘中未加水， (b)孵箱有渗漏。 (c)开关孵箱门过于频繁， (d)在Petri培养皿中放置一定量的PBSA,每日称重，以
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细胞培养小常识
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
切记，细胞培养基的储存条件是2-8℃。如果细胞培养基不小心被冻，您应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。 2.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢钠导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15min，来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。 3.当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 4.一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 5.总之，大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 6.血清的热灭活在免疫分析时可以灭活补体系统。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。热灭活是以往公认的操作步骤，并没有确凿的证据说明这样做是有益的。相反，对大部分细胞而言，GIBCO和HyClone都不推荐热灭活血清。因为加热可能使血清中的沉淀增加，使您误以为污染。 7.在进行传代培养时，我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释(1∶4或1∶2)进行传代，不进行活性检测，您可能接种比你认为的低得多的浓度的细胞，这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。 8.在订购的细胞到达后，应立即复苏，如果培养基还没有准备好，可将其放入液氮中，尽快复苏。千万不能放置在-20或-80℃的冰箱内。 9.细胞复苏往往是比较容易出问题的步骤。请在订购细胞时就向供应商索取详细的复苏步骤，并仔细阅读。有些供应商就不推荐在复苏时离心，对此类细节，应特别留意。 如何避免血清中沉淀物的产生? 1.
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初代细胞培养——消化培养法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
材料与仪器 组织 Hanks 培养液 胰蛋白酶 吸管 平皿 培养瓶 烧杯 搅拌器 三角烧瓶 不锈钢筛 眼科剪 眼科镊 计数板 实验步骤 1. 准备 取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20 分钟； 2. 布局 点燃酒精灯（或煤气灯），安装吸管帽（应通过火焰）； 3. 处理组织 把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60 分钟； 4. 剪切 用眼科剪把组织块切成2~3 毫米大小的块（用手术刀割亦可），以便于消化；加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞； 5. 消化 或用恒温水浴，或置入37 ℃温箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好（消化前瓶中需置一无菌搅棒）；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定； 6. 分离 在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块（必要时可继续进行消化）；低速（500~1000 转/分）离心消化液5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再加入培养液）； 7. 计数 用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH 要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说胆液体变酸，可用NaHCO3调整； 8. 培养 置入36.5 ℃温箱培养；如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。
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细胞培养中出现小黑点是什么原因？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在细胞培养中常可见到细胞及培养液中有一些大小不等、形态不同的黑色未知颗粒，去网上搜和请教师哥师姐得到的答案也多种多样。 那么这些小黑点究竟是什么那？我们又该怎么去应对这种情况那？ 小黑点都有哪些说法？ 非生物类 细胞碎片类 在细胞培养的时候， 由于细胞代谢、物质交换、周边环境变化，尤其是在从37度培养箱中拿出来观察的过程中，由于液体培养基的比热较大，液内温度高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，当然这些小碎末就会被搅动起来形成似乎“游动”的感觉；随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂，破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和残渣的出现； 再者，“小黑点”问题是很多细胞培养者已经发现的问题，但到目前为止尚未找到其监测和排除的试剂和手段，这首先是由于所谓“小黑点”病原体根本难以收集和捕捉， 这也从另一个侧面证明了“小黑点”问题的难以确定性；再说任何一种外来的微生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单地运动那样的外观性表现。 举一个例子：如果“小黑点”的运动状况已经到了用显微镜已经可以观察出的程度，其营养代谢和能量需求也就可想而知。这样，培养液中的影响消耗、酸碱含量程度等都要发生明显变化。 比如说：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡、引发其它类型微生物侵染等等。而这些状况，在所谓的“小黑点”感染中，是很难观察到的。同时“小黑点”的出现而影响细胞状态似乎得不到有力的证据。倒是细胞状态下降的时候，“小黑点”明显增多了。很有可能是细胞状态下降时，细胞衰亡产生的细胞碎片。所以小黑点属于细胞碎片是比较可能和合理的。 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西 网上有一篇文章说，小黑点其实不是一种生物，是无机物，其本质是玻璃培养瓶里的硅颗粒。可影响细胞生长，细胞状态好时，不
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什么是瘦肉精及检测的重要性？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
瘦肉精是一类药物，而不是某一种特定的药物，任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。在中国，通常所说的瘦肉精是指克伦特罗(Clenbuterol)，而普通消费者则把此类药物统称为瘦肉精。当它们以超过**剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，即有显着的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显着提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。 此类药物主要是肾上腺类，β激动剂，因为能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长，所以统称“瘦肉精”。瘦肉精让猪的瘦肉率提高，带来更多经济价值，但它有很危险的副作用。早报道的瘦肉精中毒事件是1998年供港活猪引起的，所以瘦肉精检测比较重要的呢。 瘦肉精胶体金快速检测卡，用于定性检测饲料、肉、尿液中瘦肉精-盐酸克伦特罗残留,沙丁胺醇残留，莱克多巴胺残留,整个检测过程（包括样本前处理）需要约5-10分钟，检测尿液的检测限为3ppb,饲料的检测限为30µg/L(30ppb)。试剂盒灵敏度：0.1-0.2ppb(µg/kg)，提供提取液，使用方便。
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27个细胞传代培养常见问题
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
1、一般拿到细胞后，应该注意什么? 收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒，放在培养箱静置若干小时后(看细胞密度而定)在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各两张)，排除细胞本身污染的情况。 2、何时须更换培养基? 视细胞生长密度而定，常规细胞2-3天更换培养基。 3、细胞何时进行传代较好? 一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了)，但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。 4、贴壁细胞如何进行传代? 去掉原T25培养瓶里面的培养基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;弃PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4 ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min;弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶补足培养基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。 5、悬浮性细胞应如何传代处理? 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加完全培养液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长，此时细胞生长状态良好，当补液时，需避免反复吹打。 6、贴壁细胞传代如何使用胰酶? 一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣子增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化
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WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC所用的抗体有什么区别？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
生物医学科研工作者的科研基本离不开抗体，WB（western blot）,IP(immunoprecipitation), IHC(immunohistochemical 免疫组化),IF(immunofluorescence 免疫荧光),ChIP(Chromatin immunoprecipitation)，FC(flowcytometry 流式细胞) 都需要用到抗体，那么这几种实验方法中的抗体有什么区别呢？ 我们在CST上面找p53的抗体，得到了如下的页面 可以看出p53抗体有很多种，并且每种抗体能做的实验还都不一样，那么为什么不同的抗体能做的实验不一样呢？这要从抗体是如何制备的开始。 1. 如何才能成为一个优秀的抗原？ 制备抗体之前最重要的是如何制备抗原。一个良好即优秀的抗原应该具备的素质是 a. 分子足够大。 我们知道抗原与抗原之间的区别是由抗原决定族决定的，抗原决定族又叫做表位（epitope），这些表位通常是由6-8个氨基酸组成的。而且要5-10kD才有一个表位，所以一些分子量太小的蛋白质或者多肽很难有一个表位的，也很难作为一个合格优秀的抗原。注意表位有两种形式，一种是线性表位，即由氨基酸的序列决定的。另外一种是构象表位，是由氨基酸的空间结构决定的。两个相隔很远的氨基酸序列在空间结构上靠在一起可以形成一个结构表位。 b. 外源性强。我们常常将抗原注射到动物内体得到抗体，因此抗原必须要与该动物体内的成分区别性大，因为动物对自身的物质形成了免疫耐受，如果抗原与动物自身的物质非常相似，则很难引起强烈的免疫应答，也很难得到好的抗体。 c. 结构尽量复杂。有些物质即使分子量很大也不能算是一个合格的抗原，比如明胶分子量特别大，也属于外源性强的物质。但是明胶的氨基酸基本上是直链的氨基酸，在体内容易被降解，类似的淀粉、核酸、多聚赖氨酸也是一样，不是一个合格的抗原。 2. 制备抗体中常用获得抗原的方式有哪些？ a. 人工合成多肽。很多家族蛋白相似度很高，比如actin家族中 a-actin, b-actin, r-actin三者之间非常相似，基本上只差几个氨基酸，而这些差别的氨基酸往往还被包
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细菌污染的原因有哪些？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
污染向来是在细胞培养中的大问题。预防或治理污染是细胞培养成功的关键因素。我们在细胞培养时，在开始阶段就要十分重视污染问题，否则会功尽弃，这样不仅浪费时间，也会浪费人力、物力。 (一) 有哪几类污染？ 在细胞培养过程中的污染不只是指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。 1、细菌污染 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，后变圆脱落死亡。 2、真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中见的一种，的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 3、支原体污染 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的小微生物，小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。 4、非同种细胞污染 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目，上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效
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从成年骨骼肌分离和培养成肌细胞的方法步骤
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
材料与仪器 D-PBSA 转运培养液 生长培养液 链酶菌蛋白酶液 尼龙网 手术刀 锋利的长剪刀 Petri培养皿 培养瓶 20ml离心管或一般容器 血细胞计数板 步骤 一、分离 1. 用手术刀切除活检组织块上的非肌性组织，然后用 D-PBSA 浸洗。 2. 称重前，与肌纤维平行将切除活检组织切成片，用冲洗。 3. 将组织片平行放入 Petri 培养皿盖内，切成较薄的柱状组织块，然后切成 1 mm3 小块。不要挤压组织。也可在试管内用长剪刀将组织剪成小块，应避免挤压组织。 4. 用 D-PBSA 浸洗组织块，静置后吸去上清液。 5. 在 37°C 条件下，用链酶菌蛋白酶液（0.15 % 链酶菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）、20 IU/ml 青霉素和 20 μg/ml 链霉素（0.4% Eurobio PES3000），用 Ham F12 或 D-PBSA 配制，100ml）消化组织块 1 h。每 1~3 mg 组织块用 15 ml 链酶菌蛋白酶液。每间隔 10~15 min 轻轻摇晃试管。 6. 孵育后用吸管研磨组织块。由于越来越多的细胞分离下来，培养液会逐渐变得浑浊。 7. 让组织块沉到试管的底部，形成沉降的组织块（P1 ) 和上清液（S1）。 8. 用孔径为 100 μm 的尼龙网将 S1 滤入 20 ml 离心管。轻轻摇晃或用吸管吹打上清液，使细胞混悬。 9. 离心（350 g，8~10 min）后，吸去上清液。 10. 准确加入 10 ml 生长培养液（Ham F12，添加 20 % FBS （Gibco 011-06290），200 ml），用带有橡皮吸头的吸管很轻微地混悬细胞。然后，用血细胞计数板计数细胞。 11. 用生长培养液稀释细胞悬液，以约 1.5×104 个/ml 的细胞密度将细胞接种于培养瓶。从 1 g 健康供体活检组织约获得 1~2×105个细胞。 12. 将 15 ml 消化液加入 P1，在 37°C 水浴中孵育组织块 30 min，并定时摇晃。 13. 用吸管吹打细胞悬液，使细胞分散。然后，用尼龙网过滤细胞悬液。用 20 ml 生长培养液浸洗滤网。 14. 离心（350 g，8~10 min）后，计数细胞，按上述方法接种细胞。 15. 将培养瓶移入湿润的培养箱，在 37°C 和 5 % CO2 的条
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