【产品介绍】：

A. DNA模板： ·   尽量使用高质量、纯化后的DNA作为模板 ·   需要提高保真度时，可使用较高的DNA模板浓度并减少循环数 ·   模板用量：以50 μl反应体系为例——         人基因组DNA：0.1~1.0 μg         大肠杆菌基因组DNA：10~100 ng         Lambda DNA：0.5~5 ng         质粒或病毒DNA：0.1~10 ng B. 引物设计原则： ·  引物长度要满足特异性需要，一般可在18~25个碱基之间；扩增长片段时**在24~30个碱基之间； ·  当引入克隆位点时，引物末端应额外增加3个以上碱基； ·  (G+C)%含量应尽量控制在40~60%，两条引物的(G+C)%含量应尽量接近； ·  引物中GC碱基分布均匀； ·  尽量避免相同碱基连续出现三次以上，3’端应避免使用A或T； ·  避免引物内部自身配对形成二级结构； ·  正反向引物之间应避免配对碱基，尤其是3’端的三个碱基，否则易生成引物二聚体(Primer dimer)； ·  两条引物的解链温度（Tm）值应在42~65℃之间，而且两条引物间**相差不超过5℃； ·  引物Tm值的计算方法：        20 nt以下：Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)        20 nt以上：Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt：引物的碱基数) ·  引物用量： ·  0.1~1.0 μM，通常可以0.2 μM起始，根据体系不同调整用量； ·  使用简并引物、随机引物时，需增加引物总量以弥补产量损失；但随着引物量加大，特异性将降低； ·  模板较大较多，或结构较复杂(如人基因组DNA)时，需减少引物用量以提高特异性； ·  模板较小较少(如质粒模板)时，增加引物用量可提高产量。 C. 核苷酸（dNTPs）： ·  常规dNTPs浓度为每种核苷酸0.1~1.0 mM，通常可以0.2 mM起始，根据体系不同调整用量； ·  低浓度（0.05~0.1 mM）可增加保真性，但会降低产量； ·  高浓度提高产量，尤其是长片段PCR，但会降低保真度。 D. 镁离子浓度 ·   对于Taq DNA聚合酶，镁离子的最佳浓度为1.5~2.0 mM； ·   最佳浓度取决于模板、缓冲液、DNA和dNTPs（每一种都有可能鳌合镁离子）； ·   镁离子浓度过低，会降低产量； ·   镁离子浓度过高，会增加非特异性PCR产物； ·   优化镁离子浓度时，通常以0.5 mM梯度递增，最高到4 mM。 E. Taq DNA 聚合酶浓度 ·   推荐使用浓度为 1~2.5 U/50 μl反应体系。 F. 起始反应 ·   在冰上配制反应体系； ·   最后加聚合酶； ·   将热循环仪预热至变性温度(94℃)后，放入PCR管，立即进行反应。 G. 变性温度与时间 ·   通常于94℃初始变性，使DNA双链完全打开； ·   变性时间通常为15~30秒； ·   避免长时间或高温度孵育； ·   高GC含量模板可提高变性温度至98℃。 H. 退火温度与时间 ·   通常情况下，退火温度为引物Tm值减5℃，在55~60℃之间； ·   提高退火温度有利于减少非特异性条带； ·   常规退火时间为15~30秒。 I. 延伸温度与时间 ·   延伸反应通常在72℃下进行。 ·   Taq酶的延伸时间大约为15~30秒/kb DNA； ·    产物小于1 kb时，建议延伸时间为30~60秒； ·    产物大于3 kb或反应超过30个循环时，可能需要更长的延伸时间。   典型的循环条件： 预变形94℃ 2 分钟 94℃ 30秒， 55℃ 30秒， 72℃ 1分钟/1 kb，25~30个循环 72℃ 5分钟   注：上述反应条件适用于普通Taq DNA聚合酶催化的PCR反应。当DNA模板富含GC、具有复杂二级结构、低浓度或产物>5 kb时可能需要改变相应条件。