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常用外泌体研究样本来源有哪些？ Chris Gardiner等2016发表的调查报告有报道细胞培养上清液是最常用来提取外泌体的样本来源，除了细胞上清，其他最常见的体液是血浆(47%)、血清(22%)、尿液(14%)、脑脊液(8%)和乳汁(5%)。 (Gardiner C et al., 2016, J Extracell Vesicles) 逍鹏生物Dr.Cell实验室从外泌体NTA检测样本中统计分析了其中1620例，对其外泌体来源进行分析，结果如下图，统计结果表明外泌体来源趋势与以上文献报道基本一致。NTA检测样本的外泌体最常用来源依次是细胞培养液、血清、血浆、组织、尿液等。   我们预计当外泌体更多的应用于诊断与预后评估时，血清与血浆样本比例应会大幅 持续上升。   02 如何鉴定提取出来的外泌体？ 以目前外泌体的分离手段很难获得十分纯净而且单一的外泌体样品，也没有任何一个单一实验可以确定外泌体的存在。根据国际细胞外囊泡协会发表的指导手册《MISEV 2018》，外泌体特征鉴定通过NTA测粒径分布、TEM电镜分析形态、WB检测标志蛋白三项来验证。NTA分析样品中外泌体的粒径分布和颗粒浓度，TEM电子显微镜来观察样品中外泌体的形态特征，WB检测外泌体标志蛋白。   03 外泌体如何保存？ 不同时间、温度的保存对不同的外泌体样本影响不一；如果研究方向为外泌体形态特征、蛋白或其他功能性分析，在分离后新鲜使用为最佳。目前主流的建议是提取出外泌体后**是新鲜使用，或低温短期保存。 短时间几天内可以放4°C，长时间储存置于-80°C保存。   04 NTA检测可以进行外泌体定量吗？ NTA是物理方法，基于颗粒的布朗运动，因为不管是脂质体、蛋白，甚至是PBS中的颗粒（部分实验室自行配置的PBS中发现大量颗粒，推荐在外泌体研究中，用VC品牌的PBS（P/N:C3580-0500），避免干扰），都会被软件读取，并不能分辨是否为外泌体。但NTA提供的粒径分布可供判断所提取的内含物是否在外泌体的粒径范围内；另外，在做外泌体分泌的对比实验中，NTA提供的浓度值也可以作为重要的参考数据。   05 外泌体NTA检测需要多少量？ Zetaview仪器的最佳检测区间是10^7 particles/ml，且有浓度检测下限，为10^5 particles/ml，一般进样量不少于2 ml； 无法准确建议送样量，检测需要量与样本本身浓度有关，样本浓，则用量小，反之则多，根据检测经验，样本取用量一般在2 µl-100 µl不等，取用量大于50 µl时大多由于样本分泌量过低、提取失败或者对样本有过多稀释。 一般建议：送样量不低于30 µl。 06 外泌体用什么分离方法比较好？ 无法明确哪种分离方法比较好，各有千秋，以下列出常用的外泌体分离方法： 超速离心法（差速离心和密度梯度离心）：操作繁琐，耗时长，分离外泌体纯度较高，但得率低，目前分离外泌体主流方法； 尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）：应用填充多孔聚合物微球的柱子，精确分离大小分子，操作简便，耗时短，分离外泌体纯度较高； 聚合物沉淀法：操作简便，耗时短，可能会同时分离非囊泡污染物（包括脂蛋白），分离外泌体纯度较低； 磁珠免疫法：通过特定的抗体组合从样本中捕获不同类型的外泌体，免疫亲和技术具有高特异性、可获得高纯度的外泌体、且不影响外泌体形态完整等优点，是富集表征独特的外泌体的优选方法。但是此方法效率低，外泌体内含物的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验的进行。 组合方法：如聚合物沉淀法+SEC (CellGS Exo-spin 外泌体纯化试剂盒）纯化流程温和，无需高速离心，操作简便并且产物纯度高，分离出的外泌体完好无缺，适用于下游功能研究、WB验证、RNA分析等。   07 WB检测哪个蛋白指标？ 外泌体相关文献统计，排在前4位的检测指标为CD63、TSG101、CD9、CD81；接着检测较多的4个指标为Alix、HSP70、flotillin和Syntenin等。 然《MISEV 2018》并未提出可以特异性地表征外泌体的分子标记。仅列出了必须在所有外囊泡制剂中分析的三类标记物，以证明外囊泡（类别1和2）并评估其从常见污染物中的纯度（类别3）。 注： 类别1：跨膜或GPI锚定蛋白，质膜和/或胞内体上任何类型外囊泡的标志，如CD63、CD81、CD82、CD9等； 类别2：细胞溶质蛋白（cytosolic proteins ，真核细胞和革兰氏阳性细菌）或周质蛋白（periplasmicproteins，革兰氏阴性细菌），分析确定脂质双分子层结构，如TSG101、HSP70、ALIX等； 类别3：非外囊泡结构的主要成分，通常与外囊泡共同分离。主要用来评估外囊泡制剂的纯度，如血清、血浆中的脂蛋白。 即《MISEV 2018》要求外泌体标志物鉴定，至少2个阳性指标：CD9、CD63、CD81 三选一以及TSG101、HSP70、ALIX三选一，另外纯度鉴定再加阴性对照。 08 WB检测用什么内参基因？ 目前大部分文献中没有检测内参基因，个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测，从文献调研结果来看，外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低，Western blot检测时可能会检测不到任何条带或者条带微弱。因此，更多的是用等蛋白定量校准样品间的差异。 09 WB检测需不需要裂解？ 裂解和不裂解都可以，建议裂解，裂解后蛋白浓度会更高。 10 外泌体电镜是不是一定要有膜结构？ 负染电镜结果中外泌体的形态是那种明显的茶托样，边缘有一圈略微更明亮的亮圈。如果结构是没有膜结构的圆球形，很可能是脂蛋白颗粒或者抱团的蛋白质。 11  外泌体研究中细胞培养用无血清还是血清培养？ 外泌体研究中，如果仍然使用胎牛血清培养细胞、通过收集上清液来提取外泌体，胎牛血清中大量的牛源外泌体将对实验分析造成极大的干扰。建议使用去外泌体血清（P/N:C3801-0050）培养细胞。