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腔肠荧光素酶/萤火虫荧光素酶fireflyluciferase报告基因技术的应用原理
发布时间:2021-03-08     作者:zzj   分享到:

荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

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双荧光素酶报告基因系统

生物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程,基因表达调控主要发生在转录水平。基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机制上,对基因调控的研究将是今后相当长一段时间内功能基因组学研究的热点之一。双荧光素酶报告基因检测(Dual- Luciferase reporter assay,DR)已成为研究转录因子参与基因调控的有效手段,通过对启动子DNA片段的分析,验证启动子结合元件的反式激活能力,探讨转录因子在信号转导中的分子机制 。

应用原理

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

其原理简述如下:

1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒,如pGL3-basic等。

2) 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

3) 加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

技术流程

1) 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中。

3)筛选阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

4) 扩增转录因子质粒,提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照,提纯备用。

5) 培养293(或其它目的细胞),并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%汇合度)。

6) 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

7)提取蛋白并用于荧光素酶检测。

8) 加入底物,测定荧光素酶的活性。

9) 计算相对荧光强度,并与空载对照比较。

双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时, 通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。

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zzj 2021.3.8




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极低温产品:极低温产品运输过程中加装干冰运输。

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