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利用化学发光法测定中药抗氧化活性的方法分析
发布时间:2021-02-23     作者:zzj   分享到:

抗氧化活性是中药的重要药效之一,化学发光法(CL)是有力的评价手段,具有灵敏度高、线性范围宽、重现性好等优点。化学发光(Chemiluminescence, CL)反应是指反应体系中的物质吸收了反应释放的化学能, 电子从基态跃迁至激发态, 再以光辐射的形式释放能量回到基态的过程。化学发光分析法是通过分析化学发光反应中辐射光强度大小来确定反应体系中某种物质浓度的方法。目前, 常用于中药抗氧化成分的分析方法除化学发光法外, 还有二苯代苦味肼基自由基(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)法、氧化自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Capacity, ORAC)法和铁离子还原/抗氧化能力(Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP)法等。它们都是利用待测物与某类自由基反应, 通过测定反应后剩余的自由基或产物来评价待测物的抗氧化性。DPPH法、ORAC法和FRAP法通过紫外-可见分光光度计或荧光分光光度计直接测定DPPH、荧光素钠和Fe2+-三吡啶三嗪发光, 操作快速简便, 但是, 具有较强的光吸收特性或荧光(淬灭)特性的物质会干扰测定结果。化学发光法不需要外界提供能量, 可避免背景光和杂散光的干扰, 具有灵敏度高、线性范围宽、无光散射的干扰、重现性好、仪器简单和分析速度快等优点。

化学发光法在中药抗氧化活性测定的方法

1.简单化学发光反应测定中药抗氧化活性

简单的化学发光法应用是将发光试剂和待测物直接混合进行化学反应, 通过记录发光强度的变化值, 评价待测物的抗氧化活性。中药的抗氧化作用一般表现为对发光强度的抑制能力, 检测到的化学发光信号越弱, 表明待测样品的抗氧化能力越强, 通常以清除率或半抑制浓度(Half Maximal Inhibitory Concentration, IC50)来表征。清除率(%)=[(阴性对照光强-样品光强)/(阴性对照光强-空白背景值)]×100%。以待测样品的浓度为横坐标, 相应清除率为纵坐标, 绘制浓度-清除率曲线图, 当清除率为50%时样品的浓度为IC50。

采用邻苯三酚-鲁米诺体系测定红景天苷及其苷元酪醇O2-·的清除率。试管中先后加入碳酸盐缓冲液(Carbonate Buffer Solution, CBS)(0.1 Mm, pH 10.3)300 μL, 鲁米诺溶液(1.0 Mm)100 μL, 样品溶液50 μL, 邻苯三酚溶液(1 mmol·L-1)50 μL, 振荡6 s后测得酪醇清除率略高于红景天苷, 说明红景天苷的抗氧化活性与苷元有关。舒希凯[6]分别采用邻苯三酚-鲁米诺、过氧化氢-鲁米诺、Fe2+-过氧化氢-鲁米诺体系考察了3种干燥方法处理的芍药花50%醇提物对O2-·、H2O2、OH·的清除率。以抗坏血酸为阳性对照, 依次加入鲁米诺溶液4 mL、样品0.5 mL、氧化溶液0.2~0.4 mL, 光电倍增管高压800 V, 记录200~400 s内的发光积分强度, 计算IC50。结果IC50阴干 < 烘干 < 冻干, 与总酚和总黄酮含量呈正相关。Benchennouf A等[7]采用Co2+-过氧化氢-鲁米诺体系测定枸杞不同部位(样品经正己烷脱脂, 二氯甲烷和甲醇提取, 提取液经液液萃取分为甲醇、乙酸乙酯和正丁醇部位) OH·的清除率。样品池中加入含有CoCl2(2 mg·mL-1)和EDTA (10 mg·mL-1)的鲁米诺溶液(0.56 mM)100 μL, 硼酸缓冲液控制pH 9, 加入提取物溶液, 混合15 s, 再加入H2O2(5.4 mM)25 μL开始反应。结果显示乙酸乙酯部位的抗氧化活性强。Lee J C等[8]采用过氧化氢-鲁米诺体系揭示了雪莲醇提物的抗氧化活性。鲁米诺溶液(磷酸盐缓冲液调pH值至7.4) 0.1 mL和样品溶液0.2 mL混合120 s后加入H2O2溶液0.1 mL, 记录300 s内的累积发光强度。雷利芳[9]使用微孔板式生物化学发光仪测定覆盆子水提物对3种自由基的清除能力。将样品稀释后加于微孔中, 再将氧化剂和鲁米诺分别引入分析系统, 振板混匀使之快速反应, 记录发光信号。对3种体系的条件进行优化, 当pH值为9.2, 鲁米诺、H2O2浓度分别为4×10-5 mol·L-1和0.48%时, 清除H2O2能力较强; 鲁米诺、邻苯三酚、NaOH浓度分别为1×10-4、2.5×10-4、6.0×10-3 mol·L-1时, 清除O2-·的能力强; 鲁米诺、CuSO4、H2O2浓度分别为5×10-6 mol·L-1、7×10-8 mol·L-1、0.24%时, 清除OH·的能力强。结果显示覆盆子水提物对这3种自由基均有明显的抑制作用。

2.流动/顺序注射化学发光分析法测定中药抗氧化活性

大多数化学发光非常微弱, 且反应速度很快, 手工操作重现性差, 采用流动注射(FI)进样可提高测定的重现性, 不需要达到化学平衡的状态下就能进行操作, 实现自动连续分析。在流动注射分析(Flow Injection Analysis, FIA)的基础上, 又发展了顺序注射(Sequential Injection, SI), 多通道选择阀分别与检测器、样品、试剂等通道相连, 试剂与试样由于径向扩散和轴向对流作用混合一定时间后推至检测器。与传统的流动注射分析相比, 顺序注射可以用同一装置完成不同项目的分析而无需改变流路设置

3.高效液相色谱化学发光联用法(HPLC-CL)测定中药抗氧化活性

中药为多组分复杂体, 传统方法对化学成分逐一分离、鉴定并评价抗氧化性, 步骤繁琐、费时。将化学发光检测器与HPLC等技术联用, 样品经分离后进入T型管与氧化剂和发光剂反应, 记录发光信号, 可以将高效分离手段与高灵敏的检测技术相结合, 使复杂组分经过色谱柱逐一分离, 进行抗氧化活性的测定和评价。在此基础上, 再辅以液质(HPLC-MS)鉴定, 可进一步明确抗氧化成分的结构。

4.毛细管电泳化学发光联用法(CE-CL)测定中药抗氧化活性

毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的液相分离技术, 将其与化学发光检测器联用, 具有分析速度快、试剂用量少、仪器简单等优点。将分离毛细管末端插入内径稍大的反应毛细管中, 另在反应毛细管上钻一小孔插入引流毛细管, 发光试剂采用重力引流方式通过引流管引入, 分析物、发光试剂在分离毛细管出口处相遇, 进行化学发光反应。但是, 由于受到电泳液流与发光液流相互干扰、信噪比不高等影响; 目前, CE-CL联用技术的应用较少。

采用次氯酸钠-过氧化氢-鲁米诺和Cu2+-过氧化氢-鲁米诺体系研究麻黄、苦参、黄连、黄柏和贝母中生物碱的抗氧化活性。CE缓冲介质为硼酸盐, pH 9.60, 分离电压15 kV。鲁米诺的浓度3.0 mmol·L-1, H2O2浓度15 mmol·L-1, NaClO浓度0.05 mmol·L-1, 引流位差25 cm; 鲁米诺浓度2.5 mmol·L-1, H2O2浓度10 mmol·L-1, Cu2+浓度0.5 mmol·L-1, 引流位差5 cm。结果显示苦参含有的抗氧化组分较多且氧化活性也较强, 其余依次是黄柏、麻黄、黄连和贝母。还建立了黄芪抗氧化活性生物指纹图谱。测得黄芪甲苷等6个色谱峰对OH·具有清除作用。

化学发光法应用于中药分析, 具有灵敏度高、线性范围宽、操作简便的特点。可以直接测定样品对各种氧自由基的清除率, 引入流动/顺序注射装置可实现高通量筛选, 与HPLC或CE等分离方法联用, 可同时对多个化学成分的抗氧化活性进行评价, 建立生物活性谱, 探索谱效关系, 结合HPLC-MS技术, 还可对抗氧化成分的结构加以确证。

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以上内容来自zzj 2021.2.23



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