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PI单染色法原理及操作步骤
发布时间:2021-01-20     作者:zzj   分享到:

PI单染色法原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等,其中细胞核的改变具有很大的特征性。


荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测,英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用,能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。

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PI单染色法实验原理


1. 细胞核的改变:由于凋亡细胞核的改变,造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明,用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2. 光散射特性:凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前散射光与细胞的大小有关,而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,故前散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是,根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好,而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来,用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。


需要的试剂和仪器10:05:01

1, PBS溶液;

2, PI染液:将PI溶于PBS(pH7.4)中,终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。

3,70%乙醇 4,400目筛网  5, 流式细胞仪


实验步骤

1. 收集细胞{数目约(1~ 5)×106个/mL},500 ~ 1000 r/min离心5min,弃去培养液。

2. 3ml PBS洗涤1次。

3. 离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1—2小时。

4. 离心弃去固定液,3mlPBS重悬5min。

5. 400目的筛网过滤1次,500—1000r/min离心5min,弃去PBS。

6. 用1ml PI染液染色,4℃避光30min。

7. 流式细胞仪检测:PI用氩离子激发荧光,激光光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

8. 结果判断:在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析PI荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片,在PI荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准,两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

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注意事项:细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

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以上内容来自齐岳小编 zzj2021.1.20




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德尔塔(Delta)供应的产品仅用于科研,不能用于人体治疗、药物开发、和其他商业用途,如有购买方或第三方采购我公司的产品用于治疗、药物开发或商业用途,购买方或第三方将承担所有法律责任,我公司也将追究其法律责任。以上产品均可定购。


【运输说明】:


极低温产品:极低温产品运输过程中加装干冰运输。

低温产品:低温产品运输过程中加装冰袋运输。

常温产品:常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。


【目前合作的部分科研单位】:

重庆医科大学,西南大学,第三军医大学,西南交通大学,重庆大坪医院,四川大学,华西医院,电子科技大学,哈尔滨工业大学,吉林大学,长春应化所,沈阳药科大学,中国海洋大学,北京大学,清华大学,北京理工大学,北京师范大学,北京中医药大学,中国农业大学,北京市肿瘤防治研究所,北京军事医学科学院,中国科学院动物研究所,中国科学院化学研究所,第四军医大学,西安交通大学,湖南大学,中南大学,武汉大学,武汉协和医院,华中科技大学,中山大学,广东药科大学,深圳大学,华南理工大学,中国科研学院先进技术研究院,厦门大学,福州大学,浙江大学,南京大学,南京医科大学,东南大学,中国药科大学,苏州大学,山东大学,山东师范大学,上海交通大学,华东理工大学,复旦大学,郑州大学,河南烟草局,宁夏医科大学,新疆大学,中国人民大学,中国科学院苏州纳米研究所,国家纳米科学中心,武汉病毒研究所,中国科学院过程工程研究所,江苏省原子医学研究所,中国科学院宁波材料技术与工程研究所,中国科学院上海硅酸盐研究所,中国医学科学院生物医学工程研究所等等

 

【目前合作过的药厂】:

石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,西安力邦制药有限公司,上海药明康德新药开发有限公司,安徽省国平药业有限公司,苏州亚盛药业有限公司,兆科药业(合肥)有限公司,南京绿叶制药有限公司,山东绿叶制药有限公司,大冢(上海)药物研究开发有限公司,国药集团化学试剂有限公司,长春金赛药业有限责任公司,成都苑东药业有限公司,浙江海正药业等。


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