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Cultex细胞暴露技术建立呼吸道过敏反应的人肺体外模型
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
方法简介 化学品引起的呼吸道过敏反应，不论是体内还是体外，目前尚缺少有效的评价方法。因此，新实验方法的开发收到极大的关注，特别是考虑到REACH（《化学品注册、评估、许可和限制》）新的法规规定。应注意的是，REACH指导方针明确指出，应尽量避免动物实验，其中，化妆品材料应在2013年全面禁止动物实验。所以，建立体外模型显得非常必须和十分的紧迫。 为了化学品呼吸道过敏反应的人肺体外模型的建立，我们采用Cultex技术开发一种三维共培养系统，模拟人肺肺泡区。该系统，采用细胞气液界面暴露技术，使体外培养的细胞在完全模拟人肺部环境下暴露于气溶胶或颗粒物质。 方法 建立三种类型的共培养系统： 双细胞共培养模型： •人肺上皮细胞（ECs）：A549细胞 •人肺泡巨噬细胞（AMs）：U937细胞 三细胞共培养模型，类型1和类型2： • ECs: A549 cells • AMs: U937 cells, differentiated to AMs with PMA • Human immature dendritic cells (DCs): DCs differentiated from human peripheral blood monocytes ECs种在BD细胞培养插件上，培养7天。形成上皮细胞层后，AMs种在ECs层上。对于三细胞共培养类型1，DCs培养在细胞培养插件上（如图1A）；对于三细胞共培养类型2，DC细胞种在上皮层内侧（如图1B）。 细胞培养的终点特征： • EC层完整性：用Millicel-ERS (Millipore)测量跨上皮电阻（TEER）。 • EC层功能：表面活性蛋白(proSP-C)染色。 • Immature DCs: Staining of DC-marker CD1a and maturation markers CD83/CD86 使用体外暴露染毒系统（Cultex）的共培养模型对呼吸敏化剂和刺激物进行暴露染毒实验。 结果 TEER测量：电阻值随着时间增加。最高值出现在第7天（红色箭头），此时对插件进行处理（图.2）。 图 2: 每个值是3个腔室内测量的标准偏差平均值。 Staining of surface markers: ECs中表面活性蛋白proSP-C产物，用免疫化学染色方法所示（图.3A）。作为阴性对照，AMs没有染色阳性proSP-C (图. 3B
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显微镜物镜的使用手册
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
初次使用100x显微镜的朋友可能不太了解，用倍数稍微大点的目镜都和标本贴起来了但只能看见标本的颜色，其他细节都没法看见，不知道该怎么用。 其实100倍的物镜是需要滴油观察的，这就是所谓的油镜。观察时需要你在被观察区域滴一滴松柏油，然后显微镜先从低倍将图像找到，调整粗细准焦，然后逐一换到100倍。 这里就有问题了，物镜倍数越大，物镜与标本的距离越小：用香柏油是不是不用贴着标本进行观察？其实100倍的物镜没有贴到标本上的，只是距离太近了，香柏油的做用是使物镜跟物体表面处在相同介质中，增加折光率。 打个比方我看一个叶子的标本，不滴香柏油不用贴着标本，只能看到一片绿色，同样的距离滴上香柏油就可以看清楚？（变形问法：原来20x目镜100x物镜没看清，不是因为距离问题而是因为没滴香柏油的问题，20x目镜100x物镜是可以看清的？） 事实是这样的，如上所诉，100倍物镜属于油镜，再没滴油时使用，只能模糊的看到效果，只有滴油才把物镜的效果发挥出来。 使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。 使用油镜有许多注意事项。 （1）在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。 （2）将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。 （3）转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。 （4）用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。 如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油
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慢病毒包装的技术原理及现状
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达siRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达siRNA/miRNA,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA/miRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 慢病毒包装的原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 慢病毒包装的简单流程 1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3） 培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4） 病毒的纯化和浓缩。 5） 分装，- 80 ℃保存。 6） 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 慢病毒包装存在的问题 尽管慢载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。首先，重组病毒的滴度还不够高，除Naldini等报道的结果外，其余均在101TU/ml~103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要；其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像目前常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困 难，已建立的包装细胞均不理想。据报
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光化学反应仪技术更加理想的应用方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
光化学反应器是近20年才出现的处理技术，在足够的反应时间内通常可以将有机物完全矿化为CO2和H2O等简单无机物，避免了二次污染，光化学反应器简单高效而有发展前途。由于以二氧化钛粉末为催化剂的光催化氧化法存在催化剂分离回收的问题，影响了该技术在实际中的应用，因此光化学反应器固定在某些载体上以避免或更容易使其分离回收的技术引起了国内外学者的广泛兴趣。 一、光化学反应器技术的研究现状 目前，国内外对光化学反应器的研究主要有两种。第一种是非填充式固定床型的固定技术，它以烧结或沉积方法直接将催化剂沉积在光化学反应器内壁，进行污水处理时以泵为动力，光化学反应器使污水在污水槽与光催化反应器之间循环回流，光催化反应在反应器里进行。譬如，张彭义等人研究了苯甲酸类物质的光催化降解，光化学反应器其TiO2的固定方法如下[1]：用两个120W高压汞灯辐射铝板，同时含有TiO2粉末的酸性悬浮液不断循环流过被辐射的铝板，光化学反应器悬浮液中的TiO2在紫外光和酸性条件的作用下沉积在铝板上而形成固定膜。第二种是填充式固定床型的固定技术[2]，光化学反应器即将TiO2烧结在载体(如砂、硅胶颗粒、玻璃珠、玻璃 纤维等)表面，然后将上述颗粒填充到反应器里。此类固定技术虽可增大光催化剂与液相的接触面积(反应速率比悬浮型光反应器还要高)，光化学反应器但载体颗粒较小，还需进行繁琐的分离、回收过程[3]。 二、光化学反应器固定化技术研究 1、机理探讨 有研究表明，光化学反应器一种类似于非填充式固定床型的催化剂固定技术，即布置于反应器底部、载有TiO2膜的玻璃纤维经过表面修饰(在TiO2表面担载某些重金属或金属氧化物 ，光化学反应器如Ag、Au、Pt、Pd、Nb、RuO2和Pt-RuO2等)能提高TiO2光催化活性。考虑到采取 此项技术进行饮用水深度净化时，金属含量低则不起作用，光化学反应器含量高则使水中重金属含量超过饮用水标准，故笔者试图从另一角度，即提高TiO2吸附能力方面来研究催化剂的固定化问题。
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修正Binder烘箱温度过冲的步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
Binder是完美模拟生物、化学和物理环境条件领域的领导者。Binder提供的烘箱品种齐全，不仅适用于常规用途，也满足非常特殊项目的应用要求。的使用者遍布全球。 在实验中，如果遇到Binder烘箱温度过冲的问题该如何解决，东南科仪工程师为你讲述修正温度过冲的步骤。 1.按住 按键约5秒钟 屏幕上会交替显示”UNIT” 和温度的单位如下： 2.再轻按 一下 屏幕上会显示“rASd”以及对应数字“0-10”，如下： 3.通过 来修改这个数字 4.约2秒钟后，烘箱默认修改后的值。 说明1： rASd对应的数字： 0表示最大的加热功率，1-10的设置表示多少度每分钟，如数字5表示：一分钟可以升温5度。 说明2： 一般出厂时默认设置是0，表示最大的加热功率。如果出现温度过冲严重时，可以考虑把rASd对应的数字改为3，或者改为4. 更多binder烘箱的温度过冲问题，请咨询东南科仪工程师！
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显微镜机械装置故障的排除
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
1、粗调部分故障的排除 粗调的主要故障是自动下滑或升降时松紧不一。所谓自动下滑是指镜筒、镜臂或载物台静止在某一位置时，不经调节，在它本身重量的作用下，自动地慢慢落下来的现象。其原因是镜筒、镜臂、载物台本身的重力大于静摩擦力引起的。解决的办法是增大静摩擦力，使之大于镜筒或镜臂本身的重力。 对于斜筒及大部分双目显微镜的粗调机构来说，当镜臂自动下滑时，可用两手分别握往粗调手轮内侧的止滑轮，双手均按顺时针方向用力拧紧，即可制止下滑。如不凑效，则应找专业人员进行修理。 镜筒自动下滑，往往给人以错觉，误认为是齿轮与齿条配合的太松引起的。于是就在齿条下加垫片。这样，镜筒的下滑虽然能暂时止住，但却使齿轮和齿条处于不正常的咬合状态。运动的结果，使得齿轮和齿条都变形。尤其是垫得不平时，齿条的变形更厉害，结果是一部分咬得紧，一部分咬得松。因此，这种方法不宜采用。 此外，由于粗调机构长久失修，润滑油干枯，升降时会产生不舒服的感觉，甚至可以听到机件的摩擦声。这时，可将机械装置拆下清洗，上油脂后重新装配。 2、微调部分故障的排除 微调部分最常见的故障是卡死与失效。微调部分安装在仪器内部，其机械零件细小、紧凑，是显微镜中最精细复杂的部分。微调部分的故障应由专业技术人员进行修理。没有足够的把握，不要随便乱拆。 3、物镜转换器故障的排除 物镜转换器的主要故障是定位装置失灵。一般是定位弹簧片损坏（变形、断裂、失去弹性、弹簧片的固定螺钉松动等）所致,更换新弹簧片时，暂不要把固定螺钉旋紧，应先作光轴校正。等合轴以后，再旋紧螺丝。若是内定位式的转换器，则应旋下转动盘中央的大头螺钉，取下转动盘，才能更换定位弹簧片，校正的方法与前面相同。 4、聚光器升降机构故障的排除 这部分的主要故障也是自动下滑。排除方法如下： （１）直筒显微镜聚光器的升降机构调整时,一只手用双眼螺母扳手插入手轮端面上的双眼螺母内，另
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双重免疫组化实验原理及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
双重免疫组化是科研中的较好的一种免疫组化方法，其原理就是根据阳性表达部位和阳性表达区域不同所建立的一种直观的多色定位的染色方法。其标记的对象是两种或两种以上的细胞部位。主要标记部位如下： 1.膜+浆型 2.膜+核型 3.浆+核型 切不可膜+膜，核+核，以免影响效果和颜色重叠。由于HRP和AEC显色系统的肉眼镜下颜色不同，所以直接抗原定位表达就非常直观了。 双重免疫组化的步骤： 1、切片脱蜡至水 2、阻断内源性过氧化物酶（198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2）室 温20分钟。 3、pH7.2缓冲液洗三次。 4、胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。（或按说明书要求：放入抗原修复液内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或不处理） 6、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用） 7、擦去多余血清，加一抗37 ℃，30分钟。 8、pH7.2缓冲液洗三次。 9、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。 10、pH7.2缓冲液洗三次。 11、滴加ABC或S-P复合物，37 ℃，45分钟。 12、pH7.2缓冲液洗三次。 13、DAB或（BCIP/NBT紫蓝色）显色3~10分钟。 14、pH7.2缓冲液洗三次。 15、双标阻断液，10分钟（可不用） 16、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用） 17、擦去多余血清，加第二种一抗37 ℃，30分钟。 18、pH7.2缓冲液洗三次。 19、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。 20、滴加碱性磷酸酶复合物，37 ℃，30分钟。 21、AEC显色 22、水洗 23、苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固 注意事项： 1.玻片的处理 双重免疫组化步骤繁多，两次热修复对玻片涂胶要求较 高，以免脱片。 2.由于两种显色系统颜色可能产生重叠，所以应该先让不容易显的放在前面，容易出色的放在后面。无特别说明，还是先出HRP系统，后AEC系统。 3.双重染色要有目的性，不可盲目双重染色造成结果无
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免疫组化实验操作步骤有哪些
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
免疫组化实验所需试剂 1）PBS缓冲液（pH7.2~7.4）：NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）：柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g. 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml. 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml. 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0~9.5）等量混合； b、油和TBS（或PBS）配制。 8）TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本；pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。 免疫组化实验操作流程： 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟； 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 （3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放
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二抗孵育时间及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
二抗孵育（Secondary antibody inucubation） 参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。 吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1~2小时。回收二抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 第3步TBS洗涤是为了洗去膜上的Tween-20,因为它可以阻碍底物的沉积。 注意事项 1） 抗体保存注意事项： 2）收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！ 3）对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃ . 4）分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10 ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。 5）复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在40℃，避免再冻起来！ 6）绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。 7）大部分抗体收到后40℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。 8）长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染。 一抗/二抗使用问题： 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。 天然和非还原样品问题： 有些抗体只能识别的表位是非连续氨基酸，这些氨基酸虽然在蛋白质一级结构中彼此不连续，但是在空间结构中则是靠在一起的。这些抗体就只能识
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奥林巴斯生物显微镜的维护与保养
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
更换镜头时应特别小心，避免手指接触透镜表面。镜头用毕应贮存于干燥洁净的干燥皿中，一免镜片胶合剂发霉而致损坏。 聚焦调节时，物镜头部不能与试样接触，应先转动粗调旋钮使物镜尽量接近试样（目测），然后从目镜中观察的同时调节粗调旋钮， 使物镜渐渐离开样品直到看到显微组织映象时，再使用微调旋钮调至映象清晰为止。镜头表面有污垢时，严禁用手或织物擦摸，应先用专用的橡皮球吹去表面尘埃， 显微镜不使用时需用防尘罩盖起（防尘罩可用玻璃、绸布等） 1、显微镜是精密仪器，操作时要小心，并避免突然和剧烈的震动。在下列场合不要使用仪器。靠近空调等设备的进气孔和排气孔的地方。靠近产生不正常噪音设备的地方。 2、不要强迫各种调节装置越过限位，这些位置表示操作的极限。所以不要用力过大。 3、为了防止灰尘侵入，在不使用模块时，应把原来装在相应模块安装座上的密封帽套上。清洁各种玻璃部件时，严禁用手或手帕等擦摸，不能用嘴吹，必须先用专用的橡皮球吹去表面尘埃，再用专用擦镜纸轻轻擦拭。要除掉指纹或油渍时，用少量的乙醚（70%）和酒精混合溶液沾湿专用擦镜纸擦拭。注意不要把这些化学品接近明火和可能的电火花来来源，如进行开关操作的电子设备。且只能在通风良好的房间使用。 4、如果玻璃部件以外的显微镜其他部件脏了，用一块干净布擦去。如果过分脏，不要使用有机溶剂擦拭。而要使用一块无毛软布蘸少量中性清洁剂擦拭。 5、不要拆开显微镜的任何部分。这会造成功能失调或性能下降。 6、不使用显微镜时，一定要把主开关拨到“0”（关）。等灯室完全冷却后，在贮藏前，把它用所提供的防尘罩盖上。 7、显微镜应放置在干燥通风，少尘埃及不发生腐蚀气氛的室内。室内的相对湿度应小于70%，要注意适时通风。但同时仪器不宜长期受阳光直射。室内温度过低机械部分的润滑脂容易冻结，使操作困难。在显微镜物镜、目镜装置处放上防护罩，以防尘埃进入镜体；仪器周围或内腔**放置防霉剂，如甲醛B-萘酚
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常用的免疫组化技术方法介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
根据生物技术实验总结我们知道，免疫组化技术就是用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，其又称之为免疫细胞化学技术。下面简单介绍几种常用的免疫组化技术方法，希望能够加深大家对免疫组化技术的了解。 目前常用的几种免疫组化技术方法有以下几种： （1）免疫荧光方法：是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 （2）免疫酶标方法：免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。 （3）免疫胶体金技术：免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，
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免疫组化实验注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。那么在做免疫组化实验注意事项有哪些呢？下面我们来详细了解一下： 对照/标本无染色 ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。 ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。 ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。 ④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。 ⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。 ⑥ 检查标本的储存条件，**用已知阳性的标本来同时做阳性对照。 ⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。 ⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 ⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。 弱阳性 如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑： ① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。 ② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。 ③ 抗体的稀释度是
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细胞技术专题：小鼠腹腔巨噬细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
小鼠腹腔巨噬细胞培可以：（1）吞噬与清除异物；（2）分泌生物活性物质；（3）对仿生全降解材料，降解后的无机产物与生命过程中有机物的合成作用。 实验方法 细胞培养技术 实验方法原理 取小鼠腹腔巨噬细胞与乳胶颗粒在不同培养条件下混合后定量加入24孔板，37 ℃，5% CO2 培养箱中孵育后，荧光显微镜下计数吞噬百分率和吞噬指数。 实验材料 小鼠 试剂、试剂盒 1640 培养基 小牛血清 双抗 台盼兰 仪器、耗材 手术器械 一次性注射器 眼科镊 眼科剪 96 孔板 CO2培养箱 实验步骤 一、实验步骤 1. 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。 2. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2 分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。 3. 用注射器抽取5mL 含双抗的RPMI 1640 培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。 4. 1000 rpm 离心5 min 后，用含双抗的RPMI 1640 培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10% 小牛血清的RPMI 1640 培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。 5. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96 孔板中，每孔100-200 µL；如 果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到 24 孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h 后， 换液，并用RPMI 1640 培养基洗1-2 次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。二、结果 巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时
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细胞技术专题：细胞生长曲线实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
标签： 细胞 生长曲线 细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，是判定细胞活力的重要指标。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。 实验方法 细胞生长曲线 实验方法原理 细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。 实验材料 细胞 试剂、试剂盒 D-Hanks液 牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶 仪器、耗材 净化工作台 离心机 恒温水浴箱 冰箱 倒置相差显微镜 培养箱 吸管 培养瓶 吸头 枪头 24培养板 胶塞 微量加样枪 红血球计数板 实验步骤 1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。 2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。 3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5 d 常要给未计数的细胞换液。 4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。 展开 注意事项 1. 细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。 2. 现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。 3. 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。 4. 在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时
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细胞技术专题：补体介导的细胞毒试验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
1、实验原理 带有特异抗原的靶细胞（如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞）与相应抗体结合后，在补体的参与下，引起靶细胞膜损伤，导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。染料（例如：伊红-Y、台盼蓝）可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色，故可用于指示死细胞或濒死细胞，而活细胞不着色。此即补体依赖性细胞毒试验，利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原，亦可鉴定抗体的特异性。 本实验中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T细胞特异的表面抗原，在体外利用抗小鼠Thy-1的单克隆抗体通过补体的协同作用，可杀伤95％以上的胸腺细胞。 2、实验材料 （1）解剖器械(眼科剪、眼科镊)、平皿、80～100目不锈钢网； （2）试管、lml吸量管、尖吸管； （3）载玻片、盖玻片； （4）C57BL／6J小鼠； （5）含5％NBS的冷Hank’s液； （6）抗小鼠Thy-1的单克隆抗体（最适稀释度，本室制备）； （7）补体(豚鼠新鲜血清并经小鼠胸腺细胞吸收，预先测定效价并稀释为最佳稀释度)； （8）1%伊红-Y染液。 3、实验方法 （1）小鼠胸腺细胞悬液的制备：将4～6周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死，取出胸腺放入已加入约4ml冷Hank’s液的平皿中，在100目的不锈钢网上研磨后，过筛，放入试管，离心1000rpm，5分钟，用Hank’s液洗两次。将沉淀的细胞重悬于Hank’s液中，配成1×107／ml细胞悬液。 （2）取试管3支，标明顺序，依据下表依次加入1×107/ml胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1的单克隆抗体(最适稀释度)及Hank’s液，放入37℃水浴30分钟。 实验材料 试验管 补体对照管 细胞对照管 1×107/ml胸腺细胞悬液 0.1ml 0.1ml 0.1ml Thy-1单克隆抗体 0.1ml —— —— Hank’s液 —— 0.1ml 0.2ml 1：3补体 0.1ml 0.1ml —— （3）取出后每管加入1%伊红-Y染液1滴，混匀，室温放置2分钟。 （4）重新混匀后分别在一张载玻片上滴片，加盖玻片镜检。先在低倍镜下观察，再用高倍镜观察，比较3管中细胞死活情况。 4、实验结果 死细胞呈红色，无光泽且肿胀变大；活细胞不着色、有光泽且形态正常
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