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肝脏细胞RNA的提取操作方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一．原理 RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组 学科研技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制，已成为分子生物学研究的一个重要手段。对某一生物或组织进行性状研究，首先要获得该性状基因，从组织细胞中分离完整的RNA对于分子克隆 和基因表达分析等实验是至关重要的，如Northern印迹及杂交分析、cDNA合成等实验的成效在很大程度上取决于RNA的质量。利用提取的RNA人们可以对特定的基因表达进行定量的检测，从分子水平精确的了解细胞生命活动的规律。通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5μgRNA ，其中80%～85%为rRNA（主要是28S、18 S和5.8 S、5S四种类型）；10%～15%为tRNA和核内小分子RNA。 这些高峰度的RNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。相反，占RNA总量1%～5%的为mRNA 。mRNA 虽然大小和核苷酸序列各不相同，从数百至数千碱基不等，但大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)组成的尾，其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸―纤维素[oligo(dT)] ，使得mRNA可以利用亲和层析法分离。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。研究表明RNA极不稳定，易于降解，而RNA酶几乎无处不在，且特别稳定，故在提取RNA时关键因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力，因此，创造一个无RNA酶的环境，严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。 对内源性RNA酶，主要运用RNA酶抑制剂，目前常用的RNA酶抑制剂有： ①RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin)，它是从人胎盘分离的一种蛋白质，可以与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的复合物，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白质抑制剂制品经数次冻融后或放在氧化条件下应弃之不用。RNA酶的蛋白质抑制剂不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译； ②氧钒核糖核苷复合物，它是由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态似物，它能与多种RNA酶
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RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、实验目的 掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 二、实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 三、实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 四、实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。 （2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。 RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。 操作： （1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 （2） 配制琼脂糖凝胶。 ①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 ②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。 ③灌制琼脂糖凝胶。 （3） 样品准备： ① 取 DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 1
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RNAi实验原理与方法选择
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、RNAi的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. 二、如何进行RNAi试验 (一)siRNA的设计 1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选： http://www.genesil.com/business/products/order2.htm http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 2.RNAi目标序列的选取原则： (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复
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RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法(3)
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
第三节 植物病毒RNA 提取 大多植物病毒RNA 为单链RNA ，并且其极性与mRNA 极性相同，植物病毒RNA 提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。 一、材料 提纯TMV病毒液（10mg/ml）。 二、设备 冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。 三、试剂 TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA 酶的双菌水。 四、操作步骤 1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。 2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。 3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。 4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。 5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。 6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。 7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。 [注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。 2、由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提 cDNA合成技术 Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括： 20μg 特异性引物 200μl M-MLV第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl; 15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L) 2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制
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血RNA快速提取的操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
操作步骤： 提示： （1） 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇！ （2） 使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。 （3） 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μlβ-巯基乙醇。此裂解液**现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。 1. 在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（
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多糖多酚植物RNA快速提取的方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
操作步骤： 提示： （1） 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇! （2） 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液**现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。 1. 直接研磨法（推荐）: a. 新鲜植物组织称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵）， 加入10体积（1ml）RLT(请确定已加入β-巯基乙醇)和1体积（100μl） PLANTaid 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。 b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13，000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，取450μl裂解物上清转到一个新离心管。 c. 加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 d. 立刻接操作步骤项下3。 2. 液氮研磨法: a. 取500μl裂解液RLT(已经加入β-巯基乙醇)，转入1.5ml离心管中，加入50μl PLANTaid混匀备用。 b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管, 立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。 在56℃温育1-3分钟有助于裂解植物,但是淀粉含量高的植物不能温育,因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。 c. 用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。 d. 将裂解物13，000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid, 将所有裂解物上清转到一个新离心管。 e. 较精确估计裂解物(上清)体积,加入0.5体积的无水乙醇,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 f. 立刻接操作步骤项下3。 3. 将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，弃掉废液。
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真菌菌丝的总RNA的提取的操作方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
试剂： RNA提取缓冲液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置），25mM EDTA, 0.5g/L 亚精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。 SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8.0，1.0 mM EDTA 10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。 3M NaAc 氯仿:异戊醇（24:1） 酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1） DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌 无水乙醇 70%酒精 方法 1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。 2.取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀。 3. 65℃水浴3-10 min，期间混匀2-3次 4. 加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min） 5. 取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min） 6. 加入1/4V体积10M LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或过夜) 7. 10,000 rpm，4℃离心20 min 8. 弃上清，用500 ulSSTE溶解沉淀 9. 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次，氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000 rpm，4℃，5 min） 10. 加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上 11. 12,000 rpm，4℃离心20 min 12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥 13. 加200 ul的DEPC处理水溶解 14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量 （在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数） 注意：提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能
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超声波细胞粉碎机基本原理及特点
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
超声波细胞粉碎机是利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而使液体中的固体颗粒或细胞组织破碎． 超声波细胞粉碎机简述 超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用能引起生物体的功能和结构发生变化，即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热（42-43℃），因为正常组织的临界致死温度为45.7℃，而肿瘤组织比正常组织敏感性高，故在此温度下肿瘤细胞的代谢发生障碍，DNA、RNA、蛋白质合成受到影响，从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡，使肿瘤出血、组织瓦解以致坏死。另外，空化泡破裂时产生瞬时高温（约5000℃）、高压（可达500×104Pa），可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。杀伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。 超声波细胞粉碎机基本原理 超声波细胞粉碎机是利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而使液体中的固体颗粒或细胞组织破碎．超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器二大部分组成。超声波发生器将市电转变成18-21KHz交变电能供给换能器。锆钛酸钡压电振子是换能器的心脏，它随交变电压以18-21KHz频率作伸缩弹性形变，换能器随之作纵向机械振动。振动波通过浸入在生物溶液中的钛合金变幅杆产生空化效应，激发介质里的生物微粒剧烈振动。 超声波细胞粉碎机
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血清中 miRNA 抽提和实验设计经验谈
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
人体内的血液循环系统犹如印度的圣河 – 恒河，河水中携带的养分滋养着古老的大地；洗涤带走地上的ㄧ切污秽，人们的一生都在河水中完成。如此的恒河可以想象，河水中充斥着各种物质，有废物有养分，只要你想都可以从河水中捞取。同样的我们的循环系统如同恒河；流动的血液如同恒河水，身体所需的ㄧ切由血液运送，身体产生的废物也由血液清运，同样可以想象血中的成份也是包罗万象。如果我们想知道大地有多纯净或污染有多严重，只要取一瓢水加以检视就可以知道答案；而相同的想了解人的生理状况，取一滴血加以检验也可以知道端倪，但是做这些检测并非漫无目标的，必须要知道哪ㄧ些物质是所谓的指针，在生物体内的这些指针就是我们熟知的生物标记(biomarker)。生物标记的研究和应用已有ㄧ段光景，各项代谢疾病的筛检广泛的被使用，而在癌症的筛检也已经有ㄧ些不错的生物标记，例如 AFP (Alpha-fetoprotein)。顺着 microRNA (miRNA) 的发现和研究热潮，已经约有 1000 个 miRNA 被发掘表现于人体中，miRNA 调控人体内基因表现的生理功能也为人们所熟知，加上 miRNA 相对于蛋白质标志的高稳定性，伴随着检测技术的一日千里，让血液中的 miRNA 表现成为新一代寻找生物标记的标的。本文内容介绍主要是以实验室在操作血清 miRNA 的萃取和芯片实验所累积的经验，和读者分享实验上遇到的ㄧ些难题和解决的方法。 血液中 miRNA 的组成 血液中的 miRNA 到底是从何而来? 要往哪里去? 这些 miRNA 的生理功能是什么?以上这三个问题是很多研究人员关心的问题，事实上这些问题目前并没有很明确的答案，我们知道 miRNA 是内生性的短片段 RNA，长度约 17 到 23 核苷酸，miRNA 可以藉由和信息 RNA (mRNA) 结合诱导信息 RNA 的降解，进而调控信息 RNA 和相对蛋白的表现。根据一些论文的揭示1和实验室实际的操作经验显示，正常人的血液中 miRNA 的含量是极微量的，但是在病人和检体制备不佳的血液样本中却可抽取到较大量的 miRNA，根据
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真空干燥箱使用操作说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
使用操作说明书： 控制面板 2.1、VD23 控制面板 图 2 VD23 控制面板 （1）主电源开关 （2a）红色安全报警灯 （2）过热保护开关 （3）真空表 （4）气阀（进惰性气体或者空气） （7）程序控制器 RD3 （8）真空关闭阀 2.2、VD53/115 的控制面板 图 3 VD53/115 控制面板 （1）主电源开关 （2a）红色安全报警灯 （2）过热保护开关 （3）压力表 （5）气阀（进惰性气体） （6）气阀（进空气） （7）程序控制器 RD3 （8）真空关闭阀 东南科仪公司 中文仪器使用说明书 版权所有 不得翻印 违者必究 3、设备后面连接 图 4 VD 背面 （9）RS422 端口 （10）主电源线 （11）进惰性气体连接，适配器管尺寸为 8mm （12）真空连接口 （13）DIN 插座（操作 2 线）选择程控 （14）DIN 插座（操作 1 线）选择真空连接和泵 （15）测量连接口 （16）DIN 插座显示样品的温度 二、安装 1、安装环境应通风良好，温度低于 32ｏC，湿度小于 75%RH。 2、确保安真空烘箱装位置平稳，搬运时禁止抬门把手或门。 3、VD 真空干燥箱不能堆叠放置，如多台同型号真空箱摆放应之间距离最小 250mm。 4、连接正确的电源（230V±10%，50-60HZ） 。 5、连接真空泵（BINDER 的真空泵能力 1-30m３/h，抽真空可达 10ˉ２mbar） 东南科仪公司 中文仪器使用说明书 版权所有 不得翻印 违者必究 注意： 1、禁止放易燃、易爆物质到 VD 真空箱内。 2、环境温度不能超出 22ｏC 过多，否则不同的环境条件，相关指定的技术数据有偏差。 过高的环境温度可能导致 VD 真空箱内温度波动。 三、参数设置 图 5 程度控制 RD3 1、温度控制器 电源开关打到“1”处，显示屏 1 显示实际温度（室温） ，显示屏 2 显示设置温度。加热时， 加热指示灯亮，当到达设置温度时，加热指示灯灭。 2、温度设置 1、按 2、通过 3、按 4、通过 5、按 键一次 设置温度为 30℃ 键确认 设置开关状态为 000 键确认 6、调整安全控制器至适宜位置 7、加热灯亮，仪器开始加热至设置温度，然后进入保温状态 注意： 1、
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RNA的变性琼脂糖凝胶电泳实验原理、材料和操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、实验目的 学习RNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术。 二、实验原理 RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。 判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。 三、材料、试剂及器具 1、 材料 总RNA提取物。 2、 试剂 （1）0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 （2）10x电泳缓冲液。 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） 0.4mol/L（pH 7.0） NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L （3）50mL变性琼脂糖凝胶（1%） （4）10x电泳缓冲液 5 mL 琼脂糖 0.5 g 0.1%DEPC水 36.5 mL 加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。 （5）上样缓冲液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。 （6）甲酰胺（去离子）。 3、器具 （1）电泳系统 （2）紫外透视仪 四、操作步骤 1、 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。 2、 制胶： 称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 3、 加样： 在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：电泳缓冲液（10x）2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。 4、 电泳： 打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。 5、 电泳结束后通过紫外透视仪观察。 五、注意事项 本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。
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Northern blot实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。 实验方法 Northern blot技术 Northern Blot 实验方法原理 Northern blot的基本概述是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移至尼龙膜等固相膜载体上，用放射性或非放射性标记DNA或RNA特异性探针对固定于固相膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除非特异性结合杂交信号，经放射自显影或现色反应，对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小；对杂交信号的强弱比较，可以知晓该基因表达mRNA水平的强弱。 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 一、RNA转移与固定 1. 变性琼脂糖电泳分离总RNA样品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝胶片刻，10×SSC中浸泡平衡凝胶30 min。 2. 按southern blot实验中DNA转移方法及装置转移总RNA至尼龙膜上（过程中注意无RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干，夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。 4. RNA染色，干燥的尼龙膜先于5%冰乙酸中室温浸泡15 min。5. 于0.5 mol/L 乙酸钠和0.04%亚甲蓝溶液中浸泡5~10 min。6. 去离子水淋洗膜5~10 min，可见RNA标准及28s及18 sRNA的条带，软铅笔标记。 二、预杂交、杂交及显色 1. Washing buffer润洗1遍（3~5 min）。 2. 100 ml blocking buffer工作液封闭30 min。 3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。 4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。 5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。 6. 将尼龙膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光数min至1天（出现颜色时不
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细胞质RNA提取实验操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。 实验方法 基本方案 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 1. 对于单层培奍细胞（1）每10 cm 培养皿培养的细胞，用冰冷PBS洗涤3次。（2）每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞，转移至冰浴的离心管中。（3）300 g 离心5 min，弃上清，继续冰浴。 2. 对于悬浮培养细胞（1）300 g 离心5 min，弃上请。（2）细胞以1/2原体积的冰冷重悬，再离心后弃上清。 3. 重悬细胞于375 μl 冰冷的细胞裂解缓冲液，并置冰浴5 min。4. 于4℃在微量离心机中离心2 min，将上清移至一个洁净的已加有5 μl 20%SDS的管中，立即在旋涡混合器上振荡。 5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K，37℃温育15 min。 6. 加入400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提，在旋涡混合器上振荡用微量离心机离心，上清移至干净的离心管中，重复抽提1遍。7. 再以400 μl 氯仿/异戊醇抽棰，上层水相转移至干净的离心管中。8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸钠缓冲液（pH7.5），再加无水乙醇，混匀后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃过夜。 9. 用微量离心机4℃离心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸钠（pH5.2）冼涤沉淀。10. 干燥后用100 μl 处理过的水重溶沉淀，取10 μl RNA稀释于1 ml 水中，测A280和A260，其与的RNA可在-70℃贮存。
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核糖核酸酶保护分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、体外转录 在无菌1.5 ml 微型离心管中，结合以下内容： 4 ul 5倍转录缓冲液 2 ul 0.1 M DTT 4 ul 2.5 MM NTP（A，C，G） 0.8 ul RNA酶抑制剂（25 U/ul）RNA酶抑制剂（Promega）中 100 UM冷UTP 1 ul/ug UL线性DNA模板 5 ul 10 UCI / UL P32 UTP（800Ci/mmol） 1 ul RNA聚合酶SP6，T7或T3 总体积〜20 ul。 孵育1小时，37℃。 2 ul 每个转录的DNA酶I，孵育20分钟， 37℃。 二、探头净化 净化探头使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除试剂盒或Boehringer离心柱（G50葡聚糖凝胶）。检查1 ul 在闪烁计数器，P32通道。一个很好的探头将5×105~1×106 CPM。 三、杂交 打开heatblock到95C。对于在水或乙醇中的样品，干燥适当的RNA量，并包括一个管与1 ul tRNA或糖原（Sigma公司），这是作为阴性对照。 每个样品应具有以下： 24 ul 甲酰胺 2 ul 0.6 M管 2.4 ul 5 M氯化钠 0.3 ul 0.1 M EDTA 2×105 cpm探针 5×104 cpm加载控制探针 DEPC水 总体积30ul 以及混合样品。加热95℃，10分钟。孵育4小时， 55°C。 四、RNase消化 核糖核酸酶消化缓冲液： 300 MM 醋酸钠 10 mM 的TRIS 5 mM EDTA 每个样品添加350 ul 消化缓冲液。 1 ul 4 mg/ml 核糖核酸酶A和0.4 ul 10 u/ul 核糖核酸酶T1。 孵育，30℃，45分钟至1小时。 五、蛋白酶K 向每个样品中添加20%SDS和2.5 ul 的10 mg/ml 的蛋白酶K孵育，37℃ 10 μl 的15-20分钟。 六：清理 提取一次400 ul 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 将上清转移到新的试管中。加入1000 ul 的100%乙醇和1 μl 为10 mg/ml 的糖原。拌匀。 在-70℃，30分钟或在干冰/ ETOH浴中10分钟孵育样品。 旋转的离心15分钟。吸EtOH。让小球在空气中晾干。 重悬在8 ul 甲酰胺的装载染料。允许坐在RT 5-10分钟，经常搅拌。 七：聚凝胶电泳分析 热样品5分钟，100℃。加载到5%polyacrylamide/7 M尿素变性凝胶2000 cpm 的分子量标记物。运行凝胶38-42mA。干凝胶，暴露于膜O / N在-70C增感屏。
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实验鼠的生理数据介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
小鼠 体温38(37～39)℃，呼吸频率163(84～230)次/分，心跳频率625(470～780)次/分，耗氧量1530mm2/g活体重，通气量24(11～36)ml/分，潮气量0.15(0.09～0.23)ml，收缩压113(95～125)mmHg、舒张压81(67～90)mmHg，红细胞总数9.3(7.7～12.5)百万/mm3，血红蛋白14.8(10～19)g/100ml，白细胞总数8.0(6～12)千/mm3，总蛋白4.8(4.2～5.5)g。 大鼠 体温：39(38.5～39.5)℃，心跳频率475(370～580)次/分，呼吸频率85.5(66～114)次/分，通气量7.3(5-10.1)ml/分，潮气量0.86(0.6～1.25)ml，耗氧量2000mm3/g体重，麻醉时收缩压116(88～138)mmHg红细胞总数8.9(7.2～9.6)百万mm3,血红蛋白14.8(12～17.5)g/100ml血，白细胞总数：5000～15000/mm3,血小板10～30万/mm3，血容量占体重的7.4%，红细胞比重1.090,总蛋白7.2(6.9～7.6)g。 豚鼠 正常体温38.6(37.8～39.5)℃，心跳频率280(200～360)次/分，呼吸频率90(69～104)次/分，潮气量1.8(1.0～3.9)ml，通气率16ml(10～28)/分，耗氧量816mm3/g活体重，血压75-120mmHg，红细胞总数5.6(4.5～7.0)百万/(mm3)，血红蛋白14.4(11～16.5)g/100ml血，白细胞总数5000～6000mm3,血小板11.6万/mm3，血浆总蛋白5.4(5.0～5.6)g，血容量占体重的6.4%，染色体32对，寿命5～7年。 金地鼠 心率为400次/分，呼吸频率73.6(33～127)次/分，呼吸量60(33.3～82.8)ml/分，在20～21℃血液量为体重的5%，寿命为的条件下，每小时每克体重要消耗氧2.3ml。颈动脉血压，8～12周龄时为78.7～101.3mmHg，12～17月龄为64.3～88.3mmgHg，17～24月龄为65.5～92.5mmHg，24月龄以上为62.0～91.8mmHg，红细胞总数5.9～8.3百万/mm3，血红蛋白14.85～16.20g/100ml血，白细胞总数7.200～8.480／mm3，成年地鼠2.5～3.0年。
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