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新型蛋白质支架DNA四分体引发交联杂交链反应(cHCR)的核酸递送和miRNA超灵敏成像
发布时间:2021-05-06     作者:wyf   分享到:

新型蛋白质支架DNA四分体引发交联杂交链反应(cHCR)的核酸递送和miRNA超灵敏成像

实现细胞内核酸的有效递送来进行灵敏检测和基因调控在生物化学上是极为重要的。DNA/RNA纳米结构是细胞内核酸递送的有效工具,比如球形核酸(SNAs)和自组装核酸纳米结构等,已经证明这些核酸纳米结构可以在没有阳离子载体的帮助下进入到细胞中,这为药物治疗、基因调控等提供了一个强有力的平台。但是,DNA/RNA纳米结构的简便合成和纯化、核酸的高效递送以及胞内检测灵敏度等方面仍存在重大的挑战。

开发了一种新型蛋白质支架DNA四分体,该DNA四分体由链霉抗生物素蛋白(SA)和四个生物素化的发夹DNA探针构建。目前已报道的纳米结构在其表面上修饰有致密的DNA探针,可能会因为高位阻而抑制核酸的扩增,而DNA四分体上仅修饰四个DNA探针,结构相对松散,有利于引发交联杂交链反应(cHCR)从而进行有效的核酸递送和miRNA超灵敏成像。

图文解析

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方案1(A) DNA四分体引发cHCR(B)细胞内miRNA超灵敏成像示意图。分别在SA上合成Cy3标记的H1Cy5标记的H2DNA四分体,在目标miRNA存在情况下,H1被打开与H2发生HCR形成3D交联的水凝胶网络,在cHCR产物中,Cy3荧光供体和Cy5受体距离被拉近发生FRET;在靶标miRNA不存在的情况下,H1H2之间不发生cHCR,同时也无法观察到FRET信号。

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1(A)四种SA-DNA复合物的琼脂糖凝胶(3%)电泳图像;(B)H2DNA四分体的荧光各向异性;(C)游离SADNA四分体的Zeta电位。SA是具有四个生物素结合位点的四聚体蛋白质,可以获得四种类型的SA-DNA复合物(SADNA比例分别为111:21:31:4),从图中可以得出,不同浓度比的DNASA得到分子量不同的四个条带(A),说明形成了四种不同的复合物,荧光各向异性分析和zeta电位分析同时也验证了DNA探针与SA之间的相互作用(BC)

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2 (A)L-02细胞与SA-Cy3孵育;(B)与修饰有H4SA-Cy3DNA四分体孵育;(C)与修饰有H2-Cy5SADNA四分体孵育;(D-F)与修饰H2-Cy5SA-Cy3 DNA四分体孵育,Cy3通道、Cy5通道以及merge荧光图像。从图中可以得出,DNA四分体能够在没有转染试剂的帮助下进入细胞,并且DNA四分体能在细胞中保持结构完整。

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3(A)载有H2DNA四分体与HeLa细胞孵育不同时间的流式细胞术分析;(B)不同浓度载有H2DNA四分体与HeLa细胞孵育的流式细胞术分析;(C)不同孵育时间的载有H2DNA四分体的亚细胞定位成像。如图所示,在15min内能观察到基本的荧光峰值,45min左右达到饱和,说明DNA四分体的有效递送(3A);荧光强度随DNA四分体浓度的增加而增加(3B);从亚细胞定位成像结果可以看出,孵育时间从15min增加到60minCy5荧光逐渐增加并从溶酶体扩散到细胞质中(3C);这些结果表明DNA四分体是有效的核酸递送平台,同时具有较高的溶酶体逃逸效率。

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4(A) DNA四分体的荧光光谱图;(B)cHCR产物的凝胶电泳图像,Lane1DNA markerLane2H1H2Lane3 靶标RNAH1H2Lane4 载有H1H2探针的DNA四分体;Lane5 靶标RNA以及载有H1H2探针的DNA四分体;(C)DNA四分体的AFM图像;(D)cHCR产物的AFM图像;(E) DNA四分体对不同浓度靶标RNA的荧光光谱响应;(F)基于DNA四分体的cHCR的选择性验证。以上结果证明,cHCR生成了交联的水凝胶,该方法有较好的灵敏度其检测限约为6pM,同时也具有极佳的选择性,说明该设计可以用于复杂生物系统中miRNA的灵敏成像。

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5 HeLa细胞的活细胞成像(A)载有H1H2DNA四分体;(B)300nM miR-21抑制剂;(C)300nM miR-21模拟物。图A观察到明显的红色和绿色荧光,表明miR-21引发cHCR并产生FRET信号;图B显示出微弱的红色荧光和较强的绿色荧光,进一步验证了荧光反应的特异性;图C观察到比未处理的HeLa细胞更强的红色荧光和更弱的绿色荧光。以上结果表明荧光强度与miR-21的浓度动态相关。

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6 不同细胞系中miR-21表达水平的定量研究,基于DNA四分体的cHCRL-02HeLaHepG2细胞进行荧光成像。从图中可以得出,miR-21HepG2细胞中高表,在L-02细胞中低表,这与之前报道miR-21在这些细胞中的表达水平一致,证明基于cHCR的方法能定量测量活细胞中的miRNA

DNA纳米结构构建可原位实现HCR放大并进行有效核酸递送和超灵敏miRNA成像的简便平台。该DNA四分体具有易合成和纯化等优点,能精确控制探针的结构和浓度,同时能快速进行核酸递送并从溶酶体中逃逸,充分说明该DNA四分体是高度稳健的递送剂。cHCR扩增生成水凝胶,能特异性靶向miRNA,从而实现在活细胞中的超灵敏成像。此外,基于FRET的信号激活模式提高了检测精度。因此,该DNA四分体可以为核酸递送、低丰度生物标志物成像和相关的诊断治疗提供有效地平台。

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