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蛋白酶 WSS1A/核酸内切酶MUS81和磷酸二酯酶TDP1的特异性修复蛋白酶能酶解部分交联的蛋白质
发布时间:2021-03-29     作者:wyf   分享到:

蛋白酶 WSS1A/核酸内切酶MUS81和磷酸二酯酶TDP1的特异性修复蛋白酶能酶解部分交联的蛋白质

DNA经常暴露于各种破坏性环境中,这对于保证基因组完整性是个巨大的挑战。长期的DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslink, DPC)是DNA分子的一种严重损伤,会导致复制叉停滞,抑制复制,正常细胞分裂被阻断,导致细胞死亡。

 

DPC可细分为酶促和非酶促两种类型。外源性和内源性原因都可能引起这两种类型的DPC。酶促反应DPC产生的中间体可以是自发的抑或是由酶毒剂例如喜树碱(camptothecin, CPT)所造成。CPT能够稳定拓扑异构酶Itopoisomerase I, TopI)与DNA的结合,使断裂的DNA链不能重新接合,DNA双螺旋从扭转张力中松弛,从而选择性抑制拓扑异构酶I的活性,阻止DNA复制及RNA合成。

因此,这些酶促反应中间体也被称为稳定的拓扑异构酶I剪切复合物(topoisomerase I cleavage complexes, TOPIcc)。非酶促 DPC 由内源产生活性醛(如代谢过程中产生的乙醛或组蛋白去甲基化过程中形成的甲醛)造成,或通过电离辐射、紫外线辐射、化学交联剂(顺铂)诱导产生。尽管DPC阻断DNA复制,对基因组完整性造成严重威胁;然而,直到较近才在人类和酵母中发现了DPC修复的主要机制。

 

报道了蛋白酶 WSS1A,核酸内切酶MUS81和磷酸二酯酶 TDP1 参与植物 DPC 修复的独立途径的相关研究工作。

前人的研究工作发现 Wss1(酵母金属蛋白酶,与SUMO途径相关)是参与 DPC 修复的关键蛋白。缺失 Wss1 的细胞对甲醛尤其敏感。哺乳动物蛋白SPRTN(又称DVC1)含有与 Wss1 相同锌金属蛋白酶结构域,被认为与 Wss1 同属于修复蛋白酶家族。在人、小鼠、哺乳动物细胞系中 SPRTN 缺失或多或少造成基因组不稳定,人类基因组中若含有 SPRTN 突变则会造成一种名为 “Ruijs-Aalfs syndrome” 的遗传疾病,引发提前衰老及癌症,表明 SPRTN 对于 DPC 修复是必需的。

 

除了 Wss1/SPRTN 组成的特异性修复蛋白酶能酶解部分交联的蛋白质,其他酶活性蛋白也能修复特异 DNA-蛋白质加合物。如酪氨酰-DNA 磷酸二酯酶ITyrosyl-DNA phosphodiesterase I, TDPI)直接水解酪氨酰-DNA 磷酸二酯键。该酶能特异性水解 DNA 3'磷酸和拓扑异构酶I酪氨酰活性残基,属于磷脂酶D超家族。缺失wss1/ tdp1 的酵母菌株对 CPT 尤其敏感。

 

除了修复蛋白酶的酶解作用和交联水解之外,DPC修复还可通过DNA核酸内切酶作用加工。MUS81MMS AND UV SENSITIVE PROTEIN 81)基因先在酵母菌中被发现,由于甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate, MMS)和UV射线导致DNA损伤而诱导该基因表达而被人们所认识,MUS81复合物构成一个结构特殊的核酸内切酶,能够剪切分叉DNA结构,特别是停滞的复制叉,是帮助同源重组中间体比如Holliday junction(霍利迪连结体,一种减数分裂和同源DNA 修复中形成的四链DNA中间体)正常解聚所必须的蛋白,在DNA重组修复中起极重要的作用。遗传学分析说明,MUS81在紫外线损伤的抗性途径中发挥作用,表现出对非酶促DPC诱导剂的敏感性 。

 

系统学分析表明,植物具有两种Wss1的直系同源基因(orthologue),WSS1A WSS1B,两者都在N末端有类泛素化(UBL)结构域,在系统树上皆属于UBL-Wss1分支【4】。本文不仅鉴定了 WSS1A WSS1B 在拟南芥 DPC 修复中的作用,而且还分析了它们与 TDP1 MUS81 相关的作用,表明植物确实具有三种不同的 DPC 修复途径。

 

先,研究者通过 CRISPR/Cas 系统构建了拟南芥 WSS1A WSS1B 缺失功能突变体。通过对突变体的遗传实验分析和 DPC 诱导剂实验分析,发现只有 wss1A 突变体表现出了生长缺陷。DPC 诱导剂 CPT 的处理实验也表明,只有 wss1A 突变体对 CPT 敏感,进一步的实验则构建了 wss1A wss1B 双突变体,发现其表型与 wss1A 单突并无差异,说明只有 WSS1A 对于拟南芥中的 DPC 修复是必需的。

 

研究人员进一步探索了 TDP 与同源重组所引发的DPC的修复作用。研究者使用三种 tdp1 突变株系,tdp1-2SALK119060),T-DNA 插入在8号外显子中,除了 T-DNA 突变体系外,还使用了两个 CRISPR/Cas9 技术构建的突变株系 tdp1-3 tdp1-45】。发现这三个突变体表型与野生型无异,对CPT的敏感性也与野生型无异。有趣的是,tdp1 单突变体 CPT 不敏感, wss1A tdp1 双突变体显示出比 wss1A 单突变体更高的灵敏度,说明 TDP1 WSS1 所在的 DPC 修复途径是互相独立的,WSS1 所参与的是一个起了主要作用的修复通路,而 TDP1 所在的修复通路可能是一个次要的备用路径。

 

通过构建 wss1A mus81 tdp1 mus81 双突变体对比各自的单突变体和野生型,发现mus81-1 单突变体与野生型生长状况并无区别,而wss1A mus8-1 则表现出了比 wss1A 更强烈的突变表型。有趣的是,CPT 处理后, mus81 表现出了比 wss1A 更强烈的表型,双突变体则呈现了强烈的叠加效应。还检测了 tdp1-4 mus81-1 CPT处理的表型差异,发现从植物整体上看,tdp1-4  与野生型并无差异,tdp1-4 mus81-1 双突变与 mus81-1 类似,但是如果从根分生组织中死细胞增加的水平上看(该表型比植株整体表型对诱导剂处理更敏感),两者还是存在了细微的差别,tdp1-4 mus81-1 双突变比 mus81-1 死细胞数增多,更为敏感,这说明MUS81 TDP1 DPC 修复中叶处于平行的通路,且 MUS81 的作用更为主要。

 

通过植株正常表型以及在 CPT 处理后表现出生长缺陷和根分生组织中死细胞增加的事实表明在拟南芥中存在三种独立的DPC修复途径,DNA 核酸内切酶 MUS81 和蛋白酶 WSS1A 为主要参与者,磷酸二酯酶 TDP1 作为备用。

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