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中性粒细胞弹性蛋白酶激活CdSe/ZnS量子点荧光共振能量转移荧光探针
发布时间:2021-03-26     作者:zzj   分享到:

中性粒细胞嗜天青颗粒的主要成分,人类中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)参与病原体的破坏和呼吸道的炎症过程调节,还可以切割气管的细胞外基质成分,并促进中性粒细胞向炎症部位迁移,而炎症部位与常见的肺部疾病高度相关。因此,HNE被认为是药物发现的治疗靶标,也是多种肺部疾病的生物标志物。鉴于其光化学和光物理特性以及可调节的发射范围,基于量子点的荧光策略可以改善传感性能,此类成像探针已被用于酶测定。荧光共振能量转移(FRET)通常发生在两个距离适当的荧光团之间(<10 nm),但是用于监测体内蛋白酶活性仍然存在FRET的变化并不明显、荧光传感特性不足等缺陷。将有机染料与量子点整合到肽底物中可以提供一种可控且可扩展的策略用于构建检测蛋白酶的FRET系统。

通过将磺基罗丹明B和羧基化的量子点组装到寡肽底物(QPMAVVQSVPQK)中,构建了基于FRET系统的纳米探针,用于肺部疾病成像。该底物在两个缬氨酸残基之间的酰胺键可被小鼠和人类的弹性蛋白酶水解,用于检测体外和体内的HNE。通过该纳米探针可以将活细胞和肺癌小鼠模型中内源性HNE进行高度灵敏和特异性的监测,并且成功地用于检测患者血清中的HNE活性。

基于FRET的肽探针通常可用于监测体内蛋白酶活性以对体内的特定靶分子进行成像。一般来说,FRET的肽探针包括三个部分:量子点作为供体,磺基罗丹明BRh)作为受体,HNE特异性肽作为连接体。在量子点表面上的羧基活化后,将两种弹性蛋白酶特异性肽QPMAVVQSVPQK-RhP1)和APEEIMAQK-RhP2)通过酰胺键整合到量子点表面,从而制备量子点-肽复合物。通过比较P1P2对量子点的淬灭效率和HNE的裂解效率,作者选择了P1来构建基于量子点的FRET探针。CdSe/ZnS量子点和InP/ZnS量子点分别与P1组装,InP/ZnS快速被磺基罗丹明B淬灭,而 CdSe/ZnS探针具有更高的FRET效率和HNE催化活性。HNE可以裂解FRET探针中两个缬氨酸之间酰胺键连接处,导致FRET系统破坏,量子点的绿色荧光恢复和Rh的红色荧光下降。

为了验证FRET探针组装过程,分别进行了动态光散射、透射电镜、Zeta电位和红外光谱测试。通过光致发光光谱研究了该探针的FRET效率和是否存在交替激发缺陷,发现FRET效率高达78.5%,并且该探针可以克服来自动物组织的干扰并用于体内成像。该FRET探针特异性和灵敏性分别采用不同的蛋白酶和不同浓度的HNE在复杂的生物样品中研究该FRET探针的特异性和灵敏性,发现该探针具有高度的特异性和低至7.15 pM的检测限。在生理条件下,通过Michaelis-Menten曲线研究了该探针作为底物的动力学特征和HNE活性及其抑制剂的能力。根据该米氏方程曲线得到的动力学参数(KmKm/kcat)分别为~142.3 nM~997 mM-1s-1。该探针的总体催化效率(Km/kcat)与商业底物几乎相同,但对该探针的亲和力比商业底物高275倍(Km)。

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HNEFRET探针和商用底物的Michaelis-Menten曲线和抑制药物浓度曲线

由于HNE促进肺肿瘤的生长,于是将FRET探针应用于肺癌细胞(A549)中的HNE成像。通过FRET探针在A549细胞中的定位,发现量子点和染料标记的肽特异性地在溶酶体中积累,这可能是A549细胞的吞噬作用和静电相互作用引起的。接下来,将FRET探针直接注入小鼠肺癌模型以研究其体内成像能力。在原发性肿瘤位置,绿色荧光逐渐增加,而红色荧光随时间延长而减弱。FRET探针的体内研究还揭示了肺部肿瘤进展与HNE水平升高之间的强烈关联。为了探究绿色荧光增强是否由于活细胞中HNE的动态变化引起的,通过蛋白质印迹分析证实了脂多糖刺激确实增加了细胞中的HNE浓度。FRET探针可以监测炎症诱导的活细胞中HNE的增加,通过脂多糖诱导的急性肺损伤研究该探针在炎症环境中的表现。通过直接检测3名健康人和13名患有不同肺部疾病(肺癌、肺结核和肺真菌病)的人血清样品中的HNE发现,患有不同肺部疾病的患者的HNE水平均显着高于健康人。通过基于FRET探针的方法检测到的HNE水平与临床诊断高度相关,该方法适用于定量测定临床样品中的HNE

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HNEFRET探针和商用底物的Michaelis-Menten曲线和抑制药物浓度曲线

通过将磺基罗丹明B和羧基官能化的量子点组装到寡肽底物(QPMAVVQSVPQK)中,构建了基于FRET系统的纳米探针用于肺部疾病成像。该研究为基于量子点的FRET系统分析酶活性提供了有价值的策略,明显提高了催化效率、灵敏度和光稳定性。由于HNE是重要的治疗靶标,该探针还可用于高通量筛选HNE抑制剂以发现药物。该策略证明了基于FRET系统的纳米探针在成像性能方面的优势,并为体内HNE检测和肺部疾病诊断提供了新的工具。

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zzj 2021.3.26




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【运输说明】:


极低温产品:极低温产品运输过程中加装干冰运输。

低温产品:低温产品运输过程中加装冰袋运输。

常温产品:常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。


【目前合作的部分科研单位】:

重庆医科大学,西南大学,第三军医大学,西南交通大学,重庆大坪医院,四川大学,华西医院,电子科技大学,哈尔滨工业大学,吉林大学,长春应化所,沈阳药科大学,中国海洋大学,北京大学,清华大学,北京理工大学,北京师范大学,北京中医药大学,中国农业大学,北京市肿瘤防治研究所,北京军事医学科学院,中国科学院动物研究所,中国科学院化学研究所,第四军医大学,西安交通大学,湖南大学,中南大学,武汉大学,武汉协和医院,华中科技大学,中山大学,广东药科大学,深圳大学,华南理工大学,中国科研学院先进技术研究院,厦门大学,福州大学,浙江大学,南京大学,南京医科大学,东南大学,中国药科大学,苏州大学,山东大学,山东师范大学,上海交通大学,华东理工大学,复旦大学,郑州大学,河南烟草局,宁夏医科大学,新疆大学,中国人民大学,中国科学院苏州纳米研究所,国家纳米科学中心,武汉病毒研究所,中国科学院过程工程研究所,江苏省原子医学研究所,中国科学院宁波材料技术与工程研究所,中国科学院上海硅酸盐研究所,中国医学科学院生物医学工程研究所等等

 

【目前合作过的药厂】:

石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,西安力邦制药有限公司,上海药明康德新药开发有限公司,安徽省国平药业有限公司,苏州亚盛药业有限公司,兆科药业(合肥)有限公司,南京绿叶制药有限公司,山东绿叶制药有限公司,大冢(上海)药物研究开发有限公司,国药集团化学试剂有限公司,长春金赛药业有限责任公司,成都苑东药业有限公司,浙江海正药业等。


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