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丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达
发布时间:2021-03-25     作者:zzj   分享到:

丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内慢性病毒性肝炎的主要病原之一,约有1.7亿人被感染,常导致严重肝病,包括肝硬化和肝细胞癌(HCC) 1HCV的基因组含有一个长的开放阅读框架( ORF),编码一个约3 010个氨基酸残基( aa)组成的多蛋门,该多蛋白被细胞和病毒蛋白酶切割产生至少10个病毒基因产物:核心蛋自( core:).E1 E2 p7, NS2 , NS3 , NS4A,NS4B , NS5ANS5B蛋白等2F蛋门是 HCV基因组[ RNA 的核心蛋白编码序列表达了117 kD的蛋白。关于其功能研究较少。我们利用抑制性消减杂交( suppression sub-tractive hybridization , SSH)技术,对于表达HCV F载体转染的HepG2细胞进行研究,阐明了F蛋白反式激活的部分靶基因,同时我们结合生物信息学( bioinformat-ics)技术克隆了F蛋白反式激活的新型靶基因,即丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)基因。为了进一步研究此蛋白与人体细胞的相互作用,我们在酵母细胞中表达了HCV FTP2基因。

材料与方法

.材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌DH5 α,c-myc单克隆抗体,ATCC1-9E10.2杂交瘤产生。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgC。酵母细胞AH109、载体. pC-BKT7及酵母YPD培养基、SD/ - Trp- Leu等培养基。Taq DNA聚合酶。T4 DNA 连接E,EcoRIBamHI 。内烯既胺.NN'-亚华双山烯酰胺.异丙基硫代-j-D-半乳糖(1PTG)X-3-GalpGEM-T载体。TEVED 。醋酸肛.半硫酸腺苷。

.HCV FTP2基因的扩增

根据电子拼接的基树序列,在编码区的土游和下游分别设计合成一对寡聚核苷酸引物(PI5'-GAA TTCATG GCA GGT CCA GAA AGT-3`P2 5 '-GGA TCC TTATGT TGC TTT CACAGC-3 '.在引物的两端引人了 EcoRIBamHI随切位点,引物由上海生工公司合成。在0.5 mLEppendorf 管中依次加入17.3 pL双蒸水.2.5;L10×缓冲液(20 mmol·L.' MgCl, ) .2 pl 2.5mmol-1.'dVTP. 1 ,.l 10 ;.mmol ·I. ' P1 , l ,l 10 pimmol ·L-' P2. 1 ,ul cDNA模板.0.2;l Taxq DNA聚合酶(5× 105U·L-'),放入PE9600 PCR役中扩增。扩增条件:94℃变性35 s,58℃退火35 s.72℃延伸 45 s,循环35次后,72℃保温10 min20 g·l.'琼指糖凝胶电泳鉴定扩增结果,

.pGBKT7-HCV FTP2的构建与鉴定

将经玻璃奶回收、粉/瓢仿抽提.乙醇沉淀的上述PCR反应产物与pGEM-T载体按3:l mol./L.混合,16℃用 TDNA连接商连接过夜,随后转化入用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态细抱.在铺有IPTG;5--4-3呜噪-3-D-半乳糖干(X-3-Gal)的氨苄西林琼脂糖平板上进行蓝白菌落筛选,挑取自色菌落用碱裂解法提取质粒DNA进行梅切鉴定及测序,证明 HCVFTP2基因已被克隆进T载体。该质粒及pGBKT7;均用 EcoRIBamH两切,T载体上释放的HCV FTP2基因用上述相同的方法连接到pGBKT7载体中,转化后接种于卡那霉素平板上,随机挑收平板上生长的菌落,碱裂解法抽提质粒DNA,双醇切及PCR 鉴定。

四、HCV FTP2在酵母细胞中表达

转化酵母细览AH09并长达州醋酸法转化,转化后铺板于SD/-Trp进行筛选。挑取2 mm 3 mm大小的菌落过夜培养后、提取存母蛋自质。表达产物的十二烷基奭酸钠聚丙烯-酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)!Westernblot免疫印迹分析均按常规方法进行。由于在酵母表达载体pGBKT7的多克隆位点前带有人c-myc的标签,我们所表达的融合蛋白亦带此标签,因此用抗人c-mye单克隆抗体与之进行免疫反应。

实验结果

一、载体构建

HCV FTP2基因的扩增和lpGBKT7-HCV FTP2重组质粒的构建(1)

image.png

IpGBK17-HCV FTP2质粒图

二、pGBKT7-HCV FTP2质粒酶切鉴定

利用自行设计的引物Pl/P2成功扩增出 HCVFTP2基闪片段,PCR产物经20 g.1~'琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约177 bp,预期片段符合,且无非特异扩增现象。用PCR扩增HCV FTP2基因测序结果显示序列王确。用双酶切所得片段,连接到用相同的EcoRIBamHl 所切的pGBKT7中经酶切鉴定所获结果正确(2)

 

image.png

2pGBKT7-HCV FTP2 EcoRI BamHI 酶切鉴定

由此表明HCV FTP2基因已正确克隆人熊母表达载体 pGBKT7 , pGBKT7-HCV FTP2质粒构建成功。

三、pGBKT7-HCV FTP2质粒转化酵母AH109

用醋梭锂法转化能母后在SD/-Trp培养基上筛选生长。山于AH109株为色氨酸营养缺陷,质粒pG-BKT7中带有色氨酸基因,转化成功的AH109可以在缺少色氨酸的培养基上生长。培养数天后,挑取一菌落进行PCR扩增HCV FTP2基因。结果显示转化成功(3)

四、表达产物的SDS-PAGEWestern免疫印迹分析

提取未转化质粒与j转化了质粒的辞母蛋自质,进行SDS-PAGElWesternblot统绞印迹分析结果(43结果显示对照无表达而转化了pGK77-HCV FTP2的酵f母蛋白提取物Western blut印迹分析可见明显条带且无杂带。

image.png

3pGBK17-HCV FTP2菌落进行PCR鉴定

image.png

4HCV FTP2 Western blotting分析1道是HV FTP2蛋白.2道是阳性对照转化PCBKT7空载体,3未转化质粒

F蛋白是一个新鉴定的HCV{国产物 3-5。编码F蛋白的开放阅读框与核心蛋门的编码序列重叠,是翻译过程中核糖体阅读框发生-2/!位漂移产生的,与核心蛋自具有相同的N-端序列。下蛋白与核心蛋白.NS5A相似,亚细胞定位于内质网5-91,但显示比核心蛋白有更多的序列差异性,核心蛋自的突变导致患者逃避宿主免疫反应,可能触发了细胞的恶性转化。核心蛋门的某些功能是否是F蛋白的作用,F蛋白是否调控HCV RVA的复制,是否参与病海的形态形成及在病毒生命周期中调节细胞功能是否发挥重要作用、尚不清楚。为进一步研究f蛋自的功能,明确F蛋白

在丙型肝炎发病机制中的作用,我们构建酵母双杂交表达载体并在熊母细胞中表达了HCV FTP2基因。

辞母是一种低等真核生物,与原核细胞相比在翻译加工方面其有明显的优点,例如蛋白质中二硫键的精确形成.糖基化,磷酸化.寡聚体的形成等。另外,他比哺乳动物细胞操作简便,容易培养,因此酵母细胞作为一种真核基因的表达系统有着良好的前景。我们为了研究HCV FTP2的作用,克隆了HCV FTP2基因,HCV FTP2基因在酵母表达载体pGBKT7中与c-myc标签基因片段及DVA结合域(GAlA:.1s7,氨基酸基因)基国在酵母表达载体中融合成功并且表达,Westernblot免疫印迹分析时用其标签单克隆抗体检测到大小符合融合蛋自大小的蛋白质.说明HCV FTP2融合蛋白在酵母中表达成功。表达产物存在于酵母细胞内。随着基因组计划的完成,以后的研究进入了后基因组和蛋自质组阶段, pGBK17 - HCN FTP2酵母双杂交融合蛋白“饵”表达系统的建立,为研究HCV FTP2与细胞内蛋自的相互作用奠定了基础,对深入了解HCVFTP2的结构与功能以及在人体中对宿主细胞的作用提供帮助。

 

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【公司简介】:

德尔塔(Delta) 是西安齐岳生物科技有限公司旗下品牌,德尔塔(Delta) 目前经营的产品主要有合成磷脂,PEG衍生物,嵌段共聚物,纳米金,磁性纳米颗粒,介孔二氧化硅,活性荧光染料,荧光量子点,点击化学和大环配体等等,这些产品在国内给数百家高校实验室和数十家中科研研究所及药厂长期供应,德尔塔(Delta) 成立之初以代理国外进口品牌的为主,产品主要涉及磷脂、PEG衍生物等产品,随着公司的发展和扩大,公司更注重自主品牌的建立和高附加值的高端产品研发并且注册了自己品牌商标,在未来3-5年公司预计将建立一个综合型的大型实验室,该实验室不仅提供全方面的纳米靶向药物科研产品及定制外包服务,还将承接其他研究领域的科研产品和定制外包服务,预计该实验室还将与国内数十家大型药厂进行前期药物研发的科研合作,为药厂提供科研产品及技术服务,在研发阶段协助药厂开发抗肿瘤新药,一旦新药开发成功,在研发阶段积累的高端辅料产品和研发经验将支持我们建立一条药用辅料生产线给该肿瘤新药长期提供高端药用辅料。在高校和研究所科研领域上面公司不但要抢占国内市场还要开拓国际市场,国际业务以在2018年初开始启动,部分产品已远销欧美大陆,计划在未来3年-5年公司的拳头产品要抢占大量的国际市场,使得德尔塔(Delta) 品牌发展成一个国际品牌。

 

【经营种类】:

德尔塔(Delta) 经营的产品种类包括有:合成磷脂、高分子聚乙二醇衍生物、嵌段共聚物、磁性纳米颗粒、纳米金及纳米金棒、近红外荧光染料、活性荧光染料、荧光标记的葡聚糖BSA和链霉亲和素、蛋白交联剂、小分子PEG衍生物、点计化学产品、树枝状聚合物、环糊精衍生物、热门肿瘤原料药、大环配体类、荧光量子点、透明质酸衍生物、石墨烯或氧化石墨烯、碳纳米管、富勒烯,二氧化硅及介孔二氧化硅,聚合物微球,近红外荧光染料,聚苯乙烯微球,上转换纳米发光颗粒,MRI核磁造影产品,荧光蛋白及荧光探针等等。


【温馨提示】:

德尔塔(Delta)供应的产品仅用于科研,不能用于人体治疗、药物开发、和其他商业用途,如有购买方或第三方采购我公司的产品用于治疗、药物开发或商业用途,购买方或第三方将承担所有法律责任,我公司也将追究其法律责任。以上产品均可定购。


【运输说明】:


极低温产品:极低温产品运输过程中加装干冰运输。

低温产品:低温产品运输过程中加装冰袋运输。

常温产品:常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。


【目前合作的部分科研单位】:

重庆医科大学,西南大学,第三军医大学,西南交通大学,重庆大坪医院,四川大学,华西医院,电子科技大学,哈尔滨工业大学,吉林大学,长春应化所,沈阳药科大学,中国海洋大学,北京大学,清华大学,北京理工大学,北京师范大学,北京中医药大学,中国农业大学,北京市肿瘤防治研究所,北京军事医学科学院,中国科学院动物研究所,中国科学院化学研究所,第四军医大学,西安交通大学,湖南大学,中南大学,武汉大学,武汉协和医院,华中科技大学,中山大学,广东药科大学,深圳大学,华南理工大学,中国科研学院先进技术研究院,厦门大学,福州大学,浙江大学,南京大学,南京医科大学,东南大学,中国药科大学,苏州大学,山东大学,山东师范大学,上海交通大学,华东理工大学,复旦大学,郑州大学,河南烟草局,宁夏医科大学,新疆大学,中国人民大学,中国科学院苏州纳米研究所,国家纳米科学中心,武汉病毒研究所,中国科学院过程工程研究所,江苏省原子医学研究所,中国科学院宁波材料技术与工程研究所,中国科学院上海硅酸盐研究所,中国医学科学院生物医学工程研究所等等

 

【目前合作过的药厂】:

石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,西安力邦制药有限公司,上海药明康德新药开发有限公司,安徽省国平药业有限公司,苏州亚盛药业有限公司,兆科药业(合肥)有限公司,南京绿叶制药有限公司,山东绿叶制药有限公司,大冢(上海)药物研究开发有限公司,国药集团化学试剂有限公司,长春金赛药业有限责任公司,成都苑东药业有限公司,浙江海正药业等。


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