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提供双抗体修饰的磁性核-壳-电晕纳米颗粒(GMNPs)的合成构建
发布时间:2021-03-10     作者:zzj   分享到:

纳米颗粒囊泡穿梭体由用于磁场诱导靶向的三氧化二铁(Fe3O4)核心、二氧化硅(SiO2)外壳和与两种抗体偶联的刺激可裂解聚(乙二醇)(PEG)电晕组成(一种针对目标外泌体上的抗原,另一种靶向受体损伤细胞)。同时验证了囊泡穿梭系统作为心肌梗死(MI)治疗的潜力。Fe3O4SiO2壳被涂。SiO2壳不仅保护Fe3O4核的磁性不受酸性生物环境中铁浸出的影响,而且能够进一步用3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)、巯基丙酸、水合肼和醛功能化的PEG进行逐步修饰。这些反应步骤引入了pH可裂解的腙键、防污段(PEG)和醛基(CHO),得到设计的GMNPs。通过扫描电镜、红外光谱法、磁性测量以及X射线衍射等分析方法,测定合成的GMNPs物化性质。

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这种核--电晕纳米颗粒(GMNPs),就是Fe3O4SiO2壳被涂。SiO2壳不仅保护Fe3O4核的磁性不受酸性生物环境中铁浸出的影响,而且能够进一步用3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)、巯基丙酸、水合肼和醛功能化的PEG进行逐步修饰。这些反应步骤引入了pH可裂解的腙键、防污段(PEG)和醛基(CHO),得到设计的GMNPs。通过扫描电镜、红外光谱法、磁性测量以及X射线衍射等分析方法,测定合成的GMNPs物化性质。

囊泡穿梭体应该同时具有捕获外泌体和靶向心肌细胞的能力。为了证实这一点,通过醛基和抗体伯胺之间形成Schiff碱,将两种类型的抗体(抗外泌体上抗原的抗CD63和针对MI区损伤心肌细胞的抗MLC)偶联到醛功能化的磁性纳米颗粒上。这些抗体(抗CD63和抗MLC)是根据抗小鼠Cy3-Red和抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)二抗对GMNPEC而不是GMNPBSA(对照组,GMNP与牛血清白蛋白(BSA)结合)的特异性靶向作用进一步鉴定的。这直接表明抗CD63和抗MLC抗体均存在于GMNPEC表面。所有结果证实了囊泡穿梭体GMNPEC纳米颗粒可以有效地捕获循环外泌体。

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为了进一步证明外泌体捕获和细胞靶向在GMNPEC中的整合,PKH67标记的外泌体与损伤的心肌细胞在GMNPECGMNPN存在的情况下共培养,发现GMNPEC显著增加邻近损伤心肌细胞的外泌体数量。而GMNPN既不与损伤心肌细胞结合,也不与外泌体结合,表明双抗体偶联GMNPEC的结合作用具有特异性。为了进一步评价GMNPEC纳米颗粒在体内的整合损伤靶向和外泌体捕获能力,将RhB标记的GMNPECGMNPENGMNPN注射到MI模型大鼠体内。在注射期间和注射后,进一步给予大鼠磁场10 min。在GMNPEN处理组和GMNPEC处理组动物的梗死区同时观察到特异性RhB荧光(红色)和PKH67荧光(绿色);非梗死(远端)心肌中不存在GMNPEC纳米颗粒也证实了结合特异性。这些结果表明,构建的囊泡穿梭体具有特异性收集循环外泌体并根据需要将其转运到梗死区的能力。

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一旦GMNPEC将外泌体穿梭到梗死部位,GMNPEC纳米颗粒被设计为释放这些外泌体,协助其内化以获得治疗益处。为了证明此释放行为,在模拟生理条件下(pH6.8为梗死环境,pH7.4为正常环境)评价了GMNPEC的外泌体释放行为。这些结果证明了GMNPEC在一定条件下选择性释放身体指定区域捕获的外泌体的潜力。同时发现,pH是触发GMNPEC纳米颗粒外泌体和抗体释放的关键要求。为了进一步评估GMNPEC在梗死区(pH6.8)而不是正常组织(pH7.4)释放外泌体的能力,将GMNPEC与预透析血清或PKH26标记的外泌体共同孵育,以捕获外泌体,即形成了GMNPEC–EXO。随后,通过磁性分离收集GMNPEC–EXO纳米颗粒,然后在pH6.8pH7.4PBS缓冲液中37 °C孵育4h。结果表明,捕获和释放的过程并不影响外泌体的完整结构。

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为评价治疗作用,在MI模型大鼠中全身给予囊泡穿梭体,并按计划测定治疗作用。结果显示PBSGMNPNG′MNPEC治疗组的左心室射血分数进一步降低,但GMNPEC治疗组显著改善。这些数据表明,GMNPEC收集和释放的外泌体在GMNPEC产生的治疗效果中都具有必不可少的作用。免疫荧光染色显示GMNPEC输注促进血管生成,相比之下,在对照组、GMNPNG′MNPEC处理组中,只有少数CD31 + 血管进入新形成的微血管网络。这表明GMNPEC将外泌体转移到梗死区,并引起血管的生长。这些结果表明,构建的囊泡穿梭在MI模型中改善了心脏功能。

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外泌体可以增强心肌的功能和促进血管生成。本研究构建的囊泡穿梭方法,收集了循环外泌体,将其转移到梗死区域并释放它们以产生MI的治疗效果。与传统的体外培养细胞外泌体给药治疗策略的研究相比,体内操作内源性外泌体生物分布治疗MI的概念还可能应用到其他疾病和过程,如肿瘤转移。外泌体生物分布的操纵也可用于研究EV分布的生物学作用——操纵其他EV的生物分布,如微泡和凋亡小体,改变其在信号传递、细胞功能调节和组织稳态维持中的作用。

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CD63抗体与囊泡穿梭捕获偶联,并附着在内源性循环外泌体上(i)。使用吸引磁性囊泡穿梭到梗死区域的外部磁体和靶向受损心肌细胞上MLC的结合抗MLC抗体双重靶向GMNPECii)。由pH < 6.8的梗死环境触发的外泌体的释放,酸化诱导的腙键的裂解和GMNPEC电晕的脱落导致外泌体的选择性释放(iii)。

 

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