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同位素示踪技术在疾病机制探索中的应用
发布时间:2020-12-21     作者:wyf   分享到:

同位素示踪技术在疾病机制探索中的应用

   细胞凋亡研究

  细胞凋亡是机体通过特定机制调控产生的细胞自发、程序性的死亡,它发生于胚胎发育、免疫防御等阶段,具有广泛的生物学意义。凋亡异常可诱发多种疾病,如自身免疫性疾病、癌症等。多种癌症的治疗都是通过诱导肿瘤细胞的凋亡途径(如Caspase-3、Bcl-2/xL、IAPs、MDM2-p53等凋亡通路)实现的。采用同位素示踪技术对细胞进行实时、无创的观察有助于研究疾病发生发展的机制。放射性同位素标记的细胞凋亡显像剂可与凋亡细胞特异性结合,应用于凋亡的早期检测而不受探测深度制约。在凋亡早期,细胞内会出现膜小叶和细胞内液酸化,采用18F标记2-(5-氟代戊基)-2-甲基丙二酸(ML-10),细胞凋亡时,该探针的丙二酸模体核心中的2个羧基俘获质子,使负离子分散在环状结构中,增加疏水性。已被酸化的探针进而通过疏水的羟基到达胞质,结合带负离子的蛋白质,从而富集于胞质。18F-ML-10已进入临床研究阶段,匹兹堡大学医疗中心Oborski等在已接受治疗的多形性成胶质细胞瘤患者体内注入18F-ML-10进行检测,结果显示体内的肿瘤细胞凋亡与该分子探针的摄取量变化相关。用于评估治疗前和治疗后早期肿瘤细胞凋亡的变化,是临床上评估新诊断患者的早期治疗反应的一种新方法。多种凋亡信号通路涉及Caspase-3的活化,靶向Caspase-3是凋亡显像的重要研究方向。18F-CP18包含与Caspase-3蛋白高度亲和的识别序列DEVD(Asp-Glu-Val-Asp),同时还可通过结构中的聚乙二醇链进行跨膜转运。当用细胞凋亡诱导剂处理时,体外细胞实验测定结果显示肿瘤细胞中Caspase-3依赖性摄取18F-CP18。在凋亡细胞中,活化的Caspase-3剪切PEG链使显像剂滞留在细胞内,从而显像。将18F-CP18注入非小细胞肺癌小鼠模型内,PET显像后发现术后肿瘤部位出现放射性浓影,证明该显像剂可检测癌症治疗中的早期凋亡,有希望开发成新的PET显像剂。

      除小分子探针外,蛋白多肽活性物质也是同位素标记凋亡探针的重要来源。细胞凋亡早期会出现胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,Ps)的外翻。钙依赖性磷脂结合蛋白AnnexinV与Ps具有高度亲和力(Kd=0.1nmol·L-1)。细胞凋亡时AnnexinV在钙离子存在下与外翻的Ps结合并变构为三聚体,覆盖于膜外侧的Ps上。99Tcm标记AnnexinV已成为细胞凋亡检测的常见方法。Witney等使用配体螯合物HYNIC与AnnexinV连接,在Sn2+存在下经99Tcm标记制得99Tcm-HYNIC-AnnexinV。再将该探针注入荷淋巴瘤EL-4的模型小鼠体内,结果显示药物摄取量与肿瘤细胞的早期凋亡相关。99Tcm标记的SAAC-PSBP-6多肽与Ps高度亲和,研究发现对99Tcm-SAAC-PSBP-6SPECT显像可以检测药物治疗后肿瘤细胞的早期凋亡。

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DNA损伤修复研究

DNA损伤是导致基因突变及转录活性异常的重要原因。机体通过DNA损伤修复(DNAdamageresponse,DDR)机制以避免细胞对DNA损伤反应异常引发的肿瘤疾病。上述过程涉及多信号通路的胞内因子表达变化,这可以为同位素示踪技术提供理想的位点。由于DDR参与肿瘤发生发展过程,利用同位素示踪技术检测DDR有助于研究肿瘤发生发展机制,并监测DNA损伤治疗的效果。

      DNA损伤有多种不同的形式,其中包括DNA单链断裂(DNAsingle-strandbreaks,SSBs)和DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreaks,DSBs)。多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)在细胞内主要参与DNA损伤修复、维持基因组完整性以及基因转录调节等,是DNA单链断裂损伤修复的关键位点。PARP-1识别并结合到DNA断裂处,激活并催化受体蛋白的聚ADP核糖基化,完成DNA修复工作。PARP-1是DNA损伤的主要生物标志物。Zhou等发现苯并咪唑类化合物NU1085的结构类似物可以显著抑制PARP-1,其中18F-FluorThanatrace(18F-FTT)具有显著的比活力(5.5×106~1.8×107Ci·mol-1),且其IC50也相对较低[(6.3±1.3)nmol·L-1],MDA-MB-231荷瘤模型(低PARP-1表达)及MDA-MB-468荷瘤模型(高PARP-1表达)等多种移植瘤模型动物注入探针后,PET/CT显像证明体内肿瘤组织对18F-FTT的富集程度与移植瘤模型PARP-1表达呈显著相关。18F-FTT探针可以通过监测体内PARP-1水平描述DNA损伤程度。

      DSBs是较严重的DNA损伤形式,可能会引发癌症等相关疾病。细胞在发生DSBs时产生应激反应,导致毛细血管共济失调突变基因产生信号级联反应。组蛋白H2AX是该级联反应的重要位点,可被共济失调突变基因磷酸化形成γH2AX。γH2AX再招募其他修复因子进行损伤修复,是DSBs的重要生物标志物,可作为检测肿瘤细胞DNA损伤修复的靶点。由于γH2AX抗体的相对分子质量较大,难以直接通过胞膜结构,通常需要用细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptides,CPPs)TAT进行修饰。Cornelissen等次采用111In修饰anti-γH2AXTAT,并将该探针注入MDA-MB-468乳腺癌移植瘤模型小鼠。SPECT结果显示,肿瘤对111In-anti-γH2AX-TAT的吸收值与DNA损伤程度显著相关。这表明该核素探针可以无创性地观察肿瘤DNA损伤过程。MDA-MB-468乳腺癌移植瘤小鼠的肿瘤组织在辐射(10Gy)下对89Zr-anti-γH2AX-TAT的吸收较对照组(0Gy)明显更多。2同位素示踪技术在药学研究中的应用2.1药物治疗靶点研究基于细胞或动物模型的靶向候选药物的发现和筛选中,只有找到合适的靶点分子才能更好理解疾病发生发展的分子机制,研究药物与靶点结构互相作用的本质,从而更加有针对性地设计和改造化合物,增加药物研发的可预测性和成功率。目前已知的药物靶点98%以上属于蛋白质,包括G蛋白偶联受体、酪氨酸蛋白激酶及磷酸二酯酶等。目前,尽管以RNA干扰(RNAinterference,RNAi)为代表的遗传学手段在药物靶点的鉴定方面有成功的案例,但通过蛋白质芯片、同位素标记的策略以及化学蛋白质组学等技术发现及鉴定药物靶点才是更加直接有效的方法。其中,同位素示踪技术作为工具应用于靶点的发现是当前药物研究的重要手段。ⅠA和ⅠB期的非小细胞肺癌患者接受治疗后5年存活率分别为83%和71%,而Ⅱ期患者的存活率仅有50%,这说明中期肺癌的治疗模式仍有较大提升空间。目前,手术治疗和辅助化疗仍然是治疗早期肺癌患者的常用方法,在晚期肺癌治疗中效果显著的免疫检查点抑制剂(如PD-1及PD-L1抗体)并未被用来治疗早期肺癌患者,其主要原因是早期肺癌组织的肿瘤微环境免疫状况尚不清楚。Lavin等收集了28名早期及晚期肺腺癌患者的肿瘤样本、正常肺组织及血液,并在细胞水平上分析样品,绘制肿瘤细胞免疫组分图谱。研究人员设计出一种“条形码系统”,其可以对样本中的所有细胞类型采用不同同位素标记示踪。然后运用飞行时间质谱流式细胞术(masscytometrybytimeof-flight,CyTOF)与单细胞转录组学(single-celltranscriptomics)和肺部肿瘤的多重成像技术相结合,在单细胞水平对肿瘤细胞的免疫状况进行同时分析。

     结果显示在早期肺腺癌组织周围就聚集着大量抑制性巨噬细胞和T细胞,同时表现出NF-κB诱导激酶(NF-κB-inducingkinase,NIK)细胞的损耗,这表明免疫细胞在肿瘤形成早期就产生功能失调。同时,还发现免疫检查点蛋白PD-1和PD-L1也已经分别出现在部分CD4+和CD8+的T淋巴细胞和巨噬细胞表面,因此,在肿瘤疾病早期使用免疫疗法有望为临床治疗带来新的希望。

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