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在蛋白质骨架上进行翻译后位点选择性的氘代标记
发布时间:2020-12-15     作者:wyf   分享到:

在蛋白质骨架上进行翻译后位点选择性的氘代标记

氢原子的同位素经常被用来进行标记蛋白质来进行蛋白的功能、结构和机制,然而目前将同位素标记在蛋白上主要是利用分段标记的策略,即利用同位素标记的氨基酸后在进行传统的肽段合成。这个方法往往会导致标记的某个氨基酸的标记缺乏位点的选择性,而且需要复杂的工程表达体系。目前还没有可以直接进行位点选择性在整个蛋白水平上进行氘代标记的策略。受到烯醇化合物的亲核加成反应的启发,推测可以在氨基酸和蛋白水平上生成α,β不饱和的酰胺,随后与重水(D2O)反应,从而引入氘代标记。

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脱氢丙氨酸(Dha)是一种天然存在的氨基酸,它可以通过半胱氨酸(Cys)衍生生成。因此认为蛋白中的Cys转化为Dha后,Dha中的α,β不饱和的酰胺捕获重水中亲电D+,随后再与硫醇化合物发生迈克尔加成反应,可实现蛋白质位点选择性的无痕氘代标记。为了使Dha与硫醇化合物S-R反应能够得到Cys的产物,测试了R=H, AcPO32-等时化合物的反应活性和脱保护情况, 发现磷酸化的硫醇化合物均能成功地反应插入和脱保护。先在组蛋白H310Cys位点H3-Cys10进行验证,利用双烷基化的脱除试剂DBHDACys转化为Dha,随后H3-Hda10在重水环境下与Na3SPO3反应生成H3-[d1]Cys10SPO32-,分别可以通过磷酸酶PP1或酸环境脱除磷酸根,得到H3-[d1]Cys10, 其中酶水解1 h后的产率>95%。得到的产物在α位置存在差向异构,其中L:D的比例在1:2。也同样在H326Cys位点H3-Cys26进行了同样的反应,也实现了位点选择性的氘代标记。

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之前开发的DBHDA试剂可以高效选择性在蛋白中的Cys进行脱除反应生成Dha,然而其中的机制却不清楚,进一步利用这种氘代标记研究了Cys转化为Dha中的蛋白化学反应机理。先探究了与蛋白中的Cys反应生成的硫叶立德反应中间体的稳定性以及对随后的C-H交换反应活性的影响。发现中间体发生消除反应生成的Dha的过程中硫叶立德的生成和相应位点的脱除是密切相关的。还通过密度泛函理论对DBHDACys转化为Dha过程的可能的过渡态能量进行计算,发现了在消除反应过程中硫叶立德中间体可能存在Swern-like分子内脱质子过程。

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【目前合作的部分科研单位】:

重庆医科大学,西南大学,第三军医大学,西南交通大学,重庆大坪医院,四川大学,华西医院,电子科技大学,哈尔滨工业大学,吉林大学,长春应化所,沈阳药科大学,中国海洋大学,北京大学,清华大学,北京理工大学,北京师范大学,北京中医药大学,中国农业大学,北京市肿瘤防治研究所,北京军事医学科学院,中国科学院动物研究所,中国科学院化学研究所,第四军医大学,西安交通大学,湖南大学,中南大学,武汉大学,武汉协和医院,华中科技大学,中山大学,广东药科大学,深圳大学,华南理工大学,中国科研学院先进技术研究院,厦门大学,福州大学,浙江大学,南京大学,南京医科大学,东南大学,中国药科大学,苏州大学,山东大学,山东师范大学,上海交通大学,华东理工大学,复旦大学,郑州大学,河南烟草局,宁夏医科大学,新疆大学,中国人民大学,中国科学院苏州纳米研究所,国家纳米科学中心,武汉病毒研究所,中国科学院过程工程研究所,江苏省原子医学研究所,中国科学院宁波材料技术与工程研究所,中国科学院上海硅酸盐研究所,中国医学科学院生物医学工程研究所等等

 

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