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抗体偶联标记生物素/荧光/辣根过氧化物酶/磁珠/琼脂糖珠
发布时间:2020-11-13     作者:axc   分享到:


抗体偶联标记生物素/荧光/辣根过氧化物酶/磁珠/琼脂糖珠

抗体偶联标记,是以共价偶联的方式将标记基团连接在抗体上的一种标记技术。

若偶联在抗体上的基团是荧光染料、荧光蛋白等标记物,偶联后的抗体可以用来做流式细胞术 FACS 、IF、活体成像等标记示踪类实验。若被偶联在抗体上的是 HRP、AP 等酶类,偶联后的抗体可以直接跟检测底物反应,用于 ELISA、WB、IHC 等试验检测。若被偶联的基团是 Biotin,偶联的抗体可以再同酶联亲和素或酶联 Anti-Biotin 抗体反应,若抗体直接被偶联在磁珠、琼脂糖珠等固相介质上;或通过抗体生物素化,再与链霉亲和素介质结合后,则能用于靶蛋白复合物亲和纯化,及其蛋白相互作用研究中。


西安齐岳生物提供定制抗体偶联标记物,主要提供以下四大类

1.抗体偶联标记荧光染料、荧光蛋白。

2.抗体偶联标记HRP、AP 等酶类。

3.抗体偶联标记Biotin生物素。

4.抗体偶联标记磁珠、琼脂糖珠等固相介质上。


抗体是怎么被生物素,荧光,辣根过氧化物酶,磁珠,琼脂糖珠偶联标记上的?抗体偶联标记中的共价化学键是如何形成?以下内容为你解答:

抗体偶联标记相比于抗体标记,多了 “偶联(conjugation)” 一词,指抗体和标记基团之间是通过共价键连接而成。抗体的标记除了共价标记之外,也可以通过非共价的亲和作用力来标记,

 那么抗体偶联标记中的共价化学键是如何形成的呢?跟其他化学反应类似,共价键是两个底物在合适的条件下发生化学反应得到。抗体这个大分子蛋白上常用的反应基团包括:氨基、巯基和羧基(图 1)。

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在能够跟以上基团起反应的活性反应物上修饰标记基团,完成偶联反应,经过纯化后的产物即是偶联标记好的抗体。在活性反应物中,常见是对抗体氨基反应的 NHS 酯(N-hydroxysuccinimide esters,N-琥珀酰亚胺基酯)和针对抗体巯基反应的马来酰亚胺(Maleimides)。这两个标记反应的化学原理可以参考下面的示意图(图 2)。

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NHS 酯的标记反应一般在弱碱性的无伯胺缓冲液(如硫酸盐、碳酸盐、硼酸盐缓冲液)中进行,然后用含伯胺缓冲液(如 Tris 盐,Glycine 缓冲液等)中止反应。NHS 酯极易水解,随着 pH 升高水解反应越剧烈。NHS 的水溶液在 pH 7.0 的 0°C下,半衰期仅 4-5 小时;pH 8.6 的 4°C下,半衰期降为 10 分钟。NHS 酯的水解会对其氨基标记反应产生竞争抑制,使标记效率严重下降。因此一般 NHS 类标记试剂都是现配现用,且在保存时需要格外注意避免潮解。对于抗体标记的新手而言,建议选用小包装分装好的试剂进行反应。

 

马来酰亚胺是标记巯基的常用试剂。但抗体或其他蛋白中的二硫键通常会使得半胱氨酸残基中的巯基并不暴露在外。所以巯基标记关键的一步就是得到暴露在外的可以跟马来酰亚胺反应的巯基。抗体自身的重链和轻链就是通过二硫键共价交联在一起的,因此对抗体做巯基标记需要格外小心——即要部分打开重链之间的二硫键,又不能够破坏重链和轻链之间的二硫键,以免过分影响其抗原结合的效果。在通过计算还原剂和抗体使用比例达到合适的还原后,跟 NHS 酯的标记反应类似,标记反应液中还需要去除外源的硫醇干扰(常用还原剂多会含有硫醇),因此需要对还原后的抗体进行脱盐或透析。此外,在马来酰亚胺反应液中一般还需要加入金属螯合剂 EDTA,以免其氧化巯基影响实验。


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