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体外三维基质中原代CD34+细胞的扩增
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
体外三维基质中原代CD34+细胞的扩增 试剂和材料： 1. 培养基：含2mmol/L的左旋谷氨酰胺的IMDM，添加1%牛血清白蛋白，10μg/ml胰岛素，0.1mmol/L 2-巯基乙醇，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素； 2. 48孔培养板； 3. 0.05%胰蛋白酶，含EDTA； 4. 纤维粘连蛋白（fibronectin）包被的细胞基质支架； 5. 细胞因子（干细胞因子，IL-6，IL-3，Flt-3配体）； 实验方法： 1. 用含细胞因子的培养基重悬细胞（100ng/ml干细胞因子，20ng/ml IL-6，20ng/ml IL-3和100ng/ml Flt-3配体）； 2. 将2.5×105 CD34+细胞/ml接种到纤维粘连蛋白包被的48孔培养板； 3. 每周两次半量更换新鲜培养基； 4. 两周后收集细胞； （1）250g离心10min，从三维细胞基质支架中收集非贴壁的细胞； （2）贴壁的细胞用0.05%胰蛋白酶/EDTA孵育细胞基质，37℃孵育30min，随后250g离心10min；
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饲养层细胞共培养体外扩增原代CD34+细胞
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
饲养层细胞共培养体外扩增原代CD34+细胞 试剂和材料： 1. MSCs培养基； 2. 6孔培养板； 3. 丝裂霉素C，100μg/ml； 4. 共培养的培养基：IMDM添加10%FBS，100U/ml青霉素和100μl/ml链霉素； 5. 细胞因子（干细胞因子，IL-6，Flt-3配体，促血小板生成素）； 实验方法： 1. 将脐带血来源的间充质干细胞（CB-MSCs）作为饲养层细胞，用MSCs培养基重悬CB-MSCs，细胞浓度为5×104个细胞/ml； 2. 将CB-MNCs接种到6孔板； 3. 每周两次半量更换新鲜培养基； 4. 当CB-MNCs达到90%以上汇合时，用10μg/ml丝裂霉素C处理，37℃ 2.5h； 5. 用无血清IMDM将CB-MNCs洗两遍； 6. 按1×104/ml CD34+细胞重悬于含细胞因子的共同培养基（100ng/ml干细胞因子，100ng/ml IL-6，50ng/ml Flt-3配体，10ng/ml促血小板生成素）； 7. 将CD34+细胞接种到CB-MSCs饲养层细胞上； 8. 每周两次更换1/4培养基； 9. 2周后，收集未贴壁细胞；
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深冷法制氮与变压吸附（PSA）法制氮比较
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
深冷法制氮与变压吸附（PSA）法制氮比较 随着工业的迅速发展，氮气在化工、电子、冶金、食品、生物、医药等领域获得了广泛的应用，氮气的需求量逐年大幅增加。氮气的化学性质不活泼，在平常状态下表现为很大的惰性，不易与其他物质发生化学反应。因此，氮气在电子、化工、食品、生物、医疗中广泛的用来作为保护气和密封气，一般保护气的纯度要求为99.99%，有的要求99.998%以上的高纯氮。液氮是一个较方便的冷源，在食品、医疗、生命科学等方面得到越来越普遍的应用。 纯净的氮气无法从自然界直接汲取，但是可以通过分离空气获得。现有的空气分离氮气方法包括：深冷法、变压吸附法(PSA)、膜分离法。本文主要讨论深冷法和PSA法制氮。 原理 PSA法制氮是以空气为原料，以碳分子筛（CMS）作为吸附剂，运用变压吸附原理，利用碳分子筛对氧和氮的选择性吸附而使氮和氧分离的方法。空气经空气过滤器清除灰尘和机械杂质后进入空气压缩机，压缩至所需压力，经严格的除油、除水、除尘净化处理，输出洁净的压缩空气，目的是确保吸附塔内分子筛的使用寿命。装有碳分子筛的吸附塔共有二个，一个塔工作时，另一个塔则减压脱附。洁净空气进入工作吸附塔，经过分子筛时氧、二氧化碳和水被其吸附，流至出口端的气体便是氮气及微量的氩和氧。另一塔（脱附塔）使已吸附的氧气、二氧化碳和水从分子筛微孔中脱离排至大气中。这样两塔轮流进行，完成氮氧分离，连续输出氮气。PSA制取的氮气纯度为95%-99.9%，假如再经过氮气净化设备处理，得到的高纯氮气纯度可达99.9995%。目前PSA制氮最大的生产能力为3000 Nm3/h。 深冷法制氮是一种传统的制氮方法，已有近几十年的历史。它是以空气为原料，利用液氧和液氮的沸点不同（在1大气压下，O2的沸点为-183℃，N2的为-196℃），通过液态空气的精馏，使它们分离来获得纯氮，同时也可以获得纯氧。空气经空气过滤器清除灰尘和机械杂质后进入空气压缩机，压缩至所需压力，然后送
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ELISA的概念、原理、操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 (一) 原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 (二) 操作步骤 方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ "、“-"号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性
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金属套玻璃高效雾化器检验规程及标准
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
金属套玻璃高效雾化器检验规程及标准 火焰原子吸收光谱分析用 一. 检验工具： 空气流量计、压力表、原子吸收光谱仪、无油空气压缩机、乙炔气、秒表、量筒（10mL）、蒸馏水（或纯净水）、Cu标液。 二. 检验规程及标准： 1. 取出雾化器，检查外观：玻璃部分不应有损坏和裂纹，金属焊接部分光滑没有沙眼， 钢针及其它粘接部分牢固，钢针没有弯曲和松动现象，尾部侧面不可有漏气现象。所配进液毛细管（共5支）是否齐全。 2. 将气源管与雾化器进气支管连接好，拧紧锁紧螺帽，不可有漏气现象。将空压机输出压力调整至原子吸收生产厂家设计规定的压力。 3. 空气流量的检查：用我公司提供的检查装置接上雾化器，用右下开关调整压力至原子吸收厂家设定压力，此时再看流量计，应为原子吸收厂家设定数值，上下出入在5％为合格。如不合格请送回厂家更换，用户无法调整。 4. 打开气源，将取样管插入蒸馏水中，将雾化器用手拿着使空气支杆方向与在原子吸收上的实际进气方向相同，吸喷蒸馏水，看喷雾状态，应散开后向前喷，散开面应大于8cm，雾应从3400（除去撞击球支杆位置约200）范围向外喷出，各个方向喷出量应基本相同。如喷雾角度或雾化不好：可转动撞击球角度，必须拿住撞击球根部(有胶圈部位)转动，否则容易造成连接支杆的折断，撞击球可在连接杆下方90度角内任意调节，（保证撞击球支杆在下方，使水珠可顺利排出），并将撞击球顶紧雾化器喷口，看喷雾状态，至满意为止。 5. 喷雾时雾化器发出的声音应一致，不可有突、突、突、突间断声音，如有间断声音请检查进样管是否插牢（插牢进样管排除）、进样管是否有破漏之处（更换进样管排除）。如仍不能排除，此雾化器为粘接不牢漏气，属不合格产品，由生产厂家更换。 6. 提升量的检查：将进样管插入10mL量筒内，量筒内灌入蒸馏水至刻线，测量提升量，从开始喷雾计算，一般情况雾化器的提升量在4-6mL/min，如提升量小了，可更换进样管，或剪短进样管（减小进样阻力），
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非接触式分液技术
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
非接触式分液技术 探讨生物传感器表面基材和试剂间的相互作用对移液结果的影响 在生物传感器表面涂上生物活性基质较为常见。但如低至微升或次微升量，则难度会有增加。如需要在一个特定形状的传感器上均匀分配基质而又不能超出边界，会更加复杂。总之，这并不是件容易的工作！ 非接触式小容量分配的最大优点之一就是分液针不与基板相接触，这样分配质量不受基板的影响。随着非接触式分配应用于更多非标准用途（如医学诊断），且既定应用（如基因组学）开始采用非标准材料作为基板，需要更多地考虑基材对分液形态的影响作用。 对于从非接触式移液器（不与基板相接触）中分配出的液滴来说，有很多材料属性都对其具有潜在的影响作用。最显著的例子是：基板的疏水性/亲水性，导电性及弹性。在医疗设备或生物传感器的生产中，经常使用一些特殊的基板。这需要将试剂放置于基板的一个特定位置。很多时候要求液滴之间间隔很小。不过，需要滴液布满一个基板的指定区域而打破球形状态也很普遍。 不管哪种方式，都必须格外注意表面特性对试剂分配的影响作用。传统“touch off”或“near touch off”移液器受基板状况影响很大；非接触式移液器虽不再需要接触基板，但仍存在基板/试剂的相互作用，且要遵循物理定律！ 疏水性/亲水性 水基材料会吸附亲水表面物质，而排斥疏水表面物质。对于非接触式分液来说，则体现在所得到的滴液的圆度上，这可通过测量其接触角（滴液与表面相接触的所成角）来量化。对于疏水性极高的表面，接触角会接近90度。而对于亲水表面，接触角会接近0度，滴液会有效地扩散在目标面上。 按照下图所示（图1），您可看到一颗被分配于一个较为洁净的玻璃面上的液滴。所得到的液滴既不扩展也不呈现显著的90度角。用浓盐酸对表面腐蚀一个晚上，可使表面变得更亲水。所得到的液滴会相当扁平（见图2）并扩散于更大的表面面积。相反，用疏水溶液（本例中为Rain-X™）处理表面，可形成非常好的
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智能真空泵的含义及其优越性！
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
什么是“智能真空泵” 所谓“智能真空泵”，顾名思义就是智能化、自动化的真空泵。一般特指集成了传感器、真空表、单片机等监控系统的微型真空泵|小型真空泵|微型气泵，能对真空泵关键参数如“真空度(负压)”、“流量”等进行实时、自动调整，从而完成一般要构建一个较复杂系统，才能完成的如“真空保压”、“自动定时停机、启动”、定时定量“真空抽滤”等的多种功能。 跟大型真空泵动辄几十、几百公斤的重量和庞大的体积相比，智能真空泵重量、体积都要小得多，甚至可以说是便携式；因而常常也被叫做“智能真空仪”、“台式真空泵”、“自动真空泵”、“便携式真空泵”。 【特点】 (1)可以调节实际工作中需要的真空度，可设定并通过集成的数字液晶面板，“实时”显示出当时的真空度(负压)值； (2)流量可以进行大小调节； (3)配备高灵敏度的进口传感器，优质流量调节阀门及精密控制电路，来完成“自动调节”功能，大大节省了开发人员的时间、精力； (4)内置低干扰、长寿命微型真空泵；配合微型气泵专用消音系统及独立减震系统，确保智能真空泵能长时间、低噪音、可靠的工作； (5)核心部件为一台微型真空泵，所以继承了微型真空泵无油无污染，可以连续24小时运转的优点，属于名副其实的干式真空泵，所以无需维护，不用加润滑油和真空泵油；智能真空泵背面 (6)交流220V供电，即插即用 【详细介绍及实例】 这种智能真空泵是通过独特的三种工作模式：区间、定时、极限，来达到自动调节真空度和流量目的的： 1.区间工作模式 可设定所需真空度的上限和下限两个数值，当泵工作达到真空度上限值时就会自动停机，当真空度跌落至下限值时泵就自动启动。 应用范围：对密闭容器进行真空保压等 实例：假如用型智能真空泵(它的最大负压-80kPa)，来对一个密闭容器进行“真空保压”，使之内部负压始终维持在-60kPa左右，则可设定上限为-55kPa，下限为-65kPa，期间容器内负压到达上限，
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HPLC设备的螺母、套圈系统
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
事实上，在分析仪器世界里，我们通常所说的“配件“是指一个由螺母和套圈组成的系统。 最终选择在您的系统中使用哪个螺母和哪个套圈将由一系列的参数决定: 1.接收口的螺纹 2.接收口的几何形状 3.所使用的管道尺寸和类型 4.端端口的制造材料 5.预期的压力值 ……以及一些其它参数.根据所有这些因素.让我们看看是否可以更清楚地表述配件。 螺母 配件系统的两个主要组成部分之一叫做螺母。螺母是用来提供驱动力使套圈密封。 螺母通常由头部和螺纹部分组成螺母头部具有几种几何形状(例如滚花形、六角形和方形)在紧固过程中起到辅助作。用螺纹部分使螺母与接收端口良好的匹配。让我们进一步对每个部分进行详细讨论。来帮助您辨别使用何种产品.以及还有哪些其他产品可选 螺纹 绝大多数螺母具有“外螺纹”就是说螺纹在螺母的外部。然而有些螺母却具有“内螺纹”也就是螺纹位于螺母的内部一通常叫做“盖形螺母”或“内螺纹螺母”。 由于绝大多数的螺母具有外螺纹让我们集中考虑这种螺母的几何形状。通常用两个主要数据来描述配件上的螺纹。第一个数据告诉我们螺纹的直径。第二个数据描述螺纹之间的距离。即螺距。以下是一个简单的示例: 在低压流体输送中应用最广的一种螺纹是1/4-28。注意这里用连字符分开的两个数据。现在，让我们应用以上说明，看看是否能确定一些有关这类螺纹的基本信息。 螺纹编号的第一个数据是“1/4”。由于我们知道这个数据代表的是螺纹直径我们有了第一个线索。在这种情况下编号的测量单位是英寸因此这就表示螺纹的直径是四分之一英寸。螺纹的直径是从螺纹的一个顶部，穿过整个螺纹向另一相反端的顶部进行测量的。换言之我们在寻求螺纹的最大直径在螺纹标注中的另外一个数据并不那样明显。您觉得它表示什么呢？记住，这个数据表示螺纹之间到底有多近。 想到了，好吧，如果您认为那表示在配件上共有28条螺纹您已经相当不错啦!但不幸的是，那不是正确答案。在这种
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等密度离心法去除红细胞和死细胞
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
等密度离心法去除红细胞和死细胞 器材和试剂： 所有直接接触细胞的用品和试剂必须无菌。 1. 标注体积刻度的试管（圆锥形底）； 2. 巴斯德吸管（短型和长型）； 3. 10ml刻度吸管和洗耳球或移液装置； 4. 台式离心机； 5. 淋巴细胞分离液或类似试剂； 6. 培养基； 实验方法： 1. 重悬细胞使之达到5×106—107个/ml的高浓度。在一个离心管中加入10ml淋巴细胞分离液，用巴斯德吸管或10ml移液管小心将5ml的原代细胞悬液加于淋巴细胞分离液面上。将容器倾斜一个角度，沿容器壁慢慢地将细胞悬液滴下，而不是直接滴到淋巴细胞分离液表面。目的是在两种液体之间得到一个清晰的界面，以便更好地分离； 2. 不制动1000r/min离心试管20min（注：离心时缓慢地减速可使淋巴细胞分离液与培养基之间形成清晰的界面）； 3. 从离心机中小心地取出容器，观察两液面之间的界面，可见一乳状黄色细胞带。红细胞和死细胞形成沉淀沉于容器底部； 4. 用一个巴斯德吸管吸出界面可见的细胞层，转入一个离心管； 5. 向收集的细胞中加入新鲜培养基并混匀。1000r/min离心5min，重复两次，洗去细胞表面的淋巴细胞分离液； 6. 将细胞重悬于已知体积的培养基中，进行细胞计数和活力测定；
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急速裂解法去除红细胞
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
急速裂解法去除红细胞 器材和试剂： 所有直接接触细胞的用品和试剂必须无菌。 1. 标注体积刻度的试管（圆锥形底）； 2. 巴斯德吸管（短型和长型）； 3. 台式离心机； 4. 培养级纯净水； 5. 2×Hanks平衡盐溶液； 6. 储存培养基，含10%血清； 实验方法： 1. 1000r/min离心原代细胞悬液5min，弃上清； 2. 向细胞沉淀中加入10ml培养级水，并用移液管轻轻来回吹打数次以重悬细胞（注：不同细胞的抗低张能力不同，控制暴露时间低于15s）； 3. 迅速加入等体积的2×Hanks平衡盐溶液恢复张力，用巴斯德吸管轻轻混匀细胞悬液； 4. 再次1000r/min离心5min，检查红细胞沉淀。如果红细胞仍大量存在，重复该步骤。否则在储存培养基中重悬洗涤过的细胞； 5. 计数及检测细胞活力后，放培养箱培养；
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高性能液体色谱系统介绍
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
什么是HPLC? 我们所有关于配件的讨论.看起来似乎只适用于HPLC系统一使用我们所讨论的配件进行的主要液体传输应用。 HPLC是高性能液体色谱系统(High Performance LiquidChromatography)的首字母缩写。(很多人以为“P”是表示“压力”，因为很多HPLC应用中的压力确实很高。但是“p”其实是表示“性能”。 HPLC在1960年开始使用。这项技术使得分析师可以把由已知和未知成分组成的样品分解为组成部分的级别，然后定量分析样品中的每个组成部分。并且由干这项技术没有破坏性，HPLC成为实验室应用中用途极为广泛的仪器之一。科学家们在使用HPLC系统分析过样品后，还可以继续对样品进行其它测试。 通过将样品放入作为流动相的液体化学蒸汽中实现分离。这液体化学蒸汽将样品带入特制的管道中，这个特制管道(管柱)填充有作为固定相的微型化学活性颗粒。在管柱内部，样品与流动相和固定相均发生相互作用，并开始化学分离为它的组成部分。系统中的其它设备生成并记录那些分离的样品组成部分的分析数据。然后那些数据被记录在一个被称为色谱的图表上。 HPLC系统由何组成? 在我们进一步展开讨论之前必须首先了解标准HPLC系统的组成部分。 一个HPLC系统包括七个基本组成部分，每部分都具有重要的功能： 溶剂容器--溶剂容器用来装流向系统的化学溶液。因为这种溶液流经整个分析过程我们称之为流动相。 泵--泵将流动相从储存池中抽出，并推动其流向系统其他部分。目前最常用的泵是双活塞泵--可以在高压状态下保持稳定的流速。 喷射阀--喷射阀将样品引入流动相。最常用的喷射阀是一种六端口、双位置阀。这种类型的阀可以控制一定数量的样品重复性地引入流动相通道，却基本上不影响系统的其它部分。 典型喷射阀管件 管柱--通常被称为日PLC系统的“心脏”，将管柱看成一种化学“过滤器”。如上文提到的那样，管柱是具有特定长度和内径并且通常充满小颗粒的管道。这些颗粒通常有一层化学物质涂层，这种化学物
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灭菌过程致死率的确定方法
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
灭菌过程致死率的确定方法——生物指示物/生物负载方法 A.1 总则 本方法结合了生物指示物对给定周期的抗力和生物负载与抗力方面的知识以建立周期参数（作用时间）。使用本方法要求证明产品的生物负载水平在一定期限内保持相对稳定以及生物负载的抗力小于等于生物指示物的抗力。通过逐步增加作用时间和确定周期的灭活率证明生物指示物的抗力。这一比率和生物负载的菌数及相对抗力方面的知识可用于确定灭菌时间，从而可以预测SAL。 本方法的指南见ISO14161。 A.2 程序 A.2.1 确定产品中最难达到无菌的位置。 A.2.2 将生物指示物放置于产品中最难达到灭菌条件的位置，为灭菌过程创建监测，包括已知的微生物数量和已知的对EO的抗力。如果监测的位置不是最难灭菌的位置，应确定其与最难灭菌位置之间的关系。 使用经证明对灭菌过程的抗力比产品对灭菌过程的抗力大的PCD可满足本要求。需注意包装和从PCD中移除灭菌剂的影响。 A.2.3 使用与常规产品相同的包装方式对上述PCD进行包装，并放置于被灭菌物品中。 A.2.4 选择比常规条件具有较小致死性的条件将被灭菌物品暴露于EO中（见第8条），使基准微生物不会被全部灭活。 A.2.5 在EO作用时间递增而其他参数保持不变之后，使用以下方法之一确定过程的致死性： a） 直接列举（见A.3.1）或 b） 部分阴性法（见A.3.2或A.3.3）或 c） a）和b）的组合方法。 注：部分阴性法采用在部分气体作用时间后PCD复活检测中有无细菌生长的方法。根据这一结果，可计算出基准微生物的灭活率。 A.2.6 根据产品生物负载方面的知识（见ISO11737-1），生物负载对灭菌过程的抗力和基准微生物的灭活率决定了达到规定SAL所需的处理范围。 A.3 确定过程致死性 A.3.1 直接列举 A.3.1.1 采用直接列举存活微生物创建存活曲线的方法确定灭菌周期的致死性。 A.3.1.2 ISO14161和ISO11138-1：2006 C.3给出了本方法的细节。 ISO11138-1：2006 C.3要求至少有五次作用覆盖以下方面： a） 一次作用，样品没有暴露于灭
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灭菌过程致死率保守性确定方法——过度杀灭法
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
灭菌过程致死率保守性确定方法——过度杀灭法 B.1 总则 B.1.1 本过程定义方法的基础是基准微生物的灭活，本方法已得到广泛使用。采用本方法鉴定的灭菌过程通常具有保守性，所用的处理水平可能超过了达到无菌要求所需的处理水平。 本方法的指南见ISO14161。 B.1.2 保守性过程定义需采用以下方法a）或b）之一： a） 半周期法：应进行总共三次连续的试验，结果为灭活全部的生物指示物（菌落数不少于106），以确认最小作用时间。规定的作用时间应至少为此最小时间的两倍。同时应运行有存活微生物的短时间周期，以证明存活技术的适宜性。 b） 周期计算法：使用A.3描述的方法之一，确定生物指示物孢子对数降低值至少为12SLR的常规处理参数。根据所用的方法确定周期的次数。 B.1.3 确认中用于生物指示物复活的条件，包括培养时间，应予以确定并形成文件。培养时间应考虑经暴露于EO的芽孢延迟生长的可能性。 B.2 程序 B.2.1 判定最差产品或PCD，其灭菌困难程度至少与用于灭菌过程的最困难物品相等。 B.2.2 确定产品中最难达到灭菌条件的位置。 B.2.3通过以下方法之一创建灭菌过程监测，包括已知的微生物数量和已知的对EO的抗力： a） 将生物指示物放置于产品中最难达到灭菌条件的位置，或放置于PCD中，或 b） 将适当的基准微生物接种于产品中最难达到灭菌条件的位置。 见ISO14937：2000表A.1。 如果监测位置不是最难灭菌的位置，应确定其与最难灭菌位置的关系。 B.2.4使用与常规产品等效的包装方式对上述PCD进行包装，并放置于被灭菌物品中。 B.2.5使用比规定灭菌过程的致死性较小的条件将被灭菌物品暴露于EO中。 B.2.6 如果已知微生物数量的灭活已根据A.3进行确认，推断已知的微生物存活预期可能性，并考虑所需的SAL，确定灭菌过程处理的范围。
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细胞计数和活力测定实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
细胞计数和活力测定 器材和试剂： 1. 倒置相差显微镜，具有10×物镜； 2. 标注体积刻度的试管（圆锥形底）； 3. 改良的Neubauer血细胞计数器； 4. 计数器盖玻片； 5. 袖珍管或等体积的塑料容器，如试管或离心管； 6. 巴斯德吸管（短型和长型）； 7. 可调体积的微量加样器（100—250μl）； 8. 无菌枪尖； 9. 无菌刻度吸管（1—10ml）、洗耳球或自动移液装置； 10. 10g/L台盼蓝； 11. Hanks平衡盐溶液或储存培养基； 实验方法： 1. 准备计数器。轻轻地湿润中央网络区域的各个边，用两个拇指的压力使盖玻片水平地从边缘滑动。当在中央标记区临近的任何一边能看见牛顿环（彩虹色）时，盖玻片位置正确； 2. 1000r/min离心细胞悬液5min，弃上清。将细胞重悬于已知体积的培养基中； 3. 用巴斯德吸管来回吹打细胞悬液几次，混匀，确定细胞均匀分散； 4. 用微量加样器吸取250μl混匀的细胞悬液，转入袖珍管。用一个干净的加样器尖吸取等体积台盼蓝溶液加入细胞悬液中。用拇指和食指快速轻弹袖珍管几次使之混匀。立即用一个巴斯德吸管尖吸取一滴细胞悬液，轻轻地将其滴在临近计数区的盖玻片边缘上。毛细作用使细胞悬液移到盖玻片下面，填满中央和边缘沟之间的区域。在盖玻片的另一边重复该操作； 5. 将计数器放于显微镜载物台上，移动载物台直到将三条平行线界定的25个小方格的网格位于中央为止。计25个小方格内的总细胞数（染色和未染色的）（它们每一个又再分为16个更小的方格便于计数）。为了避免将同一个细胞重复计数，只数三线隔开的压上线、左手线和中央区的细胞。如果细胞数大可用一个计数器； 6. 数完总细胞数时，在相同区域重复计数，只数蓝染（死）的细胞。计算死细胞的平均数，从总细胞数中扣除死细胞数得到活细胞数； 7. 应用以下公式计算细胞群的存活率： 存活率=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100% 8. 细胞悬液的细胞浓度按照一下方法计算： 1个大格（25个小格）的平均细胞数×104=细胞数/ml 9. 细胞悬液总细胞数=细
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密度阻滞法纯化人外周血单核细胞
作者：德尔塔 日期：2022-05-04
密度阻滞法纯化人外周血单核细胞 试剂和器材： 1. 抗凝血剂：100mmol/L 乙二胺四乙酸或38g/L柠檬酸钠； 2. Hepes缓冲生理盐水（HBS）：8.5g/L NaCl、10mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4； 3. 淋巴细胞分离液（例如LymphoprepTM或NycoPrepTM1.077）或OptiPrepTM，用Hepes缓冲生理盐水稀释（分别加入5倍体积和17倍体积）； 4. 台式低速离心机； 5. 巴斯德吸管（短型和长型）； 6. 5—10ml规格注射器和金属套管针； 实验方法： 1. 用乙二胺四乙酸（2mmol/L终浓度）或柠檬酸钠（38g/L终浓度）作为抗凝剂来收集静脉血； 2. 用等体积的Hepes缓冲生理盐水稀释血液，反复多次轻轻颠倒； 3. 用塑料巴斯德吸管，取6ml稀释过的血液加入到离心管中3ml的选定介质之上； 4. 20℃，以700g离心15min（LymphoprepTM）或700g离心20min（NycoPrepTM1.077或碘克沙醇溶液）； 5. 用缓慢减速程序或不制动的方法使转子减速； 6. 用巴斯德吸管在界面上收集细胞； 7. 用2倍体积的Hepes缓冲生理盐水稀释并且以200g—500g离心15min收集细胞；
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